Bu çalışmada JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ ve Robert ve Janice McNair Vakfı tarafından finanse edildi.
Biz Sandra Pena ve Andrene McDonald hasta işe alım, Samuel Blum için teknik destek, Dr George Makedonas antikorlar ve kontrol DNA PCR optimizasyonu için kullanılan hediye için teşekkür ederim.

1. ilgi T hücre nüfusu tanımlamak.
 Not: antijen belirli hücre bölünmesi boya (gibi Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) ile birlikte nükleer silahların yayılmasına karşı-ebilmek var olmak kullanılmış-T hücreleri izole etmek için onların nükleer silahların yayılmasına karşı yanıt olarak antijenik stimülasyon dayalı. PBMCs başlayan, 7 günlük vitro genişleme bir antijen belirli CFSE düşük nüfus 12 tanımlamak için yeterli olmalıdır.
<ol><li>Mix PBMCs besleyici MHC eşlemeli hücreleri ve etiket 5 µM CFSE hücre bölünmesi boya ile 1:1.</li>
	<li>Plaka 2-2,5 x 10 5 hücre başına iyi bir 96-şey yuvarlak-alt plaka 200 µL % 10 FCS tam RPMI medya kültür. 
	Not: Tam RPMI içeren 2 mM l-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 µM MEM önemli olmayan amino asitler, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 2-mercaptoethanol birimleri, 100 U mL &#8722; 1 penisilin ve 100 µg mL &#8722; 1 streptomisin.</li>
	<li>Teşvik hücreleri 25 µM peptid antijen ile.</li>
	<li>Kültür dördüncü gününde dikkatle kaldırın ve medya 100 µL değiştirin. 
	Not: Peptit-HLA tetramers 13 kullanımı antijen spesifik T hücre kimliği için daha uygun bir yaklaşımdır. Tetramer boyama sağlar antijen özgüllük gibi HLA-kısıtlama eşzamanlı değerlendirilmesi için.</li>
</ol> 2. Tek hücre sıralama ayarlayın.
<ol><li>Perform tüm yordamları bir başlık veya belirlenmiş bir alanda güçlendirilmiş şablon / ücretsiz. Aliquot, kontaminasyon reaktifleri temiz tüm çalışma yüzeyleri ve mümkünse, ekipman % 10 ile çamaşır suyu önce PCR Kur. Filtre ipuçları, RNAse ve Dnaz ücretsiz reaktifler ve plastik PCR ve adımları klonlama vektör kullanın. Anahtar reaktifler Malzemeler tablo bulundu. 
	Not: Çoklu PCR reaksiyon son derece duyarlıdır ve kirlenme seviyesinin düşük güçlendirilmiş üründe neden olur.</li>
	<li>Generate 10 x RT tepki birleştirerek ters transkripsiyon ana mix tampon, 25 X DNTPs, 9 U RT enzim, % 0,01 Triton-X, 0.7 U RNAse inhibitörü ve 383 nM (Tablo 1 ' de listelenen) her RT-TCR astar steril pipetting Reservoir. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için her 96-şey plaka için 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için yeterli ana karışımını oluşturur. Reaksiyon bileşenleri ve iyi başına tutarları için bkz: Tablo 2.</li>
	<li>Hazırlama bir 96-şey PCR koleksiyon plaka hücre başına iyi bir çok kanallı pipet ile ters transkripsiyon ana karışımı pipetting 6 µL sıralama için. Plaka buz veya soğuk bir blok içinde devam.</li>
	<li>Etiket (örneğin, CD4 ve CD3, veya CD8 ve CD3, her biri 2 µg/mL, hücre bölünmesi boya veya boyama tetramer) yüzey işaretleyicileri hücre için antikorlar içeren hücreleri.</li>
	<li>Bir sıralama T hücreleri hücre başına iyi, bir negatif kontrol görev yapacak on ikinci satır atlanıyor. 
	Not: Sıralama verimliliğini kesin toplama plaka hizalama plaka sahibi gibi hücreleri ve plakaları cDNA reaksiyon önce düşük ısıda muhafaza içinde bağlı olacaktır. Koleksiyon tabakları buz üzerinde her zaman, dışında onlar içinde soğutma plaka tamir ederken, sıralama sırasında tutulmalıdır. Tüm sorters bir sıcaklık düzenlenmiş plaka sahibi ile donatılmıştır; Ancak, bir kullanımı önerilir. Sıralama genellikle yaklaşık 10-15 dk plaka başına alır bu yana, olup olmadığını RNA bozulması için artan bir potansiyel plaka bir düşük sıcaklıkta korunmaz.</li>
	<li>Pozitif bir denetim olarak hücreleri (100 hücreleri) daha çok sayıda el ile bir pipet ile kuyuları için bu aşamada ekleyin. Alternatif olarak, daha önce izole RNA havuza alınan hücrelerden bir olumlu denetim 10, kullanılabilir ng iyi başına. 
	Not: saf denetim RNA hassasiyetle pipet ve Çapraz bulaşma diğer wells ve yanlış pozitif sonuçlar önlemek için dikkat.</li>
	<li>Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te ° C.</li>
	<li>Hemen uyarlamak RNA cDNA için 25 ° c 10 dk, 37 ° C için 45 dk, plaka kuluçka ve 10 dk. 85 ° C 
	Not: verimli PCR reaksiyon emin olmak için ilk PCR reaksiyon aynı gün yapılması önerilir. Alternatif olarak, kopya etmek plakaları-80 ° C'de 2 aya kadar tutulabilir.</li>
</ol> 3. Multiplex iç içe PCR gerçekleştirmek Not: tüm ana karıştırır kirlenmesini önlemek için bir temiz ücretsiz şablon alanda hazırlayın.
<ol><li>Sulandırmak her değişken bölge astar Dnaz ve RNAse free H 2 O. ile 100 µM Daha sonra her birinin V-Alfa astar havuzu oluşturmak için 44 astar 20 µL birleştirin. Astar havuzu V-beta oluşturmak için her biri 40 V-beta astar artı 80 µL Dnaz ve RNAse free H 2 O. dizileri Tablo 1 ' de listelenen astar 20 µL birleştirir. Havuza alınmış bir kez her astar karışımında 2.3 µM bölgedir.</li>
	<li>Sabit bölge astar Dnaz 100 µM hisse senedi çözüm için sulandırmak ve RNAse free H 2 O. Dilute 10 µM çalışma çözüm ve aliquot kullanılmak için sabit bölge astar.</li>
	<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta amplifikasyon için hazır olun. 5 X birleştirerek ana karışımları oluşturmak tampon, 80 µM dNTPs, % 3 DMSO, 2 µM astar Havuzu (46 son konsantrasyonu nM her astar için), 200 nM TCR-sabit bölge ters astar, 1 U DNA polimeraz ve Dnaz ve RNAse free H 2 O (Tablo 2 ). Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
	Not: Son şey, nerede 22.5 µL ana PCR karışımı 2.5 µL cDNA şablonu ile birleştirilmiştir başına 25 µL PCR hacmi hesaplamaları dayanır.</li>
	<li>Plaka cDNA buz veya soğuk bir blok ile tutun. Bir çok kanallı TCR-beta tepki yeni bir 96-şey PCR tabak içine 22.5 µL pipet için kullanın. Sonra cDNA 2.5 µL PCR plaka aktarmak için bir çok kanallı kullanın.</li>
	<li>Bir çok kanallı TCR-Alfa tepki içine doğrudan cDNA kalan içeren plaka 22.5 µL pipet kullanın.</li>
	<li>Yapıştırıcı, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te plakalarının ° C.</li>
	<li>Multiplex PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 54 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
	<li>Taşıma 25 son bir hacim içinde iç içe geçmiş PCR reaksiyon dışarı µL, multiplex PCR karışımı 2.5 µL şablon olarak kullanarak.
	<ol><li>İle Dnaz ve RNAse free H 2 O. olun 10 µM aliquots çalışan hisse senedi için 100 µM için iç ve adaptör astar reconstitute.</li>
		<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta ampl için hazırlanın.ification. Mix 5 X arabellek, 25 X DNTP, % 3 DMSO, 200 nM ileri adaptör astar, 200 nM ters iç içe astar, 1 U DNA polimeraz ve DNA polimeraz ve nükleaz ücretsiz H 2 O 22.5 µL (Tablo 2) son bir birim için. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
		Not: ikinci PCR reaksiyon kullanımda 5 X PCR tampon yükleme özel jel kolaylaştırmak için içeren yükleme boya.</li>
		<li>Bir çok kanallı, kullanarak ana karışımları iyi başına 22,5 µL adlı TCR-Alfa ve TCR-beta tepkiler iki yeni 96-şey PCR tabak içine pipette.</li>
		<li>Şey başına 2.5 µL, multiplex PCR reaksiyon şablonu ekleyin. 
		Not: Kalan ilk PCR reaksiyon gereken mühürlü ve gerekli olursa ek şablon, bir kaynağı olarak hizmet için-20 ° C'de depolanan (4.3 Not adım bkz:).</li>
		<li>Plakaları, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te mühür ° C.</li>
		<li>İç içe geçmiş PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 56 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
		<li>Çalıştırmak 5 µL % 1 özel olarak tepki son jel içeren etidyum bromür (negatif ve pozitif kontrol wells de dahil olmak üzere). 
		Not: Beklenen grup yaklaşık 500 bp boyutunda çalıştırmalısınız. Şekil 2 ' deki bir örnek tepki.</li>
		<li>Bir 96-şey biçimi PCR arıtma seti kullanarak ikinci reaksiyon (20 µL) kalan arındırmak, 70 ° C H 2 O şey başına 15 µL ile elute ve Sanger gerçekleştirmek sıralama. (Tablo 1) sıralama için uygun TCR-alfa veya TCR-beta adaptör ileri astar kullanın. 
		Not: Dizileri online kullanılabilir immunogenetics yazılımı ile çözümlenebilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. PCR zincirleri Alfa ve beta alt klonlama.
 Not: ilk tepki olarak kullanılan ileri astar ve ikinci PCR reaksiyon geriye doğru astar havuzu kısıtlama siteleri birleştirmek için kullanılır. Bu nedenle, elde edilen alpha ve beta zinciri PCR ürünleri sırayla alt şablon retroviral vektör ( şekil 1) klonlanmış olmaya hazır mısınız.
Belgili tanımlık beta Urun <ol><li>Özet arıtılmış PCR iç içe tepki ile BstbI ve MfeI (Tablo 3). 
	Not: 5 µg Ekle aşmamaktadır.</li>
	<li>Paralel olarak, BstbI ve MfeI (Tablo 3) ile şablon vektör sindirmek. 1-2 µg şablon vektörünün TCR başına kullanın. Üzerinde bir özel jel sindirilir vektör çalıştırmak ve daha büyük grup (~ 7500 bp) yalıtır. Bir jel DNA arıtma kiti ile vektör arındırmak. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-beta değişken bölge, insan TCR-beta değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Arındırmak PCR arıtma kiti kullanılarak sindirilir PCR ürünleri. 
	Not: kit ile birlikte sütunları DNA arıtma kapasitesine doğrulayın; birden fazla sütun kullanın. Arıtılmış ekleme başarılı tüp ligasyonu reaksiyon için gerekli minimum meblağ 50 dır 10 ng/µL en az bir konsantrasyon, ng. Arıtılmış Ekle tutar için başarılı bir ligasyonu yeterli değilse, ikinci PCR reaksiyon tekrar edilebilir.</li>
	<li>37 ° C'de ısı inactivation 75 10 dk ardından kendini ligasyonu önlemek için şablon vektör 1 h için 10 U CIP enzim ile tedavi ° C. arındırmak DNA ile bir PCR arıtma Kiti (Tablo 3).</li>
	<li>Ligate TCR-beta takın ve oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak vektör. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Super En iyi suyu Catabolite bastırma (S.O.C.) orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Beta zincirinin başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri BstbI ve MfeI ile onaylayın. Bir 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 X enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra IRES ters astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-beta bölümü.</li>
	<li>Sıra onay TCR-beta ucun takip Alfa değişken bölge ekleme için benzer işlemler gerçekleştirmek. Alfa iç içe tepki ve SnaBI ve SacII ile vektör içeren yeni oluşturulan TCR-beta INSERT arıtılmış PCR Urun sindirmek. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-Alfa değişken bölge, insan TCR-Alfa değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Ligate Alfa ekler içine oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak karşılık beta değişken bölge kodlaması TCR vektörel çizimler. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL S.O.C. için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Alfa zinciri başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri SnaBI ve SacII ile onaylayın. 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 x enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra MSCV2 ileri astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-alfa bölümünü.</li>
	<li>Alfa zinciri sıra doğrulandıktan sonra sıralama ile TCR-beta-ters ve IRES mütedavil astar (Tablo 1) tarafından tam TCR Ekle doğrulayın.</li>
</ol> 5. TCR hücre yüzey ifade ve özgüllük doğrulayın.
 Not: HEK293T hücreleri başarılı TCR zincir PARI sınamak için kullanılırNG ve hücre ifade ( şekil 3A) 8 yüzey. Peptid-MHC tetramer boyama da gerçekleştirilebilir antijenik özgüllük yazı TCR gen yalıtımı ( şekil 3B) saklamak için test etmek için transfected HEK293T hücrelerde.
<ol><li>Plaka dışarı HEK293T hücreler 12-iyi doku kültürü plakaları, 1 mL tam DMEM medya içeren % 5 FCS kuyuda başına 1 x 10 5 hücre ve kültür gecede at 37 ° C. plaka ayrı wells her yeni TCR için tanımladığınız için yeterince hücre dışarı , denetim şablonu TCR vektör, CD3 vektör sadece, kontrol TCR vektör tek ve bir transfected de. 
	Not: Transfection bir şablonla tam olarak fare TCR vektör (mTCR-pMIA) kombinasyonu ile mCD3εγδζ-pMIG vektör, vektör yalnız, mTCR-pMIA ve mCD3εγδζ-pMIG vektör yalnız pozitif ve negatif denetimler kullanılır. 
	Not: Tam DMEM 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate, 100 µM içerir Sigara-esansiyel Amino asitler, 5 mM HEPES tampon, 5,5 x 10 -5 ünite 2-mercaptoethanol, 100 U/ml penisilin/streptomisin.</li>
	<li>Ertesi gün 1 µg chimeric h/mTCR-pMIA vektör, 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör ve üretici talimatları lipozom tabanlı transfection reaktif hücrelerle transfect.</li>
	<li>Her TCR için 6 µL transfection reaktif 100 µL oda sıcaklığına, serum-Alerjik DMEM ekleyin. Kısaca girdap ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Ayrı 1,5 mL tüpler TCR-pMIA vektör 1 µg 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör veya denetimler için ayrı her vektör 1 µg birleştirin.</li>
	<li>Dropwise, vektör DNA içeren tüpler transfection reaktif/DMEM çözüm ekleyin. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Dropwise, HEK293T hücrelere transfection reaktif/DMEM/DNA çözüm ekleyin. Yavaşça karıştırın için plaka dokunun. 24 h için 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Sonra 24 h ortamı, değiştirin ve hücreler kültür ek 24 h için tutmak</li>
	<li>Kaldırmak hücreleri plaka dinç pipetting tarafından ve anti-fare CD3 antikor (2,5 µg/mL) Akış Sitometresi tarafından chimeric TCR yüzey ifade doğrulamak için hücrelerle leke.</li>
	CD3 ifade benzer bir seviyeye transfected hücreler arasında karşılaştırmak için <li>kapı hücreleri floresan muhabir molekülleri (CD3 kompleksinin için GFP ve Ametrine TCR ifade vektör için) benzer yüksek düzeyde ifade analiz. En iyi şekilde, analiz geçişli GFP + Ametrine + 10 içindeki hücreleri 4 ' e 10 5 floresan yoğunluğu ( şekil 3A). 
	Not: Sahip chimeric yapı transfected hücrelerin CD3 ifade düzeyini kontrol fare (özgün şablon) vektör ( şekil 3A) yakın olabilir. Oluşturulan TCR retroviral vektörler vivo içinde ifade sistemleri ile uyumlu yukarıda açıklanan 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision.">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li><li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+fate+and+intense+debate:+myths,+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice.">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li><li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+naive+CD4++T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection.">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li><li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice.">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li><li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated,+cell-autonomous+event.">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li><li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice.">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li><li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days.">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+retrogenic+mice:+a+rapid,+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice.">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity.">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli protokol tek hücre TCR amplifikasyon ve sonraki eşleştirilmiş TCR alpha ve beta zincirleri bir şablon retroviral ifade vektör alt klonlama için verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Her ne kadar bazı tek hücre PCR protokollerine geliştirilmiştir, hiçbiri defa hemen bir ifade vektör alt klonlama ile uyumlu olması. Çoğu durumda, son derece değişken CDR3 bölgeleri kapsayan bir kısmi sıra, değişken bölge ulaşmak için yeterli sırası ile güçlendirilmiş. Bu daha küçük PCR ürün boyu...

T hücre reseptör (TCR) T hücre kaderi karar geliştirme, kararlı duruma/homeostazı ve çevre1,2,3' te antijenik stimülasyon sırasında belirler. Son teknolojileri sıralama derin genişlemesi antijen belirli T hücre yanıt içinde daha önce değersiz bir TCR çeşitlilik ortaya çıkardı. TCR çeşitlilik işlevsel olarak geniş T hücre yanıt için bir potansiyel göstermektedir. TCR dizi repertuar analizi TCR fonksiyonel deneyleri ile entegrasyon için sıralama yaklaşımlar deneysel sistemleri ve seçin sonraki fonksiyonel analiz için kullanılan vivo içinde modelleri ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır TCRs. Biz insan TCR sıra izolasyonu için etkili bir yaklaşım geliştirdik ve TCR ifade HLA insanlaşmış fareler4ile uyumlu bir chimeric insan/fare TCR şablon vektör içine alt klonlama aerodinamik. Heterodimeric TCRs karşılık gelen alpha ve beta zincirleri yalıtımı PCR güçlendirme tek bir hücreden her iki zincirlerinin gerektirir. Rağmen birkaç tek hücreli TCR klonlama protokol geliştirilen ve kullanılan, hiçbiri defa kolayca yüksek üretilen iş kolaylaştırılmış doğrudan bilinmeyen Vα/Vβ TCRs retroviral vektörler yeniden ifade için içinde vivo gerekli içine klonlama ile uyumlu olması 4,5,6,7. Önceki çalışmalarda iki ana yaklaşım, ya seçerek sıra tahmin veya tüm TCR sıra4,5,6 yükseltmek için yeterli TCR sınırlı bir bölümünü yükseltmek için kullanılan , 7. ilk yaklaşım elde edilen TCR sıralarının aşağı akım fonksiyonel analiz gerektirir pahalı silico montaj ve de novo inşaat TCR. İkinci yaklaşım tam TCR sıra sağlamasına karşın, insan sabit bölge fare modellerinde klonlanmış TCRs vivo içinde ifade ile uyumlu değildir. Yaklaşımımız TCRs in vivo fare modelleri fonksiyonel analiz ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Bir verimli ve rahat tek hücre doğrudan PCR parçalarının şablon ifade vektör alt klonlama için sağlar PCR Protokolü geliştirdik.
Bizim yaklaşım iki adımda gerçekleştirilen bir son derece hassas multiplex iç içe PCR reaksiyon kullanır. İlk multiplex tepki adım 40 astar V-beta zincirler için belirli bir havuz ve 44 astar tüm V-Alfa zincirleri TCR-alfa veya TCR-beta (Tablo 1) serisi ön bilgi olmadan yükseltmek için kullanılan belirli bir havuz. İleri astar 5' PCR ürününün dahil bir adaptör sırası vardır. Ters astar TCR sabit bölge üzerinde temel alır. Biz belirledik benzersiz kısıtlama siteleri yok insan değişken veya kavşak TCR bölgeler ve bunlar yeni redesigned TCRα ve TCRβ astar (şekil 1) içine dahil. İkinci iç içe geçmiş tepki olarak bir astar olarak adaptörü sırası için belirli ve sürekli bölgesi içinde iç içe geçmiş bir ters astar daha da artan özgüllük ile (Tablo 1, şekil 1) TCR zincir yükseltmek için kullanılır. Tek hücre izolasyon sonra iki PCR yuvarlar (ilk tepki Vα ve Vβ astar havuzu olan ve ikinci adaptör astar ile) neden doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlanmış bir PCR ürünü olup. Son TCR yapı, bir tek açık okuma çerçevesi (ORF), 'kendi kendine sıyırmada' protein sırayla bağlı fare sürekli bölgeleri ile birlikte insan değişken bölgeler içinde kodlar P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sırası birden çok sistemlerinde kullanılan ve TCRs8,9,10,11Ifade özellikle kapsamlı olarak sınanmıştır. Her ne kadar sonra çeviri P2A sıra kalır çoğu bağlı için C-terminus beta zinciri sinyal sıra ek bir prolin, bu değişiklik ise esnek bir bağlayıcı tarafından bağlı Alfa zincirinin TCR işlevi üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Fare sürekli bölgesi insan yerine yapısında sinyal akış yönündeki bileşenlere ile potansiyel değişmiş etkileşimleri önlemek için kullanılır ne zaman fare hücrelerinde yeniden dile getirdi. Tek ORF alpha ve beta zincirleri9,11stokiometrik ayrı ifade neden olur. Geçerli protokol reaktifler ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar dayanmaktadır ve aerodinamik ve verimli bir şekilde yapılması için tasarlanmıştır. Biz özellikle otoimmün diyabet karıştığı self-reactive T hücrelerden TCRs tahlil için bu tekniği kullanmış olsa da, biz bu protokolü kimlik ve insan TCRs için belirli bir işlevsel değerlendirme için yaygın olarak uygulanabilir olabilir tahmin Otoimmün epitopları, kanser epitopları veya yanıt patojenlerin ve aşılar.

<table><tbody><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>eBioscience&amp;nbsp;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-human CD4 (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-mouse CD3 AF647</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100322</td><td>2.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>4368814</td><td>9 U (RT enzyme)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymerase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Well Half Skirt PCR Plate</td><td>Phenix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&amp;nbsp;</td><td>Invirtogen&amp;nbsp;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vector)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vector)</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Quick ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps DNA purification systems&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean &amp;amp; concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean &amp;amp; concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td><td>Mirus&amp;nbsp;</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II (sorter)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (flow cytometer)</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

Sıralama eşleştirilmiş T hücre reseptör (TCR) Alfa ve beta zincirleri tek T hücrelerden için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen hiçbiri defa TCR heterodimers aşağı akım için elverişli vivo içinde fonksiyonel analiz edilmiştir. Biz neden olan bir insan TCR alpha ve beta zincirleri değişken bölgeleri kapsayan bir PCR ürünü bir iki adım multiplex iç içe PCR, dayalı gelişmiş bir iletişim kuralı geliştirdik. Benzersiz kısıtlama siteleri tanımlama ve onları PCR astar birleşmeyle, PCR ürünü doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlama ile uyumlu yaptık. Elde edilen retroviral yapı chimeric insan/fare TCR fare hücreleri veya vivo içinde fare modelleri fonksiyonel bir fare hücre içi etki ile kodlar. Genel olarak, burada açıklanan protokol eşleştirilmiş insan tek hücre TCR alpha ve beta zinciri kimlik retroviral vektörler kolayca uyarlanabilir aerodinamik nesil vitro ve in vivo TCR ifade ile birleştirir. Böylece kritik adımları takip ve potansiyel tuzaklar kaçınılmalıdır olabilir video ve eşlik eden malzeme tek hücre PCR, son derece ayrıntılı bir tanımını vermek için tasarlanmıştır. Ayrıca, biz klonlama ifade vektör oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Kez hakim, tüm prosedürü tek hücreden TCR ifade için sıralama kısa bir iki haftalık süre içinde gerçekleştirilebilir.

Multiplex iç içe PCR reaksiyon verimliliğini adım 3.2.7 (Şekil 2) bir özel jel ikinci reaksiyon 5µL çalıştırarak kontrol edilir. Ortalama TCR-beta amplifikasyon verimliliğini TCR-Alfa tepki verimliliğini yaklaşık %50 genellikle düşük ise yaklaşık % 80, olması bekleniyor4. Sadece eşlenmiş zincirleri TCR-Alfa ve TCR-beta-ebilmek var olmak kullanılmış için TCR ifade; Ancak, tüm PCR ürünleri TCR sıra ve reper...

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.4K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Video: Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Sinjeneik Modellerde Fare CAR-T Hücre Üretimi için Kolaylaştırılmış Protokol

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological malignancies and are presently undergoing development for the treatment of diverse solid tumors. So far, the preliminary evaluation of novel CAR-T cell products has predominantly taken place in xenograft tumor models using immunodeficient mice. This approach is chosen to facilitate the successful engraftment of human CAR-T cells in the experimental setting. However, syngeneic mouse models, in which tumors and CAR-T cells are derived from the same mouse strain, allow evaluation of new CAR technologies in the context of a functional immune system and comprehensive tumor microenvironment (TME). The protocol described here aims to streamline the process of mouse CAR-T cell generation by presenting standardized methods for retroviral transduction and ex vivo T cell culture. The methods described in this protocol can be applied to other CAR constructs beyond the ones used in this study to enable routine evaluation of new CAR technologies in immune-competent systems.

Yazar Spotlight: Sinjeneik Tümör Modellerinde CAR-T Hücre Fonksiyonunun Geliştirilmesi 

This protocol streamlines retroviral vector production and murine T cell transduction, facilitating the efficient generation of mouse CAR-T cells.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Engineered cell therapies utilizing chimeric antigen receptor (CAR)-T cells have achieved remarkable effectiveness in individuals with hematological ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Th17 Farklılaşmasında Gen Düzenleme için Kılavuz RNA'nın Retroviral Transdüksiyonu

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Yaratma

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi