This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Nota: Este protocolo fue adaptado de Buenaventura et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Los pasos 1-5 se resumen en la Figura 1. Eliminación de lípidos 1. Tejido Nota: Siempre enjuague toda la cristalería y las tapas con cloroformo, dejando seco bajo campana de extracción, antes de usar. PRECAUCIÓN: Realice homogeneización del tejido y todas las etapas de transferencia de disolvente bajo campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras para evitar el contacto directo con productos químicos y proteger las muestras de la contaminación. <ol><li> Baño de agua Precaliente y el bloque de calor a 85 ° C. </li><li> Pesar aproximadamente 0,5 g de cada muestra de hoja en mm x 125 tubos de ensayo de vidrio pesados ​​previamente 20 mm con politetrafluoroetileno (PTFE) tapones de rosca -faced. Incluya cuatro réplicas por muestra. </li><li> Coloque 2-propanol en un matraz Erlenmeyer (aproximadamente 125 ml; 25 ml por g de sample). Añadir 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol (también conocido como hidroxitolueno butilado, BHT) a una concentración final de 0,01% (w / v). Nota: Añadir BHT desde un 5% (w / v) solución madre en metanol (BHT ayuda a minimizar la oxidación de los ácidos grasos insaturados). </li><li> Precalentar solución de 2-propanol a 85 ° C en baño de agua. </li><li> Añadir 12 ml de disolvente caliente 2-propanol a cada tubo de muestra y el calor durante 15 min a 85 ° C en el bloque de calor. Este paso inactiva lipasas que pueden ser liberados de células rotas. </li><li> Deje que los tubos se enfríen a temperatura ambiente y moler el tejido a fondo con un homogeneizador hasta que se obtiene una suspensión homogénea. </li><li> Colocar las muestras en un agitador orbital y agitar durante 1-2 horas a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir un volumen igual de 2-propanol y agitar durante 12 horas a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 12 ml de CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) al residuo (25 ml por g de muestra) y agitar durante la noche a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 800 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir 12 ml de CHCl3: CH3OH (1: 2, v / v) al residuo y agitar durante la noche a 100 rpm y la temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 800 xg y eliminar el disolvente. </li><li> Deje que las muestras se secan bajo campana de humos durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Seque el residuo y luego se coloca en un desecador de vacío sobre CaCl 2 anhidro o CaSO 4 hasta peso constante se alcanza (3-5 días). </li></ol> 2. La despolimerización: metanolisis con metóxido de sodio (Figura 2) PRECAUCIÓN: Siga los pasos 2.3 a 2.4, 2.7 a 2.8, 2.10 a 2.11, 02.13 a 02.15 y de 02.17 a 02.18 bajo campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras. <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 60 ° C. </li><li> Pesar tubos de ensayo que contienen el residuo seco (importante para los cálculos posteriores). </li><li> Añadir estándares internos a cada tubo: 25 ωL heptadecanoato de metilo (1 mg / ml) y 25 l ω-pentadecalactona (1 mg / ml). </li><li> Añadir 0,9 ml de acetato de metilo, 1,5 ml de metóxido de sodio, y 3,6 ml de metanol a cada tubo y la tapa ellos. Alternativamente, preparar una mezcla de reacción con estos tres reactivos y añadir partes alícuotas de 6 ml a cada muestra. </li><li> Muestras de calor durante 2 horas a 60 ° C y agitar periódicamente en intervalos de 15 min. </li><li> Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 10 ml de dicloruro de metileno (CH 2 Cl 2) y 1,5 ml de ácido acético glacial para extraer los ésteres metílicos de ácidos grasos. </li><li> Añadir solución salina (NaCl 0,5 M) para llenar cada tubo y la tapa. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y se centrifuga durante 10 minutos a 800 x g. </li><li> Pasar la fase orgánica (inferior) para limpiar los tubos de tamaño mediano (16 x 125 tubos de ensayo de vidrio mm con politetrafluoroetileno (PTFE) tapón de rosca -faced). </li><li> Añadir solución salina (NaCl 0,5 M) para llenar cada tubo y la tapa. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y se centrifuga durante 10 minutos a 800 x g. </li><li> Retire fase acuosa (superior) y repita los pasos desde 2,11 hasta 2,12. </li><li> Quite toda la fase acuosa (superior). </li><li> Añadir sulfato sódico anhidro (Na 2 SO 4) para el disolvente, la tapa de los tubos, y de vórtice durante 1 min; muestras pueden ahora ser dejados hasta el día siguiente. En este punto las muestras se pueden dejar durante la noche bajo la campana de humos. </li><li> Centrifugar durante 2 min a 800 xg para compactar el Na 2 SO 4 de sal en la parte inferior. </li><li> Pasar la fase orgánica a un tubo desechable vaso pequeño (13 x 100 mm tubos de ensayo de vidrio con politetrafluoroetileno (PTFE) con tapón de rosca -faced). </li><li> Se evapora el disolvente a sequedad bajo nitrógeno y pasar a la etapa de derivatización. Si no se procesa inmediatamente, almacenar evaporó muestras a -20 ° C (muestras pueden ser unalso almacenado antes de la etapa de evaporación). </li></ol> 3. Preparación de derivados para cromatografía de gases PRECAUCIÓN: Realice los pasos 3.1.2 y 3.1.5 - 3.1.8 bajo una campana de humos; siempre use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad salpicaduras. <ol><li> Derivados trimetilsililo <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 100 ° C. </li><li> Añadir 100 ml de piridina y 100 l de BSTFA (N, O-trimetilsilil-Bis trifluoroacetamida) a cada tubo y la tapa ellos. </li><li> Muestras de calor a 100 ° C durante 10 minutos. </li><li> Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente. </li><li> Evaporar las muestras en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Evitar la aplicación de calor a las muestras, los monómeros son muy volátil en este momento. </li><li> Añadir 500 l de 1: 1 (v / v) de heptano: tolueno. </li><li> Muestras Vortex durante 1 min y centrifugar durante 2 minutos a 800 x g. </li><li> Añadir muestras a viales de GC y proceder al análisis mediante GC / MS. </li></ol></li><li> Acetiloderivados Nota: Para la acetilación, modificar pasos 3.1.1-3.1.3 por encima de la siguiente manera (no mostrado en video); 3.1.4-3.1.8 pasos son los mismos: <ol><li> Precaliente el bloque de calor a 60 ° C. </li><li> Añadir 100 l de piridina y 100 l de anhídrido acético (Ac 2 O) a los tubos. </li><li> Muestras de calor 1 hora a 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Análisis <ol><li> Utilice una columna HP-5 capilar (30 mx 0,25 mm x 0,25 m de espesor de película) o equivalente (es decir., 5% difenil, 95% dimetilpolisiloxano). Programa de la GC con flujo de gas portador de helio fijado en 1,5 ml / min y la temperatura del horno programada de 150 a 300 ° C a 3 ° C / min. </li><li> Utilice la inyección split (relación 01:10 split) y establecer espectrómetro de masas al modo escanear a través de 40-600 amu (ionización por impacto de electrones). </li><li> Crear una tabla de secuencia que incluye solvente (en blanco), WT y repeticiones mutantes, cada uno usando el método de análisis de la cutina se indica. </li><li> Disolvente de cargay viales de muestra en el carrusel, añadir hexano a viales de jeringa-lavado en el inyector automático si es necesario, y empezar la secuencia. Después de que se completó la secuencia, el total de trazas cromatograma de iones están disponibles para todas las muestras. </li></ol> Análisis 5. Datos <ol><li> Identificar monómeros de poliéster lípido comparando el espectro de masas de cada pico de publicada espectros de masas o buscando una biblioteca comercial si está disponible. </li><li> Para cada pico identificado en el cromatograma corriente iónica total, el uso de sus respectivos tiempos de retención para encontrar las áreas en la tabla de resultados de integración del software de GC / MS (Figura Suplementario 1). </li><li> Para cada monómero (columnas AB), agregue los valores de área se encuentran en la mesa de la integración (Figura Suplementario 1, columna D) a la columna correspondiente para cada replicar muestra en la tabla de Excel de monómeros (Archivo Suplementario 2, columnas CF), que es una hoja de cálculo para cuantificar Arabidopsisderivados cutina TMSi. Utilice Suplementario Archivo 3 si los derivados acetilados se preparan en su lugar. </li><li> Añadir las áreas de cada patrón interno (IS) a las columnas de SI (HK). Para aquellos monómeros que no están derivatizados, ésteres metílicos saber de ácidos grasos (FAME), y ésteres de dimetilo ácido dicarboxílicos (DCA EMD), utilice 17: 0 FAME (IS1) como está para cuantificación (células-púrpura sombreada en la tabla de monómero; Suplementario Archivos 2/3). Para monómeros hidroxilados, incluyendo alcoholes primarios, ácido ferúlico y ácidos ω-hidroxi, utilizar 15: 0 FAME 15-hidroxi (IS2) de IS de elección para la cuantificación compuesto (células verdes shadded en la tabla de monómero; Archivos Suplementario 2/3) . </li><li> Añadir peso de la hoja seca para cada replicar a las columnas AX-BA (Archivo Suplementario 2) o AQ-AT (Suplementario Archivo 3); alternativamente, escanear hojas para calcular áreas de superficie y añadir valores de área a la mesa de monómero de expresar cargas de monómero por unidad deárea de superficie. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

A diferencia de otros biopolímeros tales como ADN y proteínas, lípidos poliésteres planta no están hechos de una plantilla. En cambio, sus composiciones dependen de la especificidad de las enzimas presentes en los tejidos que hacen que estos polímeros extracelulares. Como analiza tal, química del componente componentes son fundamentales para entender la composición de poliéster de lípidos. Los métodos químicos para escindir enlaces éster incluyen saponificación, hidrogenolisis, transmetilación catalizada por ácido, y catalizada por base de transmetilación 2. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas. La saponificación produce hidroxi ácidos grasos libres que pueden sufrir reacciones secundarias. La hidrogenólisis con hidruro de litio y aluminio (LiAlH 4) 16 se ha utilizado para el análisis de la cutina 7. Hidrogenólisis reduce carbonos funcionalizados a los alcoholes y las estructuras originales deben ser inferida por deuteriolysis con deuteruro de litio y aluminio (LiAlD 4). losdesventaja de este enfoque es el requisito de alta resolución GC / MS para comparar el grado de deuteriation de los polioles grasos obtenidos de hacer las asignaciones de sus estructuras. Transesterificación catalizada por ácido con trifluoruro de boro en metanol (BF 3) se ha utilizado con frecuencia en cutina y suberina depolymerizations 8,17,18, pero el reactivo tiene una vida útil limitada y puede introducir artefactos debido a reacciones secundarias 15. Ácido sulfúrico metanólico también produce ésteres metílicos de los monómeros, pero con una mayor proporción de ácidos grasos 2-hidroxi, que presumiblemente no son verdaderos componentes de poliéster de lípidos, en comparación con otros métodos 10. El método de transesterificación catalizada por NaOMe descrito en este protocolo produce ésteres metílicos de ácidos grasos que se derivan mediante sililación de grupos hidroxilo, proporcionando espectros de masas característica para la identificación, o por acetilación para proporcionar derivados más estables de grupos hidroxilo for cuantificación. Un inconveniente de esta técnica es que la hidrólisis compite con transesterificación cuando el agua está presente en la reacción. El agua reacciona con NaOMe (el catalizador) y produce NaOH, que a su vez hidroliza ésteres metílicos de ácidos grasos para producir ácidos libres (Figura 2D). Esta es una reacción secundaria indeseable porque dos picos estarán presentes para cada ácido graso: un éster de metilo y un derivado de éster TMSi, lo que complica el análisis. El uso de reactivos anhidros y la adición de acetato de metilo como un co-disolvente para competir con la saponificación son por lo tanto cruciales pasos para evitar la hidrólisis (Figura 2D). Cutina y suberina contienen entre 1 y 26% de glicerol 4. Sin embargo, este monómero no será detectada por las condiciones experimentales descritas en este protocolo. El glicerol es altamente hidrofílico y, a diferencia de los monómeros de éster metílico de ácidos grasos, será eliminado durante los pasos de lavado de disolventes acuosos. Esta limitación también unaS e aplica a otros métodos de despolimerización cutina, pero glicerol se pueden determinar en la capa acuosa obtenida después de la transesterificación utilizando un método enzimático. Alternativamente, se puede cuantificar utilizando condiciones más suaves (por ejemplo., 0,05 M NaOMe) sin más la extracción de agua para detectar todos los monómeros, incluyendo glicerol 19,20 .Aunque útiles para el propósito de la cuantificación de glicerol, condiciones suaves suelen dar despolimerización incompleta de la cutina y suberina. Si un GC acoplado a un detector de ionización de llama (FID) está disponible, todas las repeticiones pueden ser analizados en este instrumento con fines cuantitativos, después de los picos de una muestra representativa han sido identificados por GC / MS. Alternativamente, los monómeros en los GC / FID huellas se pueden identificar si se conocen sus índices de retención. El detector de ionización de llama tiene especialmente una alta sensibilidad y una amplia gama de proporcionalidad, que es crítico para la cuantificación de mayores y menores componentes de la muestraen carreras individuales. Además, es robusto y fácil de mantener y operar 15. El protocolo descrito permite la fiable y reproducible aislamiento, la identificación y la cuantificación de monómeros de poliéster de lípidos de la planta, lo que permite la caracterización química de los mutantes que difieren en la composición de uno o más monómeros de poliéster de lípidos. El procedimiento es escalable, puede ser fácilmente adaptado para procesar tanto pequeñas como cantidades a granel de diversos materiales de plantas, incluyendo semillas, raíces, hojas, tallos y flores. Datos espectrales de masa de monómeros de poliéster de lípidos de muchas especies se han publicado, por ejemplo., 21-26 y constituyen valiosos recursos para identificar monómeros desconocidos al adaptar este protocolo a otros tejidos y / o especies. Este método es aplicable a las investigaciones de la biosíntesis, regulación y distribución de poliésteres de lípidos en las plantas superiores.

Las plantas vasculares se basan en capas extracelulares que funcionan como barreras impermeables entre tejidos de las plantas y el medio ambiente externo. Estas estructuras de la pared asociada de células lipófilo restringen la infección patógena y regulan el transporte pasivo de los gases, el agua y las sustancias disueltas dentro y fuera de los tejidos vegetales 1. Estas barreras son la cutícula de la planta, una estructura synapomorphic única de plantas 2, y diferentes barreras de difusión que contiene suberina. La cutícula es una capa oleófilo sintetizado por las células epidérmicas y unido a ellos a través de una capa pectináceo en el lado extracelular de la pared celular 3-5. Se recubre los órganos aéreos primarios de las plantas superiores, que funciona como una interfaz vital entre tejidos de las plantas y el medio ambiente. Cutina, la matriz estructural de la cutícula, y suberina son dos poliésteres glicerolípido insolubles asociados con ceras disolvente extraíbles 2,4. Estos l poliméricoipids se componen de derivados de ácidos grasos saturados e insaturados y son tanto estructural como funcionalmente similar. Sin embargo, son distinguibles por diferencias características en los sitios de composición y deposición química. Suberina es un poliéster alifático situado dentro de las paredes celulares de ciertos tejidos internos y externos que forman una pared secundaria. Tejidos suberizadas incluyen periderms de raíces, tubérculos y cortezas de árboles, endodermis de la raíz, capas de revestimiento de semillas, y las heridas cicatrizadas 2. A diferencia de la cutina, el poliéster suberina típicamente contiene alcoholes saturados y ácidos dicarboxílicos mono-insaturados, y una gran proporción de los monómeros de cadena muy larga (C≥20). Cutina es el más abundante de poliéster de lípidos en plantas vasculares 6, y se compone de glicerol y C16-C18 derivados de ácidos grasos interesterificada, tales como ácidos grasos hidroxi e hidroxi-epoxi sustituido 4. Mientras que la composición de polímeros cutinavaría entre especies tracheophyte, los monómeros primarios más predominantes son 10, 16-dihidroxi 16: 0, 18-hidroxi-9,10-epoxi 18: 0 y 9,10,18-trihidroxi 18: 0 ácidos grasos. Curiosamente, Arabidopsis hoja y tallo cutina se componen principalmente de 18: 2 de ácido dicarboxílico 7,8. Cutículas vegetales también presentan una variabilidad considerable en el espesor, que van desde unos pocos nanómetros a varios micrómetros 9. Desde el aislamiento de la cutícula es un paso laborioso y consume mucho tiempo, en particular para las cutículas de hojas muy delgadas, tales como los de Arabidopsis thaliana 8, los métodos que evitan el aislamiento de la cutícula se han desarrollado y validado 7,8. Aquí se describe un protocolo detallado para estudiar la composición de monómeros de cutina en hojas de Arabidopsis thaliana por metóxido sódico (NaOMe) despolimerización catalizada y / espectrometría de masas cromatografía de gases subsiguiente (GC / MS) análisis. Este protocolo ofrece un método robusto para ensayar la composition de poliésteres de lípidos en los tejidos de plantas deslipidada enteros, y ha sido adaptado de protocolos previamente reportados 7,10,11. Muestras de tejidos enteros son primero homogeneizada y exhaustivamente sin lípidos, la eliminación de los lípidos en disolventes extraíble incluyendo cuticular y ceras epicuticulares, lípidos de membrana, y triglicéridos. Residuos de la pared enriquecida de células son luego despolimerizan en sus monómeros de éster de metilo de sodio constituyentes por metanolisis catalizada por metóxido. Grasos ésteres metílicos de ácidos se extraen tras la acidificación, y derivatizarse para obtener sus derivados trimetilsililo o acetilo correspondientes. Residuos derivatizados son muy volátiles, y pueden eluirse de una columna de cromatografía de gases a una temperatura razonable sin alterar su conformación estructural durante el análisis GC / MS.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

El protocolo se describe en este manuscrito está configurado para determinar monómeros de poliéster de lípidos, reduciendo al mínimo las contribuciones de lípidos no cutina 10 Figura 1 presenta una visión general del ensayo, que tiene en total entre 8 (es decir, cutina o suberina.) -. 10 día (desde la recolección inicial del tejido a la obtención de los datos de GC), dependiendo de cómo de largo muestras se dejan secar. El método para despolimerizar poliésteres metanolisis catalizada por una base seleccionada (Figura 2) fue validado previamente para semillas de Arabidopsis, que contienen tanto la cutina y suberina. Los tejidos se homogeneizaron primera y exhaustivamente delipidated para eliminar los lípidos extraíbles con disolventes. El rendimiento residuo después de la extracción, como porcentaje del peso fresco inicial, es por lo general un 6% para A. thaliana Col-0 hojas. Residuos de la pared enriquecida de células se secan en un desecador de vacío y luego despolimerizan en sus monómeros de éster de metilo por constituyentescatalizada por base de transmetilación. Incubación de dos horas fue elegido como el momento crítico requerido para la despolimerización y recuperación de componentes de poliéster de lípidos adecuada. Tiempos de incubación más largos dieron lugar a aumento de los ácidos 2-hidroxi; éstos potencialmente derivan de esfingolípidos membrana 10. Un cromatograma típico si Arabidopsis de tipo salvaje de la hoja cutina se muestra en la Figura 3, para los derivados O -TMSi éter (Figura 3A) y los derivados O acetil (Figura 3B). Cada pico fue identificado por comparación con los espectros de masas de la literatura 7,8 y una base de datos pública 12 protocolo de vídeo .Our muestra cómo preparar derivados TMSi, pero las muestras, alternativamente, puede ser acetilado para derivatizar grupos hidroxilo. Derivados sililados son buenas para fines de identificación porque dan espectros de masas de diagnóstico. Sin embargo, los derivados acetilados son más estables y una buena alternativa a sililaciónmonómeros una vez se han identificado 10. Para ayudar a implementar este protocolo en los laboratorios que sólo han GC acoplado al detector de ionización de llama (FID), GC / FID rastros correspondientes a derivados acetilados de WT monómeros hoja cutina y a una serie de homólogos de las normas de ésteres metílicos de ácidos grasos son también muestra (Figura Suplementario 4). Este método es cualitativo y detecta diferencias cuantitativas entre las muestras, por lo tanto, su valor para el análisis de mutantes. Las cantidades de monómeros individuales se determinan utilizando el método estándar interno de cuantificación, lo que permite comparaciones de la abundancia de monómero entre las muestras. Debe aclararse, sin embargo, que el tamaño máximo (recuento total de iones) puede no reflejar las relaciones molares de los monómeros en el poliéster. Estamos incluyendo tablas editables de monómeros para calcular cantidades de monómero en la hoja de Arabidopsis cutina como ésteres metílicos de ácidos grasos y derivados TMSi (Archivo Suplementario 1), o as<html> derivados tyl (Archivo Suplementario 2) de los alcoholes. Estas tablas pueden necesitar ser adaptados si las muestras se extraen de diferentes órganos o especies de plantas. A modo de ejemplo, hemos analizado Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) hojas de tipo salvaje y dos alelos nulos mutante previamente caracterizados del gen CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) y att1-2 (m-2 ) 13,14. Monooxigenasas del citocromo P450 de la subfamilia CYP86A codifican putativos omega-oxidasas y participa en suberina y la biosíntesis de monómero cutina. Nuestros resultados (Figura 4) demuestran reducciones significativas en las cargas de los tres principales monómeros de lípidos en las hojas mutantes en comparación con las hojas WT. En consonancia con la función de la enzima predicho, 16: 0, 18: 2, y 18: 1 dicarboxilatos se vieron afectados específicamente en los mutantes Att1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Visión general de análisis de poliéster de lípidos. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figura 2. Mecanismo de la reacción de transmetilación catalizada por NaOMe. Los aniones nucleófilos metóxido atacar el carbono cabonyl de poliésteres de lípidos para formar una inestable intermedio tetraédrico (A), que se disocia fácilmente en ésteres metílicos de ácidos grasos y aniones alcóxido (B). Estos alcóxidos son bases conjugadas, y reaccionan con metanol, la regeneración de los aniones metóxido catalíticamente activos, sosteniendo así reacciones de despolimerización adicionales (C). Si el agua está presente en elsistema, reaccionará con metóxido de sodio para formar hidróxido de sodio, una base fuerte que hidroliza irreversiblemente ésteres para producir ácidos grasos libres indeseables. Acetato de metilo se añade como un co-disolvente 15 para eliminar pequeñas cantidades de hidróxido de sodio en el sistema (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figura 3. Representante cromatograma iónico total de tipo salvaje de la hoja de Arabidopsis thaliana monómeros cutina. (A) O trimetilsilil (TMSi) éter y derivados hidroxilo de etilo (B). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </a&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figura 4. cutina composición de monómero de WT Arabidopsis thaliana y dos alelos mutantes nulos del gen CYP86A2. (Mutante-1 = att1-1; mutante-2 = att1-2) Las barras de error representan la desviación estándar de la media (n = 4) . Adaptado de 13, con el permiso de © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Adicional Figura 1. Pico resultados integración tabla de la GC de software / MS. Los picos correspondientes a los monómeros identificados y normas internas se identifican por su retenti<html> a tiempo (columna C) y valores de área se tabulan en la columna D. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Suplementario Archivo 2. Tabla de Arabidopsis monómeros cutina (derivados de éter trimetilsilil de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxi). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Suplementario Archivo 3. Tabla de Arabidopsis monómeros cutina (derivados O acetil de ésteres metílicos de ácidos grasos hidroxi).com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para descargar este archivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Adicional Figura 4. GC / FID rastros de (AB) de éster metílico de ácido graso (FAME) estándares índice de retención (picos están etiquetados con cada longitud de cadena saturada FAME); y (C) acetilado A. thaliana hoja WT monómeros cutina. Números en pico corresponden a: 16: 0 FAME (1), ferulato (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-diOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dimetil éster del ácido dicarboxílico; FAME: éster metílico de ácidos grasos; IS1: estándar interno 1, 17: 0 FAME; IS2: st internaAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K vistas.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Investigación

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

El uso de mutantes de Arabidopsis eceriferum para explorar Biosíntesis planta de cutícula

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biología

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

Aislamiento químico, cuantificación y separación de los lípidos de la piel de los Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Medio ambiente

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Extracción de la lignina con alto contenido de β-O-4 por la extracción de etanol suave y su efecto sobre el rendimiento de despolimerización

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

El aislamiento y estudio biofísico de las cutículas de fruta

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...