Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Dichiarazione etica: Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Dichiarazione di Helsinki e sono stati approvati dal Comitato Etico Clinica presso l&#39;Università di Tübingen (progetti 38 / 2009B02 e 470 / 2013B02). 1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) <ol><li> Prendere 50-100 ml da un volontario sano tramite venipuntura utilizzando una siringa da 50 ml contenente 1.000 UI eparina solfato e diluire il sangue 1: 2 con PBS (pH = 7,2). </li><li> Strato cautela 35 ml di sangue: soluzione PBS soluzione separazione 15 ml di sangue come Biocoll (d = 1.077 g / ml) in un tubo da 50 ml. Centrifugare per 15 minuti a 800 xg a RT. NOTA: Il freno non deve essere utilizzato. </li><li> Raccogliere le cellule dello strato linfocitica con una pipetta e lavare le cellule due volte in almeno 50 ml di PBS (centrifuga per 12 min; a 400 xg). Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione con una pipetta. </li><li> Lyse restante eritrociti sospendendo e incubdall&#39;uso della frazione linfocitica con 1-5 ml di una soluzione tampone ipotonico per 2-4 min. NOTA: Durata dell&#39;esposizione e il volume di tampone di lisi dipendono dal tampone di lisi utilizzato e la quantità di globuli rossi lasciati nella frazione linfociti. </li><li> Diluire le cellule con PBS (1,10) e centrifugare a 250 xg per 12 min e poi risospendere e lavare il pellet cellulare una volta in 10 ml di PBS a 300 xg per 12 min. </li><li> Risospendere i linfociti in PBS e contare le cellule in una camera di Neubauer conteggio utilizzando Trypan blue soluzione. NOTA: Di solito,&gt; 1 x 10 8 linfociti vengono ricevuti da 100 ml appena disegnato sangue periferico. </li></ol> 2. Isolamento di Vδ1 cellule T <ol><li> Prendere &lt;1 x 10 6 linfociti isolati per un periodo iniziale di FACS che determinano la frequenza di cellule T CD4 Vδ1. NOTA: le dimensioni della popolazione di questa entità delle cellule T può variare notevolmente tra gli individui e secondo il loro stato immunologico. Typicalleato, circa l&#39;1% delle cellule T sono Vδ1 + e circa il 1-5% del + cellule Vδ1 sono CD4 +. <ol><li> Diluire le cellule con 1 ml FACS-buffer, che consiste di PBS contenente 2% di FCS e 5 mM EDTA. Centrifugare a 660 xg per 2 minuti e decantare il surnatante. Il volume reflusso di circa 100 microlitri tampone FACS è sufficiente per la successiva colorazione. Brevemente vortex e incubare le cellule con 5 ml Reagente Fc-Blocking per 5 minuti a temperatura ambiente per una maggiore specificità della colorazione FACS. </li><li> Aggiungere anticorpi umani monoclonali direttamente alle cellule senza rimuovere il reagente-Fc Blocking. Assicurati di macchiare le cellule con anticorpi contro Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) e TCRαβ (1,25). Preparare il controllo isotipico con i corrispondenti isotipo di immunoglobulina. Incubare le cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule in 1 ml FACS tampone (centrifugare per 2 minuti; a 660 xg), decantare il supernatant e procedere all&#39;acquisizione FACS nel volume buffer residuo. </li></ol></li><li> Pelletizzare cellule (che non vengono utilizzati nell&#39;analisi FACS) mediante centrifugazione per 12 min; a 300 g; 8 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il cellulare pelletin 60 microlitri MACS-tampone per 1 x 10 7 cellule. Aggiungere 20 ml Reattivo-Fc Blocco per 1 x 10 7 cellule e incubare per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 10 microlitri FITC-coniugato anticorpo anti-umano Vδ1 per 1 x 10 7 cellule direttamente alle cellule. Incubare per 12 minuti a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 14 ml MACS-buffer (centrifuga per 12 minuti; a 300 g; 8 ° C). Gettare il surnatante completamente e risospendere le cellule in 80 microlitri di buffer MACS per 1x10 7 cellule. </li><li> Prendere 1-2 x 10 5 cellule e diluirli in 100 microlitri di buffer FACS per la verifica dell&#39;etichettatura mediante analisi FACS. Nessun ulteriore additivi sono necessari per questa operazione. Assicurarsi che ci sia una suffidifferenza ciente di luminosità per Vδ1 - e le cellule Vδ1 +. Se questo non è il caso, ripetere i passaggi 2.3) e 2.4). </li><li> Aggiungere 20 microlitri microsfere anti-FITC per 1 x 10 7 cellule alle cellule rimanenti, mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C. Successivamente, lavare le cellule utilizzando almeno 10 ml MACS tampone (centrifuga per 12 minuti, a 300 xg; 8 ° C). </li><li> Durante la centrifugazione, equilibrare la colonna magnetica pre-raffreddata collocato in un magnete con tampone MACS 500 microlitri. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri MACS-buffer (per il numero di cellule superiore 1 x 10 8, scalare questo volume di conseguenza) e applicare le cellule con attenzione sulla colonna. Raccogliere il flow-through contiene il Vδ1 - cellule. </li><li> Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri MACS-buffer e raccogliere nuovamente il flusso continuo nello stesso tubo. Si noti che il serbatoio deve essere vuoto prima di applicare tampone sulla colonna. </li><li> Rimuovere la colonna dal dispositivo magnetico e posizionarlo in un tubo da 15 ml. Svuotare rapidamente la colonna con tampone 1 ml MACS con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna. Raccogliere l&#39;eluato in un tubo. NOTA: Per ottenere una purezza&gt; 98%, di solito è necessario ripetere i passaggi 2,7-2,9) con una seconda colonna. </li><li> Verificare la purezza delle cellule mediante analisi FACS 18 con lo stesso pannello di anticorpi come prima (vedi 2.1.2) e contare le cellule. </li></ol> 3. Isolamento di Vδ1CD4 + cellule T <ol><li> Risospendere 25 ml di CD4 perle con un vortice per&gt; 30 sec. Lavare le perline (la quantità minima come descritto dal produttore) in 1 ml di tampone di MACS in una provetta da 1,5 ml di reazione ponendo la provetta in un magnete per 1 min. Eliminare il surnatante con cura con una pipetta su piccola scala (200 ml) e risospendere le sfere nel volume originale di MACS-buffer. </li><li> Pelletizzare Vδ1 cellule + (centrifugare per 12 min; a 300 xg) e aspirare il surnatante e risospendere le cellule + Vδ1 in 500 microlitri MACS-buffer e aggiungerli alla provetta contenente le perline. Mescolare vigorosamente e incubare per 20 minuti a 4 ° C con costante inclinazione (esempio, in un rotatore). </li><li> Posizionare il tubo contenente le cellule in un magnete per 2 min. Assicurarsi che non ci siano residui nel coperchio. NOTA: cellule CD4 + sarà vincolato sfere magnetiche e allegare al lato del tubo rivolto verso il magnete. </li><li> Aprire con cautela il coperchio, mantenendo il tubo all&#39;interno del dispositivo magnetico e raccogliere il surnatante che contiene il CD4 - + cellule Vδ1 utilizzando una pipetta su piccola scala. Posizionare CD4 - + cellule Vδ1 in un tubo separato e collocare questo tubo nel magnete di nuovo per evitare possibilmente rimanendo cellule CD4 o perline da parte della popolazione. <ol><li> Lavare il CD4 - le cellule in 5 ml MACS-buffer (centrifuga per 12 minuti; a 300 xg) unand risospendere in una concentrazione di 1 x 10 5 cellule per 100 microlitri mezzi. CD4 - le cellule possono essere facilmente coltivate secondo le condizioni riportate di seguito (4.2). </li></ol></li><li> Posizionare il tubo con gli obiettivi di cellule CD4 + al di fuori del campo magnetico, sospendere nuovamente le cellule in 500 microlitri MACS-buffer e rimetterli nel dispositivo magnetico. Ripetere i passaggi 3,3-3,5 due volte per ottenere una maggiore purezza. Rimuovere il surnatante pipettando </li><li> Risospendere le cellule CD4 + in 100 ml di coltura (RPMI 1640, il 10% FCS, 1% di L-glutammina, 1% penicillina / streptomicina) e aggiungere 10 ml di una soluzione stallonatore. Incubare a temperatura ambiente per 45 min con inclinazione costante (ad esempio, in un rotatore). </li><li> Collocare le cellule in un magnete per 1 min. Raccogliere accuratamente il surnatante contenente Vδ1 cellule CD4 + + senza tallone con una pipetta su piccola scala. </li><li> Al di fuori del magnete, risospendere le sfere con i terreni di coltura 100 microlitri e ripeterepassi 3.6 e 3.7 due volte per ottenere il numero di cellule più alti di cellule CD4 +. </li><li> Pelletizzare le cellule (centrifugare a 300 xg per 12 minuti) ed eliminare completamente il surnatante pipettando. Risospendere le cellule in mezzi freschi, preriscaldata e contarli. Esaminare la purezza delle Vδ1 + CD4 + cellule mediante analisi FACS raffigurati nei passaggi 2.1.1-2.1.3. </li></ol> Clonazione 4. Single-cella limitata diluizione <ol><li> Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da un donatore allogenico come illustrato in 1,1-1,6. </li><li> Irradiare 2,5 x 10 7 PBMC allogenici con 80 Gy in 25 ml di coltura utilizzando γ-radiazioni. </li><li> Aggiungere IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) e PHA (2 mg / ml) per le cellule feeder irradiate e distribuirli in piastre da 96 pozzetti ad U, 5 x 10 4 alimentatore cellule in 50 pl per pozzetto. </li><li> Diluire le cellule Vδ1 + CD4 + a una concentrazione di 0,3 cellule per 50 ml. Dispensarete 50 microlitri della soluzione di cellule in ciascun pozzetto ospitare le cellule irradiate e citochine. NOTA: Così, le citochine sono diluiti alla concentrazione finale di 100 U / ml di IL-2, 10 ng / ml di IL-7 e 1 mg / ml PHA. Incubare le piastre a 96 pozzetti in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 atmosfera umidificata. <ol><li> Facoltativamente, coltivare rimanendo purificato + cellule CD4 + Vδ1 come la cultura di massa, alle stesse condizioni di coltura, come i cloni. </li></ol></li><li> Fornire le cellule ogni 3-4 giorni con citochine e mezzi freschi. Per questo, la metà scambio del mezzo nei pozzetti con 50 microlitri fresca media pipettando. Aggiungere la concentrazione di 2 volte di citochine a ogni integrazione. Aggiungere 5x10 4 cellule di alimentazione irradiati per bene ogni altro giro di alimentazione. </li><li> Utilizzando un microscopio, osservare primi cloni diventano visibili dopo 3-4 settimane, in quanto metabolizzano e quindi modificare il colore delle colonie di coltura e di forma. NOTA: per pelliccether coltivazione, risospendere i cloni bene e trasferire loro di separare piastre a 96 pozzetti. Analizzare le cellule tramite FACS, come indicato in 2.1.1-2.1.3. Cloni conservati in queste condizioni possono finalmente cambiare il loro TCR da Vδ1 a αβTCR. Il punto di tempo per questo transdifferenziazione varia da clone per clonare. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Per studiare il fenotipo, la biologia e la funzione di una scarsa (T) entità delle cellule, ovvero cellule Vδ1 + T CD4 +, abbiamo usato due marcatori: Vδ1 e CD4 per il suo isolamento positivo cella magnetica. Vδ1 è un recettore orfano, considerando CD4 è espresso sulle cellule T helper, ad un livello inferiore su monociti e cellule dendritiche, e ad un livello molto basso sulle cellule progenitrici ematopoietiche. Tecniche per l&#39;arricchimento e la selezione di celle a el...

Nei vertebrati, immunità adattativa che si struttura nel cellulare e una parte umorale di immunità svolge un ruolo importante nella difesa contro gli agenti patogeni. Il riconoscimento di una vasta gamma di antigeni è mediata da T- hyperpolymorphic e recettori cellulari B (TCR / BCR), che per quanto riguarda le cellule T sono assunti essere prodotta principalmente nel timo 1. A tale scopo, le cellule staminali ematopoietiche (CSE), derivate dal midollo osseo, il timo seme e differenziare lungo fasi ben definite finalmente danno origine a tutte le linee cellulari T. Thymus progenitori semina sono CD4 - e CD8 - e costituiscono quindi la frazione timocita immaturo, doppio negativo (DN). Segnali Thymus derivate poi inducono il loro impegno lignaggio e la differenziazione in cellule T αβ sia o γδ. L&#39;espressione di funzionalmente riarrangiati TCR-gamma e TCR-δ catena geni in DN2 / 3 timociti porta a γ δTCR complessi, che guidano la proliferazione cellulare und promuovere la differenziazione in cellule γ DT 2,3. Al contrario, il riarrangiamento di un funzionale catena TCR-β, che può accoppiarsi con preTα costruire una preTCR pT, induce il silenziamento trascrizionale della catena TCR-γ in timociti DN3 e il loro inserimento CD4 + CD8 + doppio positive timociti 4 . In questa fase, la ricombinazione della catena TCR-α si verifica, eliminando il locus TCR-δ che annida nel locus TCR-α, abrogando quindi la produzione di un γδTCR in queste cellule irrevocabilmente 5-9. ΑβTCRs riarrangiati sono successivamente selezionati per la loro capacità di legarsi auto-MHC debolmente (selezione positiva), che non può superare una certa soglia per evitare autoimmunità (selezione negativa). Secondo la loro capacità di I o II legame MHC di classe, le celle selezionate αβT si sviluppano in cellule singole positive CD4 + o CD8 +, che uscita il timo cellule T come naïve. Tuttavia, involuzione del timo inizia presto nella vita che porta a esponenzialmente ridotto la produzione di cellule T naive che è quasi estinta dopo l&#39;adolescenza 10. Tuttavia, la dimensione del pool di cellule T rimane costante per tutta la vita, che può essere spiegato solo in parte dal post-timica proliferazione omeostatica di cellule T e la proliferazione di lunga durata memoria immunologica 11. Di conseguenza, deve avvenire lo sviluppo extrathymic cellule T. La ricerca recente ha acquisito notevole attrazione che caratterizza progenitori delle cellule αβT che-a-extrathymic siti hanno dato origine alla αβ funzionale cellule T 12-17. Eppure, conoscenza dettagliata extrathymic precursori delle cellule αβT che indipendente da un timo differenziarsi in cellule αβT è frammentaria come i precedenti che abbiamo sulla rotta prendono così. Recentemente abbiamo identificato la piccola impresa a cellule T di Vδ1 + </sup&gt; CD4 + γδT come un extrathymic prognitor cella αβT 18, che una volta isolato dal sangue periferico di donatori umani sani possono transdifferenziarsi in cellule αβT in un ambiente infiammatorio lieve. È interessante notare che e contrario alla proliferazione omeostatica delle cellule T post-timo, transdifferenziazione di cellule CD4 + Vδ1 genera nuovi recettori delle cellule T, ampliando così la diversità repertorio, in modo che potenzialmente nuovi antigeni possono essere riconosciuti e può tutela dell&#39;ospite contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Questo aggiunge alla plasticità delle cellule T e aggiunge un nuovo percorso finora unappreciated per lo sviluppo delle cellule T extrathymic. L&#39;isolamento quantitativo da fonti linfocitari, la generazione di cloni unicellulari e la loro espansione efficiente sono essenziali per l&#39;obiettivo di individuare i marcatori e molecole che innescano questa cella αβT precursor`s sviluppo extrathymic.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Il timo, l&#39;organo principale per la generazione di cellule T αβ e spina dorsale del sistema immunitario adattativo in vertebrati, è stata a lungo considerata come unica fonte di cellule αβT. Eppure, involuzione timica inizia presto nella vita che porta ad un&#39;uscita drasticamente ridotto di cellule αβT naïve in periferia. Tuttavia, anche centenari possono costruire immunità contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Recenti ricerche suggeriscono lo sviluppo delle cellule αβT extrathymic, tuttavia la nostra comprensione dei percorsi che possono compensare la perdita della funzione timica sono ancora rudimentali. γδ cellule T sono linfociti innate che costituiscono il principale sottoinsieme cellule T nei tessuti. Recentemente abbiamo attribuito un finora incompreso importante funzione di un sottoinsieme delle cellule T γδ mostrando che la scarsa entità dei CD4 + Vδ1 + γδ cellule T possono transdifferenziarsi in cellule αβT in condizioni infiammatorie. Qui, si provide il protocollo per l&#39;isolamento di questo progenitrici da sangue periferico e la sua successiva coltivazione. Cellule Vδ1 sono positivamente arricchiti da PBMC di donatori umani sani utilizzando sfere magnetiche, seguita da una seconda fase in cui puntiamo la scarsa frazione di cellule CD4 + con un ulteriore tecnica di etichettatura magnetica. La forza magnetica del secondo nell&#39;etichettatura supera quello della prima etichetta magnetica, e quindi permette efficiente, quantitative e specifiche isolamento positivo della popolazione di interesse. Abbiamo poi introdurre la condizione tecnica e la cultura necessaria per la clonazione e in modo efficiente l&#39;espansione delle cellule e per l&#39;identificazione dei cloni generati mediante analisi FACS. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per la purificazione, la cultura e l&#39;espansione ex vivo di cellule CD4 + Vδ1 + γδ cellule T. Questa conoscenza è condizione indispensabile per gli studi che riguardano questo αβT progenitor`s biologico cellula e per coloro che mirano a identify i trigger molecolari che sono coinvolti nel suo transdifferenziamento.

La figura 1 illustra le diverse fasi e il risultato l&#39;isolamento delle cellule T Vδ1 da sangue periferico. La figura 1A mostra una tipica distribuzione di + cellule CD3 + Vδ1 in linfociti, così come l&#39;espressione co-recettore della popolazione Vδ1 +. In questo donatore, la frequenza di cellule Vδ1 + (rosso) è 2,3% del totale delle conta dei linfociti CD4 e l&#39;espressione (verde) di Vδ1 + linfociti è del 2,6%. Comp...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K Views.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Video: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Ricerca sul cancro

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Studio della calcificazione della valvola aortica tramite isolamento e coltura di linfociti T utilizzando cellule feeder da Buffy Coat irradiato

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica di imaging ad alta risoluzione per la rilevazione di microdomini Ca2+ nelle cellule T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Svelare l'attivazione iniziale della risposta immunitaria adattativa per l'intervento terapeutico

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imaging iniziale di microdomini Ca2+ in cellule T primarie

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Isolamento e

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Mouse Naïve CD4

Razionalizzato isolamento di singole cellule TCR e generazione di vettori retrovirali per In Vitro e In Vivo l'espressione del TCR umano

Studio della calcificazione della valvola aortica tramite isolamento e coltura di linfociti T utilizzando cellule feeder da Buffy Coat irradiato

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie

Imaging iniziale di microdomini Ca²⁺ in cellule T primarie