This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Not: Bu protokol Bonaventure ve ark uyarlanmıştır. (2004), Molina ve ark. (2006), Li ve diğ. (2013) 7,10,11. Adım 1-5, Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. 1. Doku delipidasyon Not: Her zaman, kloroform ile tüm cam ve kapaklarını durulayın kullanmadan önce, davlumbaz altında kuru icar. DİKKAT: Doku homojenizasyon ve davlumbaz altında bütün solvent transferi adımları uygulayın; Her zaman kimyasallarla direkt temastan kaçınmak ve kirlenmeye örnekleri korumak için laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> Ön ısıtma su banyosu aldı ve 85 ° C&#39;ye kadar ısıtma bloğu. </li><li> Politetrafloroetilen (PTFE) -faced Vidalı kapakları olan önceden tartılmış 20 mm x 125 mm ebadındaki bir cam test tüpleri içine her yaprak numunenin yaklaşık olarak 0.5 g tartılır. Numune başına dört çoğaltır ekleyin. </li><li> Bir Erlenmeyer şişesine (yaklaşık 125 ml 2-propanol yerleştirin; samp gramı başına 25 mlle). % 0.01&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar (aynı zamanda butile hidroksitolüen, BHT olarak da bilinir), 2,6-di-tert-bütil-4-metilfenol ekleme (ağırlık / hacim). Not: Metanol içinde stok çözeltisi (ağ / hac) bir% 5 ila BHT ekleyin (BHT doymamış yağlı asitlerin oksidasyonunu en aza indirir). </li><li> Su banyosu içinde 85 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma 2-propanol çözeltisi. </li><li> Isıtma bloğu, 85 ° C&#39;de 15 dakika boyunca, her numune tüpü ve ısıya 12 ml sıcak 2-propanol çözücü ekleyin. Bu adım, kesintiye hücrelerden serbest bırakılabilir lipazlar inaktive eder. </li><li> Tüpler oda sıcaklığında kadar soğutulur ve homojen bir süspansiyon elde edilene kadar homojenize ile iyice doku öğütmek olsun. </li><li> Orbital çalkalayıcı numuneler ve 100 rpm ve oda sıcaklığında 1-2 saat çalkalanmıştır. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 2-propanol eşit hacimde ilave edilir ve oda sıcaklığında 12 saat boyunca çalkalanır. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 12 ml CH eklemeCı 3: CH3OH (2: 1, h / h) (numunenin gramı başına 25 mi) ila kalıntısı 100 rpm&#39;de ve oda sıcaklığında gece boyunca sallamak. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 12 ml CHCl3 ekleyin: CH3 OH (1: 2, h / h) ila kalıntısı 100 rpm&#39;de ve oda sıcaklığında gece boyunca sallamak. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj ve ayrılması için kullanılabilir. </li><li> Numuneler oda sıcaklığında bir gece boyunca davlumbaz altında kurumasına izin verin. </li><li> Tortu hava-kurutun ve daha sonra susuz CaCI2 veya sabit ağırlık (3-5 gün) ulaşılana kadar CaSO 4 üzerinde bir vakum kurutucu içinde yer. </li></ol> 2. depolimerizasyonu: sodyum metoksit ile metanoliziyle (Şekil 2) UYARI: - 2.4, 2.7 - 2.8, 2.10 - 2.3 adımları uygulayın 2.15 ve 2.17 - - 2.11, 2.13 davlumbaz altında 2.18; Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> (Diğer hesaplamalar için önemli), kuru bir tortu ihtiva eden test tüpleri tartılır. </li><li> Her bir tüp, iç standartlar ekleyin: 25 ωL metil heptadecanoate (1 mg / ml stok) ve 25 ul ω-pentadecalactone (1 mg / ml stok). </li><li> Her tüpe 0.9 ml metil asetat, 1,5 ml sodyum metoksit ve 3.6 ml metanol eklenir ve bunları kap. Alternatif olarak, bu üç reaktifler ile, bir reaksiyon karışımı hazırlamak ve her bir örnek için 6 ml&#39;lik alikotları ekleyin. </li><li> 2 60 ° C de saat ve periyodik olarak 15 dakika aralıklarla girdap için ısı örnekleri. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Yağlı asit metil esterlerinin elde etmek için metilen diklorid (CH2C! 2) ve buzlu asetik asit 1.5 ml 10 ml ekleyin. </li><li> Her bir tüp ve kap doldurmak için tuzlu su çözeltisi (0.5 M NaCI) ekleyin. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> Poli orta boy tüpleri temizlemek için (alt) Organik fazı aktarın (16 x 125 mm cam test tüpleri(PTFE) -faced vidalı kapak). </li><li> Her bir tüp ve kap doldurmak için tuzlu su çözeltisi (0.5 M NaCI) ekleyin. </li><li> 800 x g&#39;de 10 dakika boyunca 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> Sulu (üst) fazı çıkarın ve tekrar 2.11-2.12 adımları. </li><li> Tüm sulu (üst) fazı çıkarın. </li><li> 1 dakika için tüpler, ve vorteks kap, bir çözücü susuz sodyum sülfat (Na SO 2 4) ilave et; Numuneler artık şu güne kadar bırakılabilir. Bu noktada örnekleri davlumbaz altında bir gecede terk edilebilir At. </li><li> Alt Na 2 SO 4 tuzu sıkıştırmak için 800 xg&#39;de 2 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Küçük bir cam tek boru (politetrafloroetilen ile 13 x 100 mm ebadındaki bir cam test tüpleri (PTFE) -faced vidalı kapak) organik fazın aktarın. </li><li> Nitrojen altında kuruyana kadar buharlaştırılır ve bir türetme aşamasına geçin. Hemen işleme değilse, -20 ° C&#39;de saklayın Örnekleri buharlaştınldı (örnekleri olabilir,LSO) buharlaştırma basamağından önce saklandı. </li></ol> Gaz Kromatografi için 3. Türev hazırlanması DİKKAT: adımlar 3.1.2 ve 3.1.5 gerçekleştirin - davlumbaz altında 3.1.8; Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve sıçrama koruyucu gözlük kullanın. <ol><li> Trimetilsilil türevleri <ol><li> 100 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> Her tüpe 100 ul piridin ve BSTFA (N, O-Bis trimetilsilil-trifloroasetamid) 100 ul ilave edin ve bunları kap. </li><li> 10 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısı örnekleri. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında nitrojen altında örnekleri buharlaştınn. Numunelerin ısı uygulamaktan kaçının, monomerler bu aşamada son derece uçucu bulunmaktadır. </li><li> 1 (h / h) heptan: toluen 1 500 ul ekle. </li><li> 800 x g&#39;de 2 dakika süre ile 1 dakika santrifüj vorteksleyin örnekleri. </li><li> GC şişeleri örnekleri ekleyin ve GC / MS analizi geçin. </li></ol></li><li> Asetiltürevleri Not: asetilasyondan için adımları değiştirmeniz 3.1.1-3.1.3 yukarıdaki (video gösterilmemiştir) aşağıdaki gibi; 3.1.4-3.1.8 aynı adım: <ol><li> 60 ° C&#39;ye kadar ısıtın ısı bloğu. </li><li> Piridin 100 ul ve tüpler asetik anhidrid 100 ul (O Ac 2) eklenir. </li><li> Isı örnekleri 60 ° C &#39;de 1 saat. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS analizi <ol><li> HP-5 kılcal kolon (30 mx 0.25 mm x 0.25 mm film kalınlığı) veya eşdeğeri (yani.,% 5 difenil,% 95 dimetil polisiloksan) kullanınız. Program 3 ° C / dakikada 300 ° C&#39;ye kadar 150 ile programlanan helyum taşıyıcı gaz, 1.5 ml / dak olarak belirlenmiştir akış ve fırın sıcaklığı GC. </li><li> 40-600 amu (elektron darbe iyonizasyon) üzerinden tarama moduna bölünmüş enjeksiyon (split oranı 1:10) ve set kütle spektrometresi kullanın. </li><li> Solvent (boş), WT ve mutant çoğaltır, her kullanılarak belirtilen kütin analiz yöntemi de dahil olmak üzere bir dizi tablo oluşturun. </li><li> Yük çözücüve carrousel örnek şişeleri, gerekirse otomatik numune şırınga durulama şişeleri hekzan ekleyin ve sırasını başlatın. Sekansı tamamlandıktan sonra, toplam iyon kromatogram izleri tüm örnekler için kullanılabilir. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Yayınlanan kütle spektrumları her zirvenin kütle spektrumu karşılaştırarak veya varsa ticari bir kütüphane arayarak lipit polyester monomerleri tanımlayın. </li><li> Toplam iyon akımı kromatogramdaki Belirlenen her tepe için, GC / MS yazılımı (Ek Şekil 1) den entegrasyonu sonuçları masaya alanları bulmak için kendi tutma kez kullanabilirsiniz. </li><li> Her monomer (sütunlar AB) için, bir monomer Excel tablosu (Ek Dosya 2, sütunlar CF), numune çoğaltmak her için ilgili sütuna entegrasyon tablosu (İletişim Şekil 1, sütun D) bulunan alan değerleri eklemek Bir elektronik tablo Arabidopsis ölçmek içinkütin TMSI türevleridir. Asetillenmiş türevler yerine hazırlanır eğer Ltd. Dosya 3 kullanın. </li><li> BS sütunları (HK) iç standartları (IS) alanlarını ekleyin. Monomer tabloda miktar (mor gölgeli hücreleri için olduğu gibi 0 FAME (IS1) Tamamlayıcı: O, yani yağ asidi metil esterleri türetilmiş olmayan monomerler (FAME) ve dikarboksilik asit dimetil ester (DCA DMEs) için, 17 kullanımı Dosyaları 2/3). Primer alkoller, ferulik asit ve ω-hidroksi asitler de dahil olmak üzere hidroksillenmiş monomerlerin, 15 kullanın: Bileşik ölçümü için tercih IS 0 15-hidroksi FAME (IS2) (monomer tablosunda yeşil-shadded hücreler; 2/3 Yan Files) . </li><li> Her kuru yaprak ağırlığı ekle sütunları çoğaltmak AX-BA (Ek Dosya 2) ya da AQ-AT (Ek Dosya 3); alternatif birimi başına monomer yükleri ifade yüzey alanları hesaplamak ve monomer tabloya alan değerlerini eklemek için yaprakları taramayüzey alanı. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolyester+membranes+of+plants:+cutin+and+suberin.">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li><li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyesters+in+higher+plants.">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li><li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+plant+cuticles.">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li><li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis.">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li><li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin,+a+plant+barrier+biopolymer.">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li><li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis:+occurrence+of+octadeca-cis-6,+cis-9-diene-1,+18-dioate+as+the+major+component.">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li><li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin.">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li><li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li><li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds.">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li><li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl-lipid+metabolism.">Acyl-lipid metabolism.</a> The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).</li><li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana.">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li><li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development.">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 446 (2010).</li><li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry.">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li><li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+(L.)+Karst.,+Quercus+robur+L.,+and+Fagus+sylvatica+L.">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li><li>Riederer, M., Sch&#246;nherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin.">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li><li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis.">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li><li>Gra&#231;a, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins.">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li><li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I:+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle.">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li><li>Espelie, K. E., K&#246;ller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid,+a+novel+component+in+citrus+cutin.">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li><li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves.">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li><li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins.">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li><li>Holloway, P. J., Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical constitution of plant cutins. , 45-85 (1982).</li><li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle.">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

DNA ve proteinler gibi diğer biyopolimerler farklı olarak, bitki lipid polyesterler bir şablondan yapılmamıştır. Bunun yerine, bu bileşimler, hücre dışı polimerlerin hazırlanması dokularda mevcut enzimlerin özgünlüğünün bağlıdır. Böyle, kimyasal bileşen analizleri gibi bileşenleri lipit polyester bileşimi anlamak için kritik öneme sahiptir. Ester bağları parçalama kimyasal yöntemler sabunlaşma, hidrojenoliz, asit katalizli metillenmenin ve baz ile katalize edilen metillenmenin 2 içerir. Bunların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Sabunlaşma ikincil reaksiyonlara tabi olabilir serbest yağ asitlerini üretir hidroksi. Lityum alüminyum hidrid ile Hidrojenoliz (LiAIH4) 16 kütin analizi 7 kullanılmaktadır. Hidrojenoliz alkollere işlevselleştirilmiş karbona azaltır ve orijinal yapılar lityum alüminyum deuteride (LiAlD 4) ile deuteriolysis anlaşılabilir olması gerekir.Bu yaklaşımın dezavantajı kendi yapılarının atamalarını yapmak için elde edilen yağ poliollerin deuteriation derecesini karşılaştırmak için yüksek çözünürlüklü GC / MS gerekliliktir. Metanolik boron trifluorid (BF 3) ile asit katalizörlü transesterifikasyon genellikle kütin ve suberin depolymerizations 8,17,18 kullanılmıştır, fakat ayıraç sınırlı bir raf ömrü vardır ve tepkilerini 15 yan nedeniyle eserler katabilmektedir. Metanolik sülfürik asit de diğer yöntemlerle 10 ile karşılaştırıldığında, monomerlerin ancak muhtemelen doğru lipid polyester bileşenleri olmayan 2-hidroksi yağ asitlerinin daha yüksek oranlarda, metil esterler elde edilir. Bu protokolde belirtilen NaOMe ile katalize edilen transesterifikasyon yöntemi tanımlanması için karakteristik kütle spektrumu sağlayan, hidroksil grupları sililasyonu türetilmiş olan yağlı asit metil esterlerinin üretimi veya asetilasyonu ile fo hidroksil gruplarının daha kararlı türevleri sağlamaktırr ölçümü. Bu tekniğin bir dezavantajı, su reaksiyonda mevcut olduğunda hidroliz transesterifikasyon ile rekabet olmasıdır. Su NaOMe (katalizörü) ile reaksiyona girer ve bu da serbest asitlerin (Şekil 2B) elde etmek için yağlı asit metil esterleri hidrolize eden NaOH üretir. Bu şekilde analiz komplike bir metil ester ve bir TMSI ester türevi: iki tepe her yağlı asit mevcut olacaktır, bu arzu edilmeyen bir yan reaksiyondur. Susuz reaktifler kullanılarak ve sabunlaştırma ile rekabet etmek için, bir ko-çözücü olarak metil asetat eklenerek hidroliz (Şekil 2B) engellemek için ve böylece önemli adımlardır. Kütin ve suberin 1 ve% 26 gliserol 4 arasında içerirler. Bununla birlikte, bu monomer bu protokolde belirtilen deney şartları ile tespit edilmez. Gliserol yağ asidi metil ester monomerlerin farklı olarak, sulu bir çözücü yıkama adımları sırasında elimine edilecektir, yüksek oranda hidrofilik ve. Bu sınırlama, aynı zamanda birDiğer kütin depolimerizasyon yöntemleri ancak gliserol NN = normal sıfır, bir enzimatik yöntem kullanılarak, transesterleştirme sonrasında elde edilen sulu tabaka içinde belirlenebilir. Seçenek olarak ise, daha hafif koşullar kullanılarak ölçülebilir (örn., 0.05 M NaOMe) daha fazla su çıkarma olmaksızın tüm monomerler tespit etmek için, gliserol ölçümü amacıyla vardır.Her ne kadar yararlı gliserol 19,20 dahil olmak üzere yumuşak koşullar genellikle kütin eksik depolimerizasyonunu verip süberin. Bir alev iyonizasyon detektörü (FID) bağlı bir GC mevcut ise temsili bir numunenin tepe GC / MS yolu ile teşhis edildikten sonra, tüm çoğaltır nicel amacıyla bu alet olarak analiz edilebilir. , Tutma endeksleri bilinmektedir Alternatif olarak, GC / FID izleri monomerler, tespit edilebilir. Alev iyonizasyon dedektörü büyük ve küçük numune bileşenlerinin miktarının tayini için önemlidir, özellikle yüksek hassasiyet ve orantılılık, geniş bir yelpazede yer alırTek çalıştırır. Buna ek olarak, bu sağlam ve korumak ve 15 işletmek kolaydır. Açıklanan protokol, bir ya da daha fazla lipit poliester monomer bileşimin farklı mutantların kimyasal özelliklerini sağlayan bitki lipid poliester monomer, güvenilir ve tekrarlanabilir izolasyonu, tanınması ve miktar tayini için izin verir. Prosedür kolayca kökler, tohumlar, yapraklar, saplar ve çiçekler dahil olmak üzere çeşitli bitki malzemeleri, küçük ve dökme hem de miktarını işlemek için adapte edilebilir, ölçeklenebilir. Birçok türün lipid polyester monomerlerin kütle spektral verileri, 21-26. Örneğin yayınlanan ve diğer dokuların ve / veya türlerin bu protokolü adapte zaman bilinmeyen monomerleri tanımlamak için değerli kaynakları teşkil edilmiştir. Bu yöntem, yüksek bitki lipid poliesterlerin sentezi, düzenleme ve dağıtım araştırmalar için de geçerlidir.

Vasküler bitkiler, bitki dokuları ve dış ortam arasında su geçirmez bariyerler olarak işlev dışı katmanları güveniyor. Bu lipofilik hücre duvarı ile ilişkili yapıları, patojenik enfeksiyonun kısıtlama içinde ve bitki dokularında 1 üzerinden gaz, su ve çözünmüş maddelerin pasif taşıma düzenler. Bu tür engeller bitki manikür, bitkiler 2, ve farklı süberin içeren difüzyon bariyerleri özgü bir synapomorphic yapı vardır. Kütikül hücre duvarının 3-5 hücre dışı tarafında pektinli tabakası yoluyla epidermal hücreleri tarafından sentezlenen ve bunlara bağlı olan bir oleofilik bir katmandır. Bu bitki dokularında ve çevre arasındaki hayati bir arayüz olarak işlev, yüksek bitkilerin birincil hava organlarını encases. Kütin, manikür yapısal matris ve süberin solvent ekstrakte mumlar 2,4 ile bağlantılı iki çözünmez gliserolipid polyesterlerdir. Bu polimerik lipids doymuş ve doymamış yağlı asit türevleri oluşur ve her iki yapısal ve fonksiyonel olarak benzer. Bununla birlikte, kimyasal bileşimi ve yerleştirme siteleri karakteristik farklılıklardan ayırt edilebilir. Suberin ikincil duvar oluşturan, belirli dahili ve harici dokuların hücre duvarları içinde yer alan bir alifatik polyester. Suberize olmuş dokular köklerinin periderms, yumrular ve ağaç kabuğu, kök endodermis, çiğit katmanları ve iyileşmiş yaralar 2 bulunur. Kütin farklı olarak, suberin poliester genellikle alkoller, doymuş ve mono-doymamış dikarboksilik asitler ve çok uzun zincirli monomerler büyük bir kısmı (C≥20) içerir. Kütin damarlı bitkilerin 6 içinde en bol lipid polyester ve gliserol ve hidroksi ve hidroksi-epoksi ikameli yağlı asitler 4 olarak C16-C18 yağlı asit ara esterleşmiş türevleri oluşur. Kütin polimerlerin bileşimi iken0, 18-hidroksi-9,10-epoksi 18: 0 ve 18 9,10,18-trihidroksi: 0 yağ asitleri tracheophyte türler arasında değişiklik gösterir, en baskın ana monomerler, 16, 16-dihidroksi, 10 vardır. 2 dikarboksilik asit 7,8: İlginç bir şekilde, Arabidopsis yaprağı ve kütin kök esas olarak 18 oluşmaktadır. Bitki cuticles da birkaç mikrometre 9 birkaç nanometre arasında değişen kalınlıkta bir önemli ölçüde değişkenlik mevcut. Manikür izolasyonu özellikle bu tür Arabidopsis thaliana&#39;nın 8 gibi çok ince yaprak cuticles için zahmetli ve zaman alıcı bir adım, olduğundan manikür izolasyonu bypass yöntemleri geliştirilmiş ve 7,8 doğrulanmıştır. Burada, sodyum metoksit (NaOMe) katalize depolimerizasyon ve daha sonra gaz kromatografisi / kütle spektrometrisi (GC / MS) analizi ile, Arabidopsis thaliana yapraklarda kütin monomer bileşiminin incelemek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol co tahlil için sağlam bir yöntem sunmaktadırBütün delipide dokularda bitki lipid poliesterlerin bir kompozisyon, ve daha önce bildirilen protokoller 7,10,11 adapte edilmiştir. Tüm doku örnekleri vardır homojenize ilk ve etraflıca cuticular ve epikütikülar mumlar, membran lipitleri ve triaçilgliseroller dahil solvent ekstrakte lipidlerin kaldırarak, delipide. Hücre duvarı zenginleştirilmiş kalıntıları daha sonra sodyum metoksit ile katalize metanoliz ile kendi kurucu metil ester monomerlere depolimerize edilmektedir. Yağ asidi metil esterleri asitleştirme üzerine ekstre edilebilmekte ve bunların karşılık gelen trimetilsilil veya asetildir türevlerini elde etmek üzere derivatize edilir. Türetilmiş kalıntısı uçucudur ve GC / MS analizi sırasında yapısal konformasyonunun değiştirmeden makul bir sıcaklıkta bir gaz kromatografisi sütunundan elute edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

. Bu yazıda anlatılan protokol Şekil 1 olmayan kütin lipidlerin 10 katkılarını en aza indirerek, (., Kütin veya süberin yani) lipit polyester monomerleri belirlemek için kurulan toplam 8 arasında sürer tahlil, genel bir bakış sunuyor edilir - 10 gün (GC verilerinin elde edilmesi için ilk dokusu hasat), kurumaya bırakılır ne kadar süre örnekler bağlı olarak değişir. Seçilen baz katalizörlü metanolizi (Şekil 2) polyesterleri depolimerize yöntemi daha önce kütin ve mantarözü her ikisini de içerir Arabidopsis tohumu için doğrulanmıştır. Dokular ilk homojenize ve etraflıca solvent ekstrakte lipidlerin kaldırmak için delipide edilmiştir. Ekstraksiyondan sonra tortu, verimi, başlangıç ​​taze ağırlığının yüzdesi olarak, A. genellikle% 6 thaliana Col-0 bırakır. Hücre duvarı zenginleştirilmiş tortular bir vakum kurutucu içinde kurutuldu ve daha sonra kendi oluşturucu metil ester monomerlere depolimerize edilirBaz katalizli metillenmenin. İki saatlik inkübasyon uygun depolimerizasyon ve lipid polyester bileşenlerinin geri kazanımı için gerekli kritik süre olarak seçildi. Daha uzun inkübasyon süreleri 2-hidroksi asitler artış ile sonuçlanmıştır; Bu potansiyel membran sfingolipidler 10 kaynaklanmaktadır. O -TMSi eter türevleri (Şekil 3A) ve O-asetil türevleri (Şekil 3B) Arabidopsis yabani tip yaprak kütin, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir, eğer tipik bir kromatogramı. Her bir en yüksek literatürde 7,8 ve 12 .our video protokol TMSI türevleri hazırlamak için gösterilmiştir genel veritabanı kütle spektrumları ile karşılaştırılarak tespit edildi, fakat örnekler alternatif hidroksil grubu türetmek için asetile edilebilir. Onlar teşhis kitle spektrumları vermek için Silillenmiş türevleri tanımlama amacıyla iyidir. Fakat asetillenmiş türevleri daha kararlı olan ve bir alternatif sililasyonu içinBir kez monomerler, 10 tespit edilmiştir. Sadece GC alev iyonizasyon detektörü (FID) bağlanır olan laboratuarlarda bu protokolü uygulamaya yardımcı olmak için, GC / FID WT yaprak kütin monomer ve yağ asidi metil ester, standartların bir homolog dizi asetillenmiş türevlerden tekabül de gösterilir izleri (Ek Şekil 4). Bu yöntem nitel ve nicel örnekler arasında farklılıklar mutant analizi için dolayısıyla değerini tespit eder. Bireysel monomer miktarları örnekler arasındaki monomer bolluğu karşılaştırmalar sağlayan ölçümü iç standart yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Pik boyutu (toplam iyon sayısı) polyester monomerlerin mol oranlarını yansıtmıyor olabilir, ancak, açıklığa kavuşturulmalıdır. Bu yağlı asit metil esterleri ve TMSI türevleri (Ek İçerik 1) ya da as olarak Arabidopsis yaprağı kütin monomer miktarlarını hesaplayabilecektir monomerlerin düzenlenebilir tablolar dahil<html> alkollerin asetil türevleri (İletişim Dosyası 2). Bu tablolar, numuneler farklı organ ve bitki türlerinden ekstrakte durumunda adapte edilmesi gerekebilir. Bir örnek olarak, analiz edilen adres Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0), vahşi tip yaprak ve CYP86A2 / ATT1 geni att1-1 (m-1) ve att1-2 iki, daha önce karakterize boş mutant aleli (m-2 ) 13,14. CYP86A alt ailesinin sitokrom P450 monooksijenazlar varsayılan ω-oksidazlar kodlamak ve suberin ve kütin monomer biyosentezi katılmak. Bizim sonuçlarımız (Şekil 4) WT yaprakları ile karşılaştırıldığında mutant yapraklarda üç büyük lipid monomer yükleri önemli azalmalar göstermektedir. 0, 18: 2 ve 18: enzimin tahmin fonksiyonu 16 ile uyumlu olarak 1 dikarboksilatlar, özellikle att1 mutant etkilendi. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil lipit polyester analizi 1. Genel Bakış. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Şekil NaOMe katalizörlü metillenmenin reaksiyon 2. mekanizması. Nükleofilik metoksit anyonları kolaylıkla yağlı asit metil esterlerinin ve alkoksit anyonlar (B) ayrışırlar kararsız bir tetrahedral ara (A) oluşturmak için lipid polyesterlerin karboml karbon saldırır. Bu alkoksitler konjuge bazlar ve bu suretle de ilave depolimerizasyon reaksiyonları (C) sürdürülmesi, katalitik olarak aktif metoksit anyonları rejenere metanol ile reaksiyona girmektedirler. Su içinde mevcut değilseSistem, sodyum hidroksit, geri dönüşü olmayan istenmeyen serbest yağlı asitlerin üretilmesi için esterleri hidrolize eden güçlü bir baz oluşturmak üzere sodyum metoksit ile reaksiyona girer. Metil asetat. Sisteminde (D) içindeki sodyum hidroksit küçük miktarlarda kaldırmak için bir ko-çözücü 15 olarak <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">eklenir, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Şekil 3. Yabani tip Arabidopsis thaliana yaprağı kütin monomerlerin Temsilcisi toplam iyon kromatogramı. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) eter ve (B) asetat hidroksil türevleri. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Şekil, Arabidopsis thaliana WT 4. Kütin monomer bileşimi ve CYP86A2 geninin iki boş mutant aleli. (Mutant-1 = att1-1 mutant-2 = att1-2) Hata çubukları (n = 4), ortalamanın standart sapmasını temsil eder . © Blackwell Publishing (2007) izni ile, 13 uyarlanmıştır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MS yazılım yazmak Şekil 1. Tepe entegrasyon sonuçları tablosu. Belirlenen monomer ve iç standartlarına uygun Peaks kendi retenti ile tanımlanır<html> zaman (sütun C) ve alan değerleri sütununda tablolanmıştır D. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Arabidopsis kütin monomerlerin (hidroksi yağ asidi metil esterlerinin trimetilsilil eter türevleri) İletişim File 2. Tablo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Arabidopsis kütin monomer (hidroksi yağ asidi metil esterlerinin O-asetil türevleri) Company Dosya 3. Tablo.com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Ek Şekil 4. GC / FID izleri (AB) yağlı asit metil ester (FAME) alıkoyma göstergesi standartları (tepe değeri, her doymuş FAME zincir uzunluğu ile etiketlenmiştir); ve (C) A. asetilatlı thaliana yaprağı WT kütin monomerler. 16: 0, FAME (1), ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 kareleri (4), 18 (5), sinapate 0 FAME (6 tepe numaralarına karşılık gelen ), 16: 0 DCA (7), 16-OH, 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH, 18: 2 FAME (12), 18-OH, 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dikarboksilik asit dimetil ester; FAME: yağlı asit metil ester; IS1: iç standart 1, 17: 0 FAME; IS2: İç standard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Görüntüleme.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Kimya

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Bitki Tırnak biyosentezi keşfedin Arabidopsis eceriferum Mutants

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biyoloji

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

Kimyasal yalıtım, miktar ve sürüngenler cilt lipidler, ayrılık

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Çevre

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Yüksek β-O-4 içeriği ile Lignin çıkarımı hafif etanol ayıklama ve bozulumu verim üzerindeki etkisi

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...