This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من بونافنتور وآخرون. (2004)، مولينا وآخرون. (2006)، لي وآخرون. (2013) 7،10،11. وتتلخص الخطوات 1-5 في الشكل 1. 1. مناديل إزالة الشحميات ملاحظة: شطف دائما عن الأواني الزجاجية وقبعات مع الكلوروفورم، والسماح الجافة تحت غطاء الدخان، وقبل استخدام. تنبيه: إجراء تجانس الأنسجة وجميع الخطوات نقل المذيبات تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية لتجنب الاتصال المباشر مع المواد الكيميائية وحماية العينات من التلوث. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام ماء سخن وكتلة الحرارة إلى 85 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن حوالي 0.5 غرام من كل عينة ورقة إلى 20 ملم × 125 ملم اختبار أنابيب زجاجية وزنه قبل مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) قبعات المسمار -faced. تشمل أربع مكررات لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2-بروبانول في دورق مخروطي (حوالي 125 مل، 25 مل غرام من عصيدة فيلو). إضافة 2،6 دى ثالثي بوتيل-4-methylphenol (المعروف أيضا باسم hydroxytoluene الأنيسول، BHT) إلى تركيز النهائي من 0.01٪ (ث / ت). ملاحظة: إضافة BHT من 5٪ (ث / ت) حل الأسهم في الميثانول (BHT يساعد على التقليل من أكسدة الأحماض الدهنية غير المشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن حل 2-بروبانول إلى 85 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل الساخن 2-بروبانول المذيبات لكل أنبوب عينة والحرارة لمدة 15 دقيقة في 85 درجة مئوية في كتلة الحرارة. هذه الخطوة يثبط نشاط الليباز التي قد أفرج عنه من الخلايا تعطلت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح أنابيب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وطحن الأنسجة تماما مع الخالط حتى يتم الحصول على تعليق متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في شاكر المداري ويهز لمدة 1-2 ساعات في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من 2 بروبانول ويهز لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل CHCL 3: CH 3 OH (2: 1، V / V) لبقايا (25 مل غرام من العينة في المائة) ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل CHCl 3: CH 3 OH (1: 2، ت / ت) لبقايا ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وإزالة المذيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح العينات الجافة تحت غطاء الدخان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف بقايا ثم ضع في مجفف فراغ على اللامائية CaCl 2 أو كبريتات 4 حتى يتم التوصل إلى وزن ثابت (3-5 أيام). </li></ol> 2. التحلل: تحلل الميثانول مع ميثوكسيد الصوديوم (الشكل 2) تنبيه: تنفيذ الخطوات 2،3-2،4، 2،7-2،8، 2،10-2،11، 2،13-2،15 و2،17-2،18 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنابيب الاختبار تحتوي على بقايا الجافة (مهمة لمزيد من العمليات الحسابية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المعايير الداخلية لكل أنبوب: 25 ωL heptadecanoate الميثيل (1 ملغ / مل الأسهم) و 25 ميكرولتر ω-pentadecalactone (1 ملغ / مل الأوراق المالية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.9 مل خلات الميثيل، 1.5 مل ميثوكسيد الصوديوم، و 3.6 مل الميثانول إلى كل أنبوب ولحد منها. بدلا من ذلك، وإعداد مزيج التفاعل مع هذه الكواشف ثلاثة وإضافة قسامات 6 مل لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية، ودوامة دوريا في 15 دقيقة فترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من ثنائي كلوريد الميثيلين (CH 2 الكلورين 2) و 1.5 مل من حمض الخليك الجليدي لاستخراج الأحماض الدهنية استرات الميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة العضوية (أقل) لتنظيف أنابيب متوسطة الحجم (16 × 125 ملم أنابيب اختبار الزجاج مع بوليtetrafluoroethylene (PTFE) -faced سقف المسمار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مائي (العلوي) مرحلة وكرر الخطوات 2،11-2،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع مائي (العلوي) المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كبريتات الصوديوم اللامائية (نا 2 SO 4) إلى مذيب، وكأب الأنابيب، ودوامة لمدة 1 دقيقة. يمكن الآن يقم عينات حتى اليوم التالي. عند هذه النقطة عينات يمكن ترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج لضغط نا 2 SO 4 الملح في القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة العضوية إلى أنبوب المتاح كوب صغير (13 × 100 ملم اختبار أنابيب زجاجية مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) -faced سقف المسمار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيب للجفاف تحت النيتروجين، والشروع في الخطوة اشتقاق. إذا لم تتم معالجتها على الفور، تبخرت تخزين العينات في -20 ° C (يمكن أن يكون عينات لتخزين يسوتو قبل الخطوة التبخر). </li></ol> 3. إعداد المشتقات للاللوني للغاز تنبيه: تنفيذ الخطوات 3.1.2 و3.1.5 - 3.1.8 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشتقات Trimethylsilyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من BSTFA (N، O البس trimethylsilyl-trifluoroacetamide) إلى كل أنبوب ولحد منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر العينات تحت النيتروجين في درجة حرارة الغرفة. تجنب تطبيق الحرارة لعينات، أحادية متقلبة جدا في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 1: 1 (ت / ت) هيبتان: التولوين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينات قارورة GC، والشروع في تحليل GC / MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاسيتيلالمشتقات ملاحظة: للحصول على أستلة، تعديل الخطوات 3.1.1-3.1.3 أعلاه على النحو التالي (لا يظهر في الفيديو)؛ خطوات 3.1.4-3.1.8 هي نفسها: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من أنهيدريد الخل (AC 2 O) للأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة 1 ساعة عند 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عمود شعري HP-5 (30 م × 0.25 مم × 0.25 ميكرومتر سماكة الفيلم) أو ما يعادلها (أي.، 5٪ ثنائي الفينيل، 95٪ ثنائي ميثيل polysiloxane). برنامج GC مع تدفق الغاز الناقل الهيليوم وضعت في 1.5 مل / دقيقة ودرجة حرارة الفرن مبرمجة 150-300 درجة مئوية في 3 ° C / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقن الانقسام (تقسيم نسبة 01:10) وتعيين مطياف الكتلة لفحص وضع أكثر من 40-600 اتحاد المغرب العربي (الإلكترون تأثير التأين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء جدول تسلسل بما في ذلك المذيبات (فارغة)، WT ومكررات متحولة، كل باستخدام أسلوب التحليل كوتين المشار إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مذيبوقارورة العينة على كاروسيل، إضافة الهكسان إلى قارورة-الشطف حقنة في الاوتوماتيكى إذا لزم الأمر، ويبدأ التسلسل. بعد اكتمال التسلسل، متاحة للجميع العينات مجموع آثار ايون اللوني. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أحادية البوليستر الدهون بمقارنة الطيف الكتلي كل الذروة لنشر أطياف الشامل أو من خلال البحث في المكتبة التجارية إن وجدت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الذروة المحددة في مجموع ايون اللوني الحالي، استخدم مرات الاحتفاظ كل منهما للعثور على المناطق على جدول النتائج التكامل من GC / MS البرنامج التكميلي (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل مونومر (الأعمدة AB)، إضافة القيم المنطقة وجدت في الجدول التكامل (التكميلي الشكل 1، العمود D) إلى العمود المقابل لكل تكرار نموذج في جدول Excel من أحادية (ملف إضافي 2، والأعمدة CF)، وهو جدول لقياس نبات الأرابيدوبسيسالمشتقات كوتين TMSI. استخدام ملف إضافي 3 إذا كنت على استعداد المشتقات الأسيتيل بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجالات المعايير الداخلية (IS) إلى الأعمدة IS (HK). بالنسبة لأولئك مونومرات التي لم يتم derivatized، استرات الميثيل وهي الأحماض الدهنية (جوع)، وثنائي الكربوكسيل استرات ميثيل حمض (DCA DMEs)، استخدم 17: 0 FAME (IS1) كما هو لالكمي (خلايا الأرجواني المظللة في الجدول مونومر؛ التكميلي ملفات 2/3). لمونومرات الهيدروكسيلية، بما في ذلك الكحولات الأولية، وحمض الفيرليك والأحماض ω-هيدروكسي، استخدم 15: 0 FAME 15-هيدروكسي (IS2) كما هو الاختيار لتقدير مجمع (خلايا خضراء shadded في الجدول مونومر، وملفات التكميلي 2/3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الوزن الجاف ورقة لكل تكرار لأعمدة AX-BA (ملف إضافي 2) أو AQ-AT (ملف إضافي 3)؛ بدلا من ذلك، فحص الأوراق لحساب المساحات السطحية وإضافة قيم منطقة إلى طاولة مونومر للتعبير عن الأحمال مونومر لكل وحدةمساحة السطح. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolyester+membranes+of+plants:+cutin+and+suberin.">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li><li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyesters+in+higher+plants.">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li><li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+plant+cuticles.">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li><li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis.">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li><li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin,+a+plant+barrier+biopolymer.">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li><li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis:+occurrence+of+octadeca-cis-6,+cis-9-diene-1,+18-dioate+as+the+major+component.">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li><li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin.">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li><li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li><li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds.">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li><li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl-lipid+metabolism.">Acyl-lipid metabolism.</a> The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).</li><li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana.">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li><li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development.">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 446 (2010).</li><li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry.">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li><li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+(L.)+Karst.,+Quercus+robur+L.,+and+Fagus+sylvatica+L.">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li><li>Riederer, M., Sch&#246;nherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin.">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li><li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis.">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li><li>Gra&#231;a, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins.">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li><li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I:+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle.">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li><li>Espelie, K. E., K&#246;ller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid,+a+novel+component+in+citrus+cutin.">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li><li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves.">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li><li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins.">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li><li>Holloway, P. J., Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical constitution of plant cutins. , 45-85 (1982).</li><li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle.">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

على عكس البوليمرات الحيوية الأخرى مثل الحمض النووي والبروتينات، ليست مصنوعة البوليستر الدهون النباتية من قالب. بدلا من ذلك، مؤلفاتهم تعتمد على خصوصية الإنزيمات الموجودة في الأنسجة التي تجعل من هذه البوليمرات خارج الخلية. كما يحلل هذا القبيل، كيميائي للناخب عناصر حاسمة لفهم تكوين البوليستر الدهون. الطرق الكيميائية ليلتصق السندات استر تشمل التصبين، hydrogenolysis، نقل الميثيل الحمضية المحفز، والمحفز قاعدة نقل الميثيل 2. كل منهم لديه مزايا وعيوب. التصبين تنتج حرة الأحماض الدهنية هيدروكسي التي يمكن أن تفاعلات الثانوية. Hydrogenolysis مع هيدريد الليثيوم الألمنيوم (LiAlH 4) 16 استخدمت لتحليل كوتين 7. Hydrogenolysis يقلل الكربون functionalized إلى الكحول وتحتاج الهياكل الأصلية ليتم الاستدلال على ذلك من خلال deuteriolysis مع ديوترايد الليثيوم الألومنيوم (LiAlD 4). العيب هذا النهج هو شرط عالية الدقة GC / MS لمقارنة درجة deuteriation من البوليولات الدهنية التي تم الحصول عليها لجعل المهام هياكلها. وقد أسترة حمض المحفزة مع المثيلي فلوريد البورون (BF 3) كثيرا ما تستخدم في كوتين وسوبيرين depolymerizations 8،17،18، ولكن رد الفعل لديه صلاحية محدودة ويمكن أن يعرض القطع الأثرية المقرر إلى جانب ردود الفعل 15. حامض الكبريتيك المثيلي ينتج أيضا استرات الميثيل للأحادية ولكن مع نسب أكبر من الأحماض الدهنية 2-هيدروكسي، التي يفترض أن لا مكونات البوليستر الدهون الحقيقية، بالمقارنة مع الطرق الأخرى 10. طريقة أسترة NaOMe المحفزة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج الأحماض الدهنية استرات الميثيل التي derivatized بواسطة silylation من مجموعات الهيدروكسيل، وتوفير مميزة أطياف الكتلة لتحديد الهوية، أو عن طريق أستلة لتوفير المشتقات أكثر استقرارا من مجموعات الهيدروكسيل FOص الكمي. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التحلل يتنافس مع أسترة عندما تكون المياه موجودة في رد الفعل. يتفاعل الماء مع NaOMe (المحفز) وتنتج هيدروكسيد الصوديوم، والذي بدوره تتحلمأ الدهنية استرات الميثيل لانتاج حامض الأحماض الحرة (الشكل 2D). هذا هو رد فعل الجانب غير مرغوب فيه لقمتين سوف يكون حاضرا لكل الأحماض الدهنية: استر الميثيل واستر مشتق TMSI، مما يعقد التحليل. باستخدام الكواشف اللامائية وإضافة خلات الميثيل بوصفه مشاركا من المذيبات للتنافس مع التصبين خطوات بالتالي حاسمة لمنع التحلل (الشكل 2D). كوتين وسوبيرين تحتوي على ما بين 1 و 26٪ الجلسرين 4. ومع ذلك، لن يتم الكشف عن هذه مونومر بسبب الظروف التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول. الجلسرين هو ماء للغاية، وعلى عكس الأحماض الدهنية أحادية استر الميثيل، سيتم القضاء خلال الخطوات المذيبات غسل المائية. هذا القيد أيضايمكن تحديد pplies إلى طرق التحلل كوتين أخرى، ولكن الجلسرين في الطبقة المائية التي تم الحصول عليها بعد أسترة باستخدام أسلوب الأنزيمية. بدلا من ذلك، يمكن قياسها كميا باستخدام أوضاع أكثر اعتدالا (على سبيل المثال، 0.05 M NaOMe) دون مزيد من استخراج المياه للكشف عن أحادية، بما في ذلك الجلسرين 19،20 .على الرغم من المفيد لغرض الجلسرين الكمي، ظروف معتدلة عادة ما تعطي التحلل غير الكامل للكوتين و سوبيرين. إذا كان GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا) هو متاح، جميع مكررات يمكن تحليلها في هذا الصك لأغراض الكمية، بعد أن تم التعرف على قمم عينة تمثيلية من قبل GC / MS. بدلا من ذلك، يمكن تحديد أحادية في GC / آثار ااا إذا عرفت مؤشرات الاحتفاظ بها. كاشف تأين اللهب لديه حساسية عالية خاصة ومجموعة واسعة من التناسب، وهو أمر حاسم لتقدير مكونات العينة الرئيسية والثانويةفي أشواط واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فمن قوي وسهل لصيانة وتشغيل 15. بروتوكول صفها يسمح للموثوقة وقابلة للتكرار العزلة، وتحديد، وتقدير حجم الدهون النباتية أحادية البوليستر، والسماح للتوصيف الكيميائي للطفرات التي تختلف في تكوين واحد أو أكثر من الدهون أحادية البوليستر. هذا الإجراء هو تحجيم، ويمكن أن تتكيف بسهولة لمعالجة كميات سواء الصغيرة والسائبة من مختلف المواد النباتية، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والسيقان والأزهار. وقد تم نشر البيانات الطيفية الجماعية للدهون أحادية البوليستر من العديد من الأنواع مثل، 21-26 وتشكل الموارد القيمة لتحديد أحادية غير معروفة عند التكيف مع هذا البروتوكول إلى الأنسجة و / أو الأنواع الأخرى. هذه الطريقة تنطبق على تحقيقات الحيوي، والتنظيم، وتوزيع البوليستر الدهون في النباتات العليا.

النباتات الوعائية تعتمد على طبقات الخلية التي تعمل كحواجز للماء بين الأنسجة النباتية والبيئة الخارجية. هذه الهياكل المرتبطة جدار الخلية محبة للدهون تقيد العدوى المسببة للأمراض وتنظم النقل السلبي من الغازات والماء والمواد الذائبة ويخرجون من الأنسجة النباتية 1. هذه الحواجز هي بشرة النبات، هيكل synapomorphic فريدة من نوعها للنباتات 2، ومختلف الحواجز نشر المحتوية على سوبيرين. بشرة طبقة أليف الزيت توليفها من قبل خلايا البشرة وملزمة لهم عبر طبقة pectinaceous على الجانب خارج الخلية من جدار الخلية 3-5. ذلك يغلف أجهزة جوية الأولية من النباتات العليا، يعمل كواجهة الحيوية بين أنسجة النبات والبيئة. كوتين، المصفوفة الهيكلية للبشرة، وسوبيرين نوعان من البوليستر glycerolipid غير قابلة للذوبان المرتبطة الشموع المذيبات القابلة للاستخراج 2،4. هذه ل البوليمروتتكون ipids المشبعة وغير المشبعة مشتقات حمض الدهنية وكلاهما هيكليا ووظيفيا مماثل. ومع ذلك، فهي تمييزها عن الاختلافات المميزة في تكوين وترسيب مواقع كيميائية. سوبيرين هو البوليستر الأليفاتية تقع داخل جدران الخلايا من بعض الأنسجة الخارجية والداخلية تشكيل الجدار الثانوي. وتشمل الأنسجة Suberized periderms الجذور والدرنات وأوراق الشجر، البشرة الداخلية الجذر، طبقات غلاف البذرة، والجروح تلتئم 2. على عكس كوتين، والبوليستر سوبيرين يحتوي عادة الكحول، المشبعة وغير المشبعة الأحماض أحادية ثنائي الكربوكسيل، ونسبة كبيرة من أحادية سلسلة طويلة جدا (C≥20). كوتين هو البوليستر الدهون الأكثر وفرة في النباتات الوعائية 6، ويتكون من الجلسرين وC16-C18 مشتقات الأحماض الدهنية interesterified، مثل هيدروكسي وهيدروكسي الايبوكسي استبدال الأحماض الدهنية 4. في حين أن تكوين البوليمرات كوتينيتفاوت بين الأنواع tracheophyte، وأحادية الأولية الأكثر الغالبة هي 10، 16 dihydroxy 16: 0، 18-هيدروكسي-9،10-الايبوكسي 18: 0، و9،10،18-trihydroxy 18: 0 الأحماض الدهنية. وتتألف ومن المثير للاهتمام، ورقة نبات الأرابيدوبسيس ووقف كوتين أساسا من 18: 2 حمض ثنائي الكربوكسيل 7،8. البشرة المصنع أيضا تقديم تفاوتا كبيرا في سماكة تتراوح من بضعة نانومتر إلى عدة ميكرومتر 9. منذ بشرة العزلة هي خطوة شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وخاصة بالنسبة البشرة ورقة رقيقة جدا مثل تلك التي من نبات الأرابيدوبسيس thaliana 8، وقد تم تطوير الأساليب التي تجاوز بشرة العزلة والتحقق من صحة 7،8. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لدراسة تكوين مونومر من كوتين في أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana التي كتبها ميثوكسيد الصوديوم (NaOMe) التحلل -catalyzed واللوني للغاز لاحق / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل. هذا البروتوكول يوفر وسيلة قوية لمعايرة المشاركوقد تم تكييف mposition من البوليستر الدهون النباتية في أنسجة delipidated كلها، ومن البروتوكولات ذكرت سابقا 7،10،11. عينات الأنسجة كلها هي أول المتجانس وdelipidated شامل، وإزالة الدهون المذيبات للاستخراج بما في ذلك جليدية والشموع epicuticular، والدهون غشاء، وtriacylglycerols. ثم يتم depolymerized خلية بقايا التخصيب الجدار إلى المكونة أحادية استر الميثيل من خلال الصوديوم المحفز ميثوكسيد تحلل الميثانول. يتم استخراج الدهنية استرات الميثيل الحمضية على تحمض، وderivatized للحصول على المقابلة trimethylsilyl أو الاسيتيل المشتقات. بقايا Derivatized متقلبة للغاية، ويمكن مزال من عمود اللوني للغاز عند درجة حرارة معقولة دون تغيير التشكل الهيكلي خلال تحليل GC / MS.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

يتم تعيين بروتوكول صفها في هذه المخطوطة إلى تحديد الدهون أحادية البوليستر، والتقليل من المساهمات من الدهون غير كوتين 10 الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن الفحص، والتي تأخذ تماما بين 8 (أي، كوتين أو سوبيرين.) - 10 أيام (من حصاد الأنسجة الأولي إلى الحصول على بيانات GC)، اعتمادا على كيفية عينات طويلة ويترك ليجف. والمحفزة قاعدة تحلل الميثانول مختارة (الشكل 2) طريقة ليزيل البلمرة البوليستر والتحقق من صحتها من قبل لبذور نبات الأرابيدوبسيس، والتي تحتوي على كل كوتين وسوبيرين. ويتجانس الخليط أولا الأنسجة وdelipidated شامل لإزالة الدهون المذيبات القابلة للاستخراج. العائد بقايا بعد الاستخراج، كنسبة مئوية من الوزن الطازج الأولي، وعادة ما يكون 6٪ لA. thaliana العقيد-0 الأوراق. يتم تجفيفها خلية بقايا التخصيب الجدار في مجفف فراغ ثم depolymerized إلى المكونة أحادية استر الميثيل من قبلالمحفز قاعدة نقل الميثيل. وقد تم اختيار اثنين ساعة الحضانة كما الوقت الحرج اللازم لالتحلل الصحيح واستعادة مكونات البوليستر الدهون. أسفرت مرات حضانة أطول في زيادة في الأحماض 2-هيدروكسي. هذه يحتمل أن تكون مستمدة من الإسفنجية غشاء 10. A اللوني نموذجي إذا ثبت نبات الأرابيدوبسيس النوع البري ورقة كوتين في الشكل 3، لO -TMSi المشتقات الأثير (الشكل 3A) ومشتقاتها O -acetyl (الشكل 3B). وقد تم تحديد كل الذروة من خلال المقارنة مع أطياف الشامل من الأدب 7،8 وقاعدة بيانات عامة يظهر 12. لدينا بروتوكول الفيديو كيفية تحضير مشتقات TMSI، ولكن يمكن بدلا من ذلك أن عينات الأسيتيل إلى derivatize مجموعات الهيدروكسيل. المشتقات Silylated جيدة لأغراض تحديد الهوية لأنها تعطي التشخيص أطياف الكتلة. ومع ذلك، المشتقات الأسيتيل هي أكثر استقرارا وبديل جيد لsilylationوقد تم تحديد أحادية كانت يوما 10. للمساعدة في تنفيذ هذا البروتوكول في المختبرات التي لا تملك إلا GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا)، GC / ااا آثار الموافق المشتقات الأسيتيل من WT أحادية رقة كوتين وإلى سلسلة homolog المعايير استر الأحماض الدهنية الميثيل ترد أيضا (الشكل التكميلي 4). هذا الأسلوب هو نوعي وبالكشف عن الاختلافات الكمية بين العينات، وبالتالي قيمته لتحليل متحولة. يتم تحديد مبالغ أحادية فردية باستخدام الطريقة المعيارية الداخلي الكمي، مما يتيح مقارنات فرة مونومر بين العينات. ينبغي توضيح ذلك، مع ذلك، أن حجم الذروة (مجموع التهم أيون) قد لا تعكس النسب المولية للأحادية في البوليستر. نحن بما في ذلك الجداول قابلة للتحرير أحادية لحساب كميات مونومر في أوراق نبات الأرابيدوبسيس كوتين كما الأحماض الدهنية استرات الميثيل ومشتقاتها TMSI (ملف إضافي 1)، أو الآس<html> المشتقات TYL (ملف إضافي 2) من الكحول. قد تحتاج إلى أن تتكيف إذا يتم استخراج عينات من أجهزة مختلفة أو أنواع النباتات هذه الجداول. وكمثال على ذلك، قمنا بتحليل نبات الأرابيدوبسيس تاليا غ كولومبيا (كو-0) أوراق النوع البري واثنين من الأليلات-اغية متحولة السمات التي تميزت سابقا من الجين CYP86A2 / ATT1، att1-1 (م-1) وatt1-2 (م-2 ) 13،14. monooxygenases السيتوكروم P450 من فصيلة CYP86A ترميز المفترضة oxydases ω وتشارك في سوبيرين وكوتين مونومر الحيوي. نتائجنا (الشكل 4) تبين تخفيضات كبيرة في كميات من ثلاثة أحادية الدهون كبيرة في الأوراق متحولة مقارنة الأوراق WT. واتساقا مع توقع وظيفة الإنزيم، 16: 0، 18: 2 و 18: 1 dicarboxylates تأثرت تحديدا في المسوخ att1. &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. نظرة عامة على تحليل الدهون البوليستر. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> الشكل 2. آلية للتفاعل نقل الميثيل NaOMe المحفزة. مهاجمة الأنيونات ميثوكسيد أليفة النواة الكربون cabonyl من البوليستر الدهون لتشكيل مستقر رباعي السطوح المتوسطة (A)، التي تنأى بسهولة إلى الأحماض الدهنية استرات الميثيل والأنيونات آلكوكسيد (B). هذه هي قواعد alkoxides المتقارن، وتتفاعل مع الميثانول، وتجديد الأنيونات ميثوكسيد ناشطة تحفيزيا، وبالتالي الحفاظ على ردود فعل التحلل إضافية (C). إذا كان الماء موجودا فيالنظام، وسوف تتفاعل مع ميثوكسيد الصوديوم لتكوين هيدروكسيد الصوديوم، قاعدة قوية تتحلمأ لا رجعة فيه استرات لإنتاج الأحماض الدهنية الحرة غير مرغوب فيها. يضاف خلات الميثيل بوصفه مشاركا المذيبات 15 لإزالة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم داخل منظومة (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> الشكل (3). الممثل مجموع اللوني ايون البرية من نوع أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana أحادية كوتين. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) الأثير و (B) مشتقات الهيدروكسيل خلات. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> </و&gt; <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> الرقم 4. كوتين تكوين مونومر من نبات الأرابيدوبسيس thaliana WT واثنين من الأليلات متحولة فارغة من الجين CYP86A2. (متحولة-1 = att1-1؛ متحولة-2 = att1-2) تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط ​​(ن = 4) . مقتبس من 13، بإذن من © دار نشر بلاكويل (2007). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> ويتم تحديد الشكل التكميلي 1. الذروة نتائج التكامل الجدول من GC / MS البرمجيات. قمم المقابلة لمونومرات المحددة والمعايير الداخلية التي كتبها retenti بهم<html> في الوقت المحدد (العمود C) ويتم جدولتها القيم منطقة في العمود D. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> التكميلي ملف 2. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات الأثير trimethylsilyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> التكميلي ملف 3. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات O -acetyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية).كوم / ملفات / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لتحميل هذا الملف. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> التكميلي الشكل 4. GC / آثار ااا من (AB) استر الأحماض الدهنية الميثيل (FAME) معايير مؤشر الاستبقاء (وصفت قمم مع كل المشبعة FAME طول السلسلة)؛ و (C) الأسيتيل A. thaliana WT رقة أحادية كوتين. الأرقام على ذروة تتوافق مع: 16: 0 FAME (1)، ferulate (2)، 18: 3 FAME (3)، 18: 18/01: 2 جوع (4)، 18: 0 FAME (5)، sinapate (6 ) 16: 0 DCA (7)، 16-OH 16: 0 FAME (8)، 18: 2 DCA (9)، 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11)، 18-OH 18: 2 FAME (12)، 18-OH 18: 1 FAME (13)، 20: 0 FAME (14)، 10،16-diOH 16: 0 FAME (15)، 24: 0 FAME (16). DCA: حمض ثنائي الكربوكسيل ميثيل استر. FAME: الدهنية استر الميثيل حامض. IS1: معيار الداخلية 1، 17: 0 FAME؛ IS2: الحادي الداخليandard 2، 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Views.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Chemistry

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

عزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليل التركيبي بواسطة الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائلة

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

استخدام متحولات eceriferum Arabidopsis لاستكشاف النبات البناء الحيوي البشرة

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

العزل الكيميائية والتقدير الكمي، وفصل الدهون الجلد من الزواحف

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Environment

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

استخراج اللجنين مع المحتوى العالي من β-س-4 استخراج الإيثانول معتدل وأثره على العائد ديبوليميريزيشن

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

تحليل شامل للالتركيبية جدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الأول : اللجنين

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana التنميط Glycerolipid القطبية التي اللوني طبقة رقيقة (TLC) اقترن اللوني الغاز السائل (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

العزلة ودراسة البيوفيزيائية البشرة من الفاكهة

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

عزل قطرات الدهون Plastoglobule من أنسجة أوراق النبات والبكتيريا الزرقاء

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...