Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

倫理文：すべての手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施し、テュービンゲン大学で臨床倫理委員会によって承認された（38 / 2009B02と470 / 2013B02プロジェクト）。 末梢血単核細胞（PBMC）の単離1。 <ol><li>千IUのヘパリン硫酸を含む50 mlシリンジを使用して静脈穿刺を介し健常者50〜100ミリリットルを取り、血液1希釈：PBS（pH値= 7.2）と2。 </li><li> 15ミリリットルの血液分離ソリューションのPBS溶液などBiocollとして（D = 1.077グラム/ ml）を50ml中の円錐管：慎重に血液35mlのレイヤ。室温で800×gで15分間遠心します。 注：ブレーキを使用することはできません。 </li><li>ピペットでリンパ球層の細胞を収集し、少なくとも50 mlのPBSで細胞を2回洗浄（; 400×gで12分間遠心分離）。ピペットで遠心分離後、上清を取り除きます。 </li><li>溶解残り懸濁させることによって赤血球およびincub2-4分間低張緩衝液1-5 mlのリンパ球画分をレーティング。 注：溶解緩衝液の曝露とボリュームの持続時間は、使用される溶解バッファーにし、リンパ球画分に残った赤血球の量に依存します。 </li><li> 12分間2​​50×gでPBS（1:10）、遠心分離で細胞を希釈し、その後12分間300×gで一回10mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、洗います。 </li><li> PBS中のリンパ球を再懸濁し、トリパンブルー溶液を使用して、ノイバウアーカウントチャンバー内の細胞をカウントします。 注：通常、&gt; 1×10 8のリンパ球を新たに末梢血を集めて100ミリリットルから受信されます。 </li></ol> Vδ1T細胞の単離2。 <ol><li> &lt;Vδ1CD4 T細胞の頻度を決定する最初のFACSのための1×10 6単離したリンパ球を取ります。 注：このT細胞の実体の人口規模は、個人とその免疫学的状態に応じ間で大きく異なる可能性があります。 Typic味方、T細胞の約1％がVδ1+であり、Vδ1+細胞の約1-5％がCD4 +です。 <ol><li> PBS、2％FCSおよび5mM EDTAを含んで構成され、1mLのFACS緩衝液で細胞を希釈します。 2分間660×gで遠心分離し、上清をデカント。約100μlのFACS緩衝液の還流量は、その後の染色のために十分です。簡単に言うと渦とFACS染色の特異性を増大させるために室温で5分間、5μlのFcをブロッキング試薬で細胞を培養します。 </li><li> Fcブロッキング試薬を除去することなく、細胞に直接ヒトモノクローナル抗体を追加します。 （1：200）、CD8（1：200）とTCRαβ（1：25）Vδ1（1時50分）、CD3（1時50分）、CD4に対する抗体で細胞を染色することを確認します。対応する免疫グロブリンアイソタイプとアイソタイプコントロールを準備します。暗所で4℃で20分間、抗体と細胞をインキュベートします。 </li><li> （2分間遠心分離; 660×gにて）を1mlのFACS緩衝液中で細胞を洗浄し、supernをデカントatant、残りのバッファ量にFACS取得に進みます。 </li></ol></li><li> 12分間の遠心分離（FACS分析に使用されていない）細胞をペレット化します。 300 gで。 8℃。上清を除去し、1×10 7個の細胞あたり60μlのMACSバッファーpelletin細胞を再懸濁します。 1×10 7個の細胞あたり20μlのFcをブロッキング試薬を加え、4℃で5分間インキュベートします。 </li><li>細胞に直接1×10 7個の細胞あたり10μlのFITC結合抗ヒトVδ1抗体を追加します。暗闇の中で4℃で12分間インキュベートします。 </li><li> 14ミリリットルMACSバッファー（; 300グラムで、8℃12分間遠心分離器）を用いて細胞を洗浄します。完全に上澄みを捨て、1×10 7個の細胞あたり80μlのMACS緩衝液で細胞を再懸濁します。 </li><li> 1-2×10 5個の細胞を取り、FACS分析により標識の検証のために、100μlのFACS緩衝液でそれらを希釈します。さらなる添加剤は、このステップのために必要とされていません。 suffiがあることを確認してくださいcientのVδ1のための明るさの違い-とVδ1+細胞 。そうでない場合は、繰り返し）は2.3）と2.4を繰り返します。 </li><li>残りのセルに1×10 7細胞あたり20μlの抗FITCマイクロビーズを加え、よく混ぜ、4℃で暗所で15分間インキュベートします。その後、（300×gで、12分間の遠心分離; 8°C）を少なくとも10ミリリットルのMACS緩衝液を用いて細胞を洗浄します。 </li><li>遠心分離の間に、500μlのMACS緩衝液で磁石に配置された予備冷却磁気カラムを平衡化。 </li><li> （1×10 8よりも高い細胞数のために、それに応じてこのボリュームをスケールアップ）500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、カラムに慎重に細胞を適用します。細胞- Vδ1を含むフロースルーを収集します。 </li><li> 500μlのMACS緩衝液でカラムを3回洗浄し、同じチューブに再びフロースルーを収集します。リザーバーはカラム上にバッファを適用する前に、空でなければならないことに注意してください。 </li><li>磁気デバイスから列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブにそれを置きます。すばやくしっかりと列にプランジャーを押して1ミリリットルMACS緩衝液でカラムを洗浄します。チューブに溶出液を収集します。 注：&gt; 98％の純度を得るためには、第二列を含むステップ2.7から2.9）を繰り返すことが通常必要です。 </li><li>前と同じ抗体パネルとのFACS分析18によって細胞の純度を確認します（2.1.2を参照）、細胞をカウントします。 </li></ol> Vδ1CD4+ T細胞の単離3 <ol><li> &gt; 30秒間ボルテックスでCD4ビーズ25μlの再懸濁します。 1分間磁石にチューブを配置することにより、1.5 mlの反応チューブに1 mlのMACS緩衝液でビーズ（製造業者によって示されるように最小量）を洗浄します。小規模ピペット（200μL）で慎重に上清を廃棄し、MACSバッファーの元のボリュームにビーズを再懸濁します。 </li><li> 1Vδ1+細胞 （遠心分離をペレット化2分; 300×gで）し、上清を吸引し、500μlのMACSバッファー内のすべてのVδ1+細胞を再懸濁し、ビーズを含むチューブに追加します。勢いよく混合し、（回転子に、例えば ）一定の傾斜で4℃で20分間インキュベートします。 </li><li> 2分間磁石に細胞を含有するチューブを置きます。蓋には名残がないことを確認してください。 注：CD4 +細胞は、磁気ビーズを結合させ、磁石が直面しているチューブの側面に取り付けられています。 </li><li>慎重に、磁気装置内チューブを保持しながら、蓋を開け、CD4含ま上清を収集-小規模のピペットを用いてVδ1+細胞。別のチューブにVδ1+細胞および集団から、おそらく残りのCD4細胞またはビーズを避けるために、再び磁石にこのチューブを置く- CD4を置きます。 <ol><li> CD4を洗う- 5ミリリットルMACS緩衝液中で細胞（12分間遠心; 300×gで）AND100μlの培地あたり1×10 5細胞の濃度で再懸濁します。 CD4 -細胞が容易に（4.2）の下に与えられた条件下で培養することができます。 </li></ol></li><li> 500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、磁気デバイスに戻し入れ、磁場の外CD4 + 細胞標的にチューブを置きます。繰り返しは、より高い純度を得るために二度3.3から3.5を繰り返します。ピペットで上清を除去</li><li> 100μlの培養培地中のCD4 +細胞（RPMI 1640、10％FCS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）に再懸濁し、ビーズ取り外し溶液10μlを加えます。一定の傾斜（例えば、回転体で）と室温で45分間インキュベートします。 </li><li> 1分間磁石に細胞を配置します。注意深く小規模ピペットを用いてビーズを含まないVδ1+ CD4 +細胞を含む上清を収集します。 </li><li>磁石の外では、100μlの培地を繰り返してビーズを再懸濁CD4 +細胞の高い細胞数を得るために、3.6倍及び3.7ステップ。 </li><li>細胞をペレット化する（12分間、300×gで遠心分離）し、ピペッティングにより完全に上清を捨てます。新鮮な、予め温めておいたメディアで細胞を再懸濁し、それらを数えます。ステップ2.1.1-2.1.3に示されたFACS分析によってVδ1+ CD4 +細胞の純度を調べます。 </li></ol>限界希釈4.単一細胞クローニング<ol><li> 1.1〜1.6に示すように、同種異系のドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。 </li><li> γ線照射を用いて、25 mlの培養培地中で80グレイで2.5×10 7の同種異系のPBMCを照射します。 </li><li>照射されたフィーダー細胞をIL-2（200 U / ml）を、IL-7（20ng / ml）およびPHA（2μg/ ml）を添加し、96ウェルU型プレートに配布し、5×10 4フィーダウェルあたり50μl中の細胞。 </li><li> 50μlの0.3細胞の濃度にVδ1+ CD4 +細胞を希釈します。ピペット各ウェル照射された細胞およびサイトカインを保有する細胞溶液の50μlのTE。 注：このように、サイトカインは、100 U / mlのIL-2を10ng / mlのIL-7とを1μg/ mLのPHAの最終濃度に希釈します。 37℃、5％CO 2の加湿雰囲気でインキュベーター中で96ウェルプレートをインキュベートします。 <ol><li>必要に応じて、クローンの同じ培養条件下でバルク培養物としてVδ1+ CD4 +細胞を精製したまま養います。 </li></ol></li><li>サイトカインおよび新鮮な培地で3〜4日ごとに細胞を供給してください。このため、ピペッティングにより50μlの新鮮な培地でウェル中の培地の交換半分。すべての補充にサイトカインの2倍の濃度を追加します。給餌のも、他のすべてのラウンドあたり5×10 4照射フィーダー細胞を追加します。 </li><li>彼らは代謝、したがって、培地およびフォームコロニーの色を変更すると、顕微鏡を用いて、観察最初のクローンは、3〜4週間後に目に見えるようになります。 注：毛皮のためにTHER栽培は、よくクローンを再懸濁し、96ウェルプレートを分離するためにそれらを転送します。 2.1.1-2.1.3に示すように、FACSを介して細胞を分析します。これらの条件の下に保持したクローンは、最終的にαβTCRにVδ1から自分のTCRを変更することがあります。この分化転換のための時点は、クローンからクローンに変化します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors:+plenty+to+choose+from.">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).</li><li>Von, B. H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease.">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nat. 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Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

その正磁気細胞分離のためVδ1およびCD4：希少（T-）細胞エンティティ、すなわちVδ1+ CD4 + T細胞の表現型、生物学と機能を研究するために、我々は二つのマーカーを使用していました。 CD4は、Tヘルパー細胞上に発現されるのに対し、Vδ1は、単球および樹状細胞上に低レベルで、および造血前駆細胞上で非常に低レベルで、オーファン受容体です。 高純度の細胞?...

脊椎動物では、細胞性および体液性免疫の部分で構成されている適応免疫は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしています。抗原の広範囲の認識は、T細胞に関して胸腺1を中心に製造されているものとするhyperpolymorphic T-およびB細胞受容体（TCR / BCR）によって媒介されます。これには、骨髄由来の造血幹細胞（HSC）は、胸腺に播種し、最終的にすべてのT細胞系統を生じる明確に定義されたステージに沿って分化します。およびCD8 - -胸腺播種前駆細胞は、CD4であり、したがって、未熟、ダブルネガティブ（DN）胸腺細胞の割合を構成しています。胸腺由来の信号は、その系統のコミットメントとαβまたはγδT細胞のいずれかへの分化を誘導します。 DN2 / 3胸腺細胞で機能的に再編成されたTCR-γおよびTCR-δ鎖遺伝子の発現は、細胞増殖のANを駆動δTCR複合体を、γにつながりますDγδT細胞2,3への分化を促進します。これとは対照的に、preTCRのpTを構築するためにpreTαとペアにすることができ、機能TCR-β鎖の再配列は、転写DN3胸腺細胞におけるTCR-γ鎖のサイレンシングおよび CD4 + CD8 +ダブルポジティブ胸腺細胞4への移行を誘導。この段階では、TCR-α鎖の再結合は、このようにこれらの細胞取消不能5-9で生産γδTCRを抑止、TCR-α遺伝子座内にたたずむTCR-δ遺伝子座を削除、発生します。再配置αβTCRsはその後自己免疫（ネガティブ選択）を避けるために、特定のしきい値を超えてはならない弱（ポジティブ選択）、自己MHCに結合するそれらの能力のために選択されます。結合MHCクラスIまたはIIの能力に応じて、選択されたαβT細胞は、単一陽性CD4 +またはCD8 + T細胞にその出口胸腺としてナイーブT細胞を開発します。 しかし、胸腺の退縮はほとんど消灯後思春期10でナイーブT細胞の指数関数的に減少する出力をリードする人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、T細胞プールのサイズは、ポスト胸腺恒常性T細胞の増殖および長寿命の免疫メモリ11の増殖によってのみ部分的に説明できる寿命を通して一定のままです。したがって、胸腺外T細胞の開発が行われなければなりません。最近の研究では、胸腺外で機能αβT細胞12-17を生じサイト-たαβT細胞前駆体を、特徴であるかなりの魅力を得ています。しかし、胸腺から独立したが、αβT細胞に分化胸腺外αβT細胞前駆体についての詳細な知識は、我々は、彼らがそれによって取るルート上に持っている背景のように断片的です。 我々は最近、Vδ1+の小さなT細胞エンティティを特定し</su健常人ドナーの末梢血から分離された胸腺外αβT細胞prognitor 18、などのp&gt; CD4 +γδT細胞は軽度の炎症環境でαβT細胞に分化転換することができます。興味深いことに、潜在的に新規の抗原を認識することができるように、このように、レパートリーの多様性を拡大後の胸腺T細胞の恒常性増殖、Vδ1CD4 +細胞の分化転換新たなT細胞受容体を生成する逆保護よい新たに取得された病原体に対する宿主。これは、T細胞の可塑性に追加され、胸腺外T細胞の開発のために、これまで正しく評価されていない新しい経路を追加します。 目的は、このαβT細胞が胸腺外発達をprecursor`sトリガこれらのマーカーおよび分子を同定するために、リンパ球の供給源からの定量的な分離は、単一細胞クローンの生成及びその効率的な拡張が必須です。

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

胸腺、αβT細胞および脊椎動物における適応免疫系の主鎖を生成するための主要な器官は、長いαβT細胞の唯一の供給源として考えられてきました。しかし、胸腺退縮は、周囲へのナイーブαβT細胞の劇的に減少出力につながる人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、あっても百歳は、新たに取得した病原体に対する免疫を構築することができます。最近の研究では、機能の胸腺損失を補償することができる経路のが我々の理解はまだルディメンタルあり、胸腺外αβT細胞の発生を示唆しています。 γδT細胞は、組織における主要なT細胞のサブセットを構成する生来のリンパ球です。我々は最近、CD4 +Vδ1+の γδの希少エンティティT細胞が炎症状態にαβT細胞に分化転換できることを示すことによって、γδT細胞サブセットに、これまで正しく評価されていない優れた機能を帰する。ここでは、P末梢血から、この前駆細胞の単離およびその後の培養のためのプロトコルをrovide。 Vδ1細胞を積極我々は、磁気標識技術とCD4 +細胞の乏しい部分を対象と第2のステップが続く、磁気ビーズを使用して、健康なヒトのドナーのPBMCから濃縮されます。第二の標識の磁力が第一の磁性ラベルの1を超え、従って、関心の人口の、効率的な定量的・具体的な正の単離を可能にします。それから、細胞をクローニングし、効率的に拡大するためのFACS解析によって生成されたクローンの同定に必要な技術や文化状況を紹介します。そこで、精製、文化および CD4 +Vδ1+γδT細胞のex vivoでの拡大のための詳細なプロトコルを提供します。この知識は、このαβT細胞progenitor`s生物学に関連する研究のため、IDEに目指す人のための前提条件でありますその転換に関与している分子トリガーをntify。

図1は、種々の段階及び末梢血からVδ1T細胞の単離の結果を示している。 図1Aは、CD3 +リンパ球におけるVδ1+細胞の代表的な分布、ならびにVδ1+集団の共受容体の発現を示します。このドナーでは、Vδ1+細胞 （赤）の周波数は、総リンパ球数の2.3％であり、Vδ1+リンパ球のCD4発現（緑）が2.6％です。要するに、分離のための標的?...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

単離と<em&gt;エクスビボ</emVδ1の&gt;文化<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt;γδT細胞、胸腺外αβT細胞前駆

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K ビュー.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ビデオ: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

発生生物学

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

免疫・感染学

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

がん研究

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have been conducive to downstream in vivo functional analysis of TCR heterodimers. We have developed an improved protocol based on a two-step multiplex-nested PCR, which results in a PCR product that spans entire variable regions of a human TCR alpha and beta chains. By identifying unique restriction sites and incorporating them into the PCR primers, we have made the PCR product compatible with direct sub-cloning into the template retroviral vector. The resulting retroviral construct encodes a chimeric human/mouse TCR with a mouse intracellular domain, which is functional in mouse cells or in in vivo mouse models. Overall, the protocol described here combines human single cell paired TCR alpha and beta chain identification with streamlined generation of retroviral vectors readily adaptable for in vitro and in vivo TCR expression. The video and the accompanying material are designed to give a highly detailed description of the single cell PCR, so that the critical steps can be followed and potential pitfalls avoided. Additionally, we provide a detailed description of the cloning steps necessary to generate the expression vector. Once mastered, the whole procedure from single cell sorting to TCR expression could be performed in a short two-week period.

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

The current protocol combines single cell paired human TCR alpha and beta chain sequencing with streamlined generation of retroviral vectors compatible with in vitro and in vivo TCR expression.

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>T細胞中のCa2+ マイクロドメインを検出するための高分解能イメージング技術

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:治療介入のための適応免疫応答の初期活性化の解明

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

単離と

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

マウスナイーブCD4

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング

初代T細胞における初期Ca²⁺ マイクロドメインのイメージング