This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Hinweis: Dieses Protokoll wurde von Bonaventure et al angepasst. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Schritte 1-5 sind in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Tissue Delipidierung Hinweis: Spülen Sie alle Glaswaren und Mützen mit Chloroform, ließ trockenen unter Abzug, vor der Verwendung. ACHTUNG: Führen Sie Gewebehomogenisierung und alle Lösungsmittel-Transferschritte unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille, um den direkten Kontakt mit Chemikalien zu vermeiden und um die Proben vor Verunreinigung zu schützen. <ol><li> Vorheizen Wasserbad und Heizblock auf 85 ° C. </li><li> Ein Gewicht von etwa 0,5 g jeder Blattprobe in vorgewogene 20 mm x 125 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubverschlüssen. Fügen Sie vier Wiederholungen pro Probe. </li><li> Platzieren 2-Propanol in einem Erlenmeyerkolben (etwa 125 ml; 25 ml pro g sample). Hinzufügen von 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (auch als butyliertes Hydroxytoluol, BHT bezeichnet) zu einer Endkonzentration von 0,01% (w / v). Anmerkung: BHT Hinzufügen von einem 5% (w / v) Stammlösung in Methanol (BHT trägt zur Minimierung Oxidation ungesättigter Fettsäuren). </li><li> Vorheizen 2-Propanol-Lösung auf 85 ° C im Wasserbad. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml heißem 2-Propanol-Lösungsmittel zu jedem Probenröhrchen und Hitze für 15 Minuten bei 85 ° C im Heizblock. Dieser Schritt inaktiviert Lipasen, die aus zerstörten Zellen freigesetzt werden können. </li><li> Lassen Rohre abkühlen auf Raumtemperatur und schleifen Gewebe gründlich mit Homogenisator, bis eine homogene Suspension entstanden ist. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Orbitalschüttler und schütteln Sie für 1-2 Stunden bei 100 UpM und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen 2-Propanol und schütteln für 12 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> In 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) bis zu dem Rest (25 ml pro g Probe) und schüttelt über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) bis Rest und schütteln über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Lassen Proben trocknen unter Abzug Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Der Luft trocknen den Rückstand und legen Sie dann in einem Vakuumexsikkator über wasserfreiem CaCl 2 oder CaSO 4 bis zur Gewichtskonstanz (3-5 Tage) erreicht ist. </li></ol> 2. Depolymerisation: Methanolyse mit Natriummethoxid (Abbildung 2) ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 2,3 bis 2,4, 2,7 bis 2,8, 2,10 bis 2,11, 2,13 bis 2,15 und 2,17 bis 2,18 unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> Wiegen Teströhrchen mit dem trockenen Rückstand (wichtig für die weiteren Berechnungen). </li><li> In internen Standards in jedes Röhrchen: 25 &amp; omega; L Methyl heptadecanoate (1 mg / ml Stamm) und 25 &amp; mgr; l ω-Pentadecalacton (1 mg / ml Stamm). </li><li> In 0,9 ml Essigsäuremethylester, 1,5 ml Natriummethylat und 3,6 ml Methanol zu jedem Röhrchen und diese abschließen. Alternativ bereiten eine Reaktionsmischung mit diesen drei Reagenzien und fügen 6-ml-Teilmengen zu jeder Probe. </li><li> Wärme Proben für 2 Stunden bei 60 ° C und Vortex periodisch in Intervallen von 15 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> 10 ml Methylenchlorid (CH 2 Cl 2) und 1,5 ml Eisessig, um die Fettsäuremethylester zu extrahieren. </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase (unten) bis mittlere saubere Röhrchen (16 x 125 mm Glasröhrchen mit PolyTetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Phase und wiederholen Sie die Schritte von 2,11 bis 2,12. </li><li> Entfernen Sie das gesamte wässrige (obere) Phase. </li><li> Wasserfreies Natriumsulfat (Na 2 SO 4) zu dem Lösungsmittel, Verschließe die Röhrchen und Wirbel für 1 min; Proben können nun bis zum nächsten Tag gelassen werden. An dieser Stelle Proben können über Nacht im Abzug belassen werden. </li><li> Zentrifugieren für 2 Minuten bei 800 · g, um die Na &amp; sub2; SO &amp; sub4; -Salz im Boden zu verdichten. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase zu einem kleinen Glaseinwegrohr (13 x 100 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> Man dampft das Lösungsmittel zur Trockene unter Stickstoff und fahren mit dem Derivatisierungsschritt. Wenn nicht sofort verarbeitet, eingedampft Proben bei -20 ° C (Proben kann eine sein,lso vor dem Verdampfungsschritt gespeichert). </li></ol> 3. Herstellung von Derivaten für die Gaschromatographie ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 3.1.2 und 3.1.5 - 3.1.8 unter einer Abzugshaube; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Trimethylsilylderivate <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 100 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul BSTFA (N, O-Bis-trimethylsilyl trifluoracetamid) in jedes Röhrchen und diese abschließen. </li><li> Wärme Proben bei 100 ° C für 10 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> Verdampfen Proben unter Stickstoff bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie die Anwendung von Wärme, um Proben, sind Monomere sehr volatil in diesem Stadium. </li><li> Gib 500 ul einer 1: 1 (V / V) Heptan: Toluol. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 2 min bei 800 x g. </li><li> Proben, die GC-Vials hinzufügen und fahren Sie mit GC / MS-Analyse. </li></ol></li><li> AcetylDerivate Hinweis: Zur Acetylierung ändern Schritte 3.1.1-3.1.3 oben wie folgt (nicht im Video gezeigt); Schritte 3.1.4-3.1.8 sind die gleichen: <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul Essigsäureanhydrid (Ac 2 O) in die Röhrchen. </li><li> Wärme Proben 1 Stunde bei 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS-Analyse <ol><li> Verwenden Sie ein HP-5-Kapillarsäule (30 mx 0,25 mm x 0,25 um Filmdicke) oder gleichwertig (dh., 5% Diphenyl, 95% Dimethylpolysiloxan). Programmieren Sie die GC mit Helium-Trägergasstrom von 1,5 ml / min eingestellt und die Ofentemperatur von 150 bis 300 ° C bei 3 ° C / min programmiert. </li><li> Verwenden Teileinspritzung (Splitverhältnis 1:10), und legen Massenspektrometer-Modus über 40 bis 600 amu (Elektronenstoß-Ionisation) scannen. </li><li> Erstellen Sie eine Sequenztabelle einschließlich Lösungsmittel (blank), WT und Mutanten-Wiederholungen, jeder mit dem angegebenen Cutin Analyseverfahren. </li><li> Last Lösungsmittelund Probenfläschchen auf dem Karussell, fügen Hexan Spritzenspülung Fläschchen in den Autosampler wenn nötig, und starten Sie die Sequenz. Nachdem die Sequenz vollendet ist, sind insgesamt Ionenchromatogramm Spuren für alle Proben zur Verfügung. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Identifizieren Lipid-Polyester-Monomere durch den Vergleich der einzelnen Spitzenmassenspektrum zu veröffentlichten Massenspektren oder durch die Suche Kommerzielle Bibliothek, falls verfügbar. </li><li> Für jedes identifizierte Peak im Gesamtionenstrom-Chromatogramm, verwenden ihre jeweiligen Retentionszeiten, die Bereiche auf der Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software (Supplemental Abbildung 1) zu finden. </li><li> Für jedes Monomer (Spalten AB), fügen Sie die Bereichswerte im Integrationstabelle (Supplemental Abbildung 1, Spalte D) festgestellt, dass die entsprechende Spalte für jeden replizieren Probe in der Excel-Tabelle von Monomeren (Supplemental Datei 2, Spalten CF), das ist eine Tabellenkalkulation, um Arabidopsis zu quantifizierenCutin TMSi Derivate. Verwenden STADT Datei-3, wenn acetylierten Derivaten anstelle vorbereitet. </li><li> Fügen die Bereiche der internen Standards (IS) an den IS-Säulen (HK). Für jene Monomere, die nicht derivatisiert sind, nämlich Fettsäuremethylester (FAME) und Dicarbonsäuredimethylester (DCA DME), verwenden 17: 0 FAME (IS1), wie es für die Quantifizierung (violett schattierten Zellen in der Monomer-Tabelle; Supplemental Files 3.2). Für hydroxylierten Monomeren, einschließlich primäre Alkohole, Ferulasäure und ω-Hydroxysäuren, verwenden 15: 0 15-Hydroxy FAME (IS2), wie der Wahl für die Verbindung, die Quantifizierung (grün-shadded Zellen in der Monomer-Tabelle; Zusatzdateien 2/3) . </li><li> In trockenen Flügelgewicht für jede Wiederholung, um Spalten AX-BA (Supplemental Datei 2) oder AQ-AT (Supplemental Datei-3); Alternativ scannen Blätter Flächen berechnen und fügen Bereich Werte in das Monomer Tabelle Monomers Lasten pro Einheit zum Ausdruck bringenOberfläche. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Im Gegensatz zu anderen Biopolymeren wie DNA und Proteine ​​werden Pflanzenlipid Polyester nicht aus einer Vorlage hergestellt. Stattdessen ihre Kompositionen sind abhängig von der Spezifität der in den Geweben, die diese extrazellulären Polymeren machen vorhandenen Enzyme. Als solche chemischen Analysen der einzelnen Komponenten sind wichtig, um Lipidpolyestermasse zu verstehen. Chemische Verfahren, um Esterbindungen zu spalten, umfassen Verseifung, Hydrogenolyse, sauer katalysierte Transmethylierung und basenkatalysierte Trans 2. Jede von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Verseifung produziert freie Fettsäure-Hydroxy-Säuren, die Nebenreaktionen eingehen können. Hydrogenolyse mit Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH 4) 16 für Cutin Analyse 7 verwendet. Hydrogenolyse reduziert funktionalisierten Kohlenstoffatomen zu Alkoholen und die ursprünglichen Strukturen müssen durch deuteriolysis mit Lithiumaluminiumdeuterid (LiAlD 4) zu entnehmen. DasNachteil dieser Vorgehensweise ist das Erfordernis hoher Auflösung GC / MS, den Grad der Deuterierung der Fett Polyolen Zuordnungen ihrer Strukturen bilden zu vergleichen. Säure-katalysierte Umesterung mit methanolischer Bortrifluorid (BF 3) ist mehrfach in Cutin und Suberin Depolymerisationen 8,17,18 verwendet, aber das Reagenz hat eine begrenzte Lagerfähigkeit und kann zu Artefakten aufgrund von Reaktionen 15 her einzuführen. Methanolischer Schwefelsäure ergibt auch Methylester von den Monomeren, aber mit größeren Anteilen von 2-Hydroxy-Fettsäuren, die vermutlich nicht wahr sind Lipidpolyesterkomponenten im Vergleich zu anderen Verfahren 10. Die in diesem Protokoll beschrieben NaOMe-katalysierten Umesterungsverfahren produziert Fettsäuremethylester, die durch Silylierung der Hydroxylgruppen derivatisiert sind, wodurch charakteristische Massenspektren zur Identifizierung oder durch Acetylierung, stabilere Derivate von Hydroxylgruppen fo liefernr Quantifizierung. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Hydrolyse in Konkurrenz Umesterung, wenn Wasser in der Reaktion vorhanden ist. Wasser reagiert mit NaOMe (den Katalysator) und erzeugt NaOH, was wiederum hydrolysiert Fettsäuremethylestern zu freien Säuren (2D) zu erhalten. Dies ist eine unerwünschte Nebenreaktion, weil zwei Peaks für jede Fettsäure vorhanden sein: einem Methylester und einem TMSi Esterderivat, so verkomplizieren die Analyse. Verwendung von wasserfreien Reagenzien und Zugabe von Methylacetat als ein Co-Lösungsmittel mit Verseifung konkurrieren somit entscheidenden Schritte zur Hydrolyse (2D) zu verhindern. Cutin und Suberin enthalten zwischen 1 und 26% Glycerin 4. Jedoch wird dieses Monomer nicht durch die in diesem Protokoll beschriebenen Versuchsbedingungen festgestellt werden. Glycerin ist stark hydrophil und im Gegensatz zu den Fettsäuremethylester-Monomeren, während das wässrige Lösungsmittel-Waschschritte eliminiert werden. Diese Einschränkung auch einpplies zu anderen Cutin Depolymerisationsverfahren, aber Glycerin in der wässrigen Phase nach der Umesterung unter Verwendung eines enzymatischen Verfahrens erhalten bestimmt werden. Alternativ kann sie unter Verwendung von milderen Bedingungen ohne weitere Wasserentnahme quantifiziert werden (z. B. 0,05 M NaOMe), um alle Monomere zu detektieren, einschließlich Glycerin 19,20 .Obwohl zwecks Quantifizierung Glycerin nützlich milden Bedingungen in der Regel geben unvollständige Depolymerisation von Cutin und Suberin. Wenn ein GC zu einem Flammenionisationsdetektor (FID) angeschlossen ist, verfügbar sind, können alle Wiederholungen in diesem Instrument zur quantitativen Zwecken ausgewertet werden, wonach Peaks einer repräsentativen Probe wurden durch GC / MS identifiziert. Alternativ können Monomere in den GC / FID Spuren identifiziert, wenn ihre Retentionsindizes bekannt sind. Der Flammenionisationsdetektor eine besonders hohe Empfindlichkeit und eine breite Palette der Verhältnismäßigkeit, der entscheidend für die Quantifizierung von größeren und kleineren Probenkomponenten istin einzelnen Läufen. Darüber hinaus ist es robust und einfach zu warten und zu bedienen 15. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung von pflanzlichen Lipid Polyestermonomere, wodurch die chemische Charakterisierung der Mutanten, die in der Zusammensetzung von einer oder mehreren Lipid Polyestermonomere abweichen. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht angepasst werden, um sowohl kleine als auch größere Mengen von verschiedenen Pflanzenmaterialien, einschließlich Wurzeln, Samen, Blätter, Stängel und Blüten zu verarbeiten. Massenspektraldaten von Lipid Polyestermonomere aus vielen Spezies wurden veröffentlicht z. B. 21-26 und stellen wertvolle Mittel zur unbekannten Monomere zu identifizieren, wenn eine Anpassung dieses Protokoll auf andere Gewebe und / oder Spezies. Dieses Verfahren ist anwendbar auf Untersuchungen der Biosynthese, Regelung und Verteilung von Lipid Polyestern in höheren Pflanzen.

Gefäßpflanzen verlassen sich auf extrazellulären Schichten, die als wasserdichte Barrieren zwischen Pflanzengewebe und der äußeren Umgebung zu funktionieren. Diese lipophilen Zellwand-assoziierten Strukturen beschränken pathogenen Infektionen und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelöste Stoffe in und aus Pflanzengeweben 1. Solche Barrieren sind die Kutikula, einem synapomorphic Struktur einzigartige Pflanzen 2 und verschiedenen Suberin haltigen Diffusionsbarrieren. Das Häutchen eine oleophile Schicht durch epidermale Zellen synthetisiert und an sie gebunden über eine pektinösen Schicht auf der extrazellulären Seite der Zellenwand 3-5. Er umhüllt die primären Luft Organe höherer Pflanzen, die als eine vitale Schnittstelle zwischen Pflanzengewebe und die Umwelt. Cutin, die Strukturmatrix der Kutikula und Suberin gibt zwei unlöslichen Glycerolipid Polyester mit Lösungsmittel extrahierbaren Wachse 2,4 verbunden. Diese polymeren lipids sind aus gesättigten und ungesättigten Fettsäurederivaten besteht und sowohl strukturell als auch funktionell ähnlich. Jedoch sind sie unterscheidbar durch charakteristische Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung und die Abscheidungsstellen. Suberin ein aliphatischer Polyester ist in den Zellwänden bestimmter äußeren und inneren Geweben Bildung einer Sekundärwand. Korkartige Gewebe schließen periderms von Wurzeln, Knollen und Baumrinde, Wurzeln Endodermis, Samenschale Schichten und geheilten Wunden 2. Im Gegensatz Cutin, Suberin enthält der Polyester in der Regel Alkohole, gesättigte und mono-ungesättigten Dicarbonsäuren, und einen großen Anteil der sehr langkettigen Monomeren (C≥20). Cutin ist das häufigste Lipid Polyester in Gefäßpflanzen 6 und wird von Glycerin und C16-C18 umgeesterten Fettsäurederivate wie Hydroxy und Hydroxy-Epoxy-substituierten Fettsäuren 4 besteht. Während die Zusammensetzung der Cutin Polymerenvariiert über tracheophyte Arten, die vorherrschende Primär Monomere sind 10, 16-Dihydroxy 16: 0, 18-Hydroxy-9,10-Epoxy-18: 0 und 9,10,18-Trihydroxy 18: 0-Fettsäuren. 2 Dicarbonsäure 7,8: Interessant ist, dass Arabidopsis Blatt und Stamm Cutin hauptsächlich aus 18 zusammengesetzt ist. Pflanzen cuticles präsentieren auch eine beträchtliche Variabilität in der Dicke im Bereich von wenigen Nanometern bis einigen Mikrometern. 9 Da Kutikula Isolation ist ein mühsamer und zeitraubender Schritt, insbesondere für sehr dünne Blatt cuticles wie die von Arabidopsis thaliana 8. Verfahren, die Kutikula Isolierung umgehen, wurden entwickelt und validiert 7,8. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll, um die Monomerzusammensetzung von Cutin in Arabidopsis thaliana Blätter von Natriummethylat (NaOMe) -katalysierte Depolymerisation und anschließender Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS) Analyse zu studieren. Dieses Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung der ZusammenarbeitmPosition von Pflanzenlipid Polyester ganz delipidiertem Gewebe und hat sich von früher berichteten Protokolle 7,10,11 angepasst. Whole Gewebeproben werden zunächst homogenisiert und abschließend delipidierten, Entfernen von Lösungsmittel extrahierbaren Lipide einschließlich Kutikula und epikutikulären Wachse, Membranlipiden und Triacylglyceride. Zellwand-angereicherten Reste werden dann von Natriummethoxid-katalysierten Methanolyse in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiert. Fettsäuremethylester werden nach Ansäuerung extrahiert, derivatisiert werden, um ihre entsprechenden Trimethylsilyl oder Acetyl-Derivaten erhalten. Derivatisierte Reste sind stark flüchtig und können aus einer Gaschromatographiesäule zu einem angemessenen Temperatur ohne Veränderung ihrer strukturellen Konformation während der GC / MS-Analyse eluiert werden.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll wird bis zu Lipid Polyester-Monomere bestimmen, eingestellt und minimiert die Beiträge von Nicht Cutin Lipide 10 Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Test, die insgesamt dauert zwischen 8 (dh Cutin oder Suberin.) -. 10 Tage (von der ersten Gewebeernte auf den Erhalt GC-Daten), je nachdem wie lange Proben trocknen gelassen. Der ausgewählte basenkatalysierte Methanolyse (Abbildung 2) Verfahren, um Polyester zu depolymerisieren, wurde zuvor für Arabidopsis Samen, die sowohl Cutin und Suberin enthalten validiert. Die Gewebe werden zuerst homogenisiert und abschließend delipidierten um Lösungsmittel extrahierbaren Lipide zu entfernen. Der Rückstand Ausbeute nach der Extraktion, als Prozentsatz der anfänglichen Frischgewicht, ist in der Regel 6% für A. thaliana Col-0 Blättern. Zellwand angereicherte Reste sind in einem Vakuumexsikkator getrocknet und dann durch in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiertbasenkatalysierte Trans. Zweistündigen Inkubation wurde als die kritische Zeit für die ordnungsgemäße Depolymerisation und Rückgewinnung von Lipid-Polyester-Komponenten erforderlich gewählt. Längere Inkubationszeiten führten zu einer Zunahme der 2-Hydroxysäuren; diese möglicherweise stammen aus Membran Sphingolipide 10. Ein typisches Chromatogramm, wenn Arabidopsis-Wildtyp Blatt Cutin ist in Abbildung 3 gezeigt, für O -TMSi-Derivate (3A) und O-Acetyl-Derivate (3B). Jeder Peak wurde durch Vergleich mit Massenspektren aus der Literatur 7,8 und einer öffentlichen Datenbank 12 .Our Video-Protokoll zeigt, wie TMSi Derivate herzustellen identifiziert, aber Proben kann alternativ acetylierte Hydroxylgruppen derivatisieren. Silylierte Derivate sind gut für Identifikationszwecke, weil sie geben Diagnose-Massenspektren. Jedoch acetylierten Derivaten stabiler und eine gute Alternative zur Silylierungeinmal Monomere wurden identifiziert 10. , Zur Verwirklichung dieses Protokolls in den Labors, die nur GC Flammenionisationsdetektor (FID) gekoppelt ist, GC / FID Spuren entsprechend acetylierte Derivate von WT Blatt Cutin Monomeren und zu einem Homolog Reihe von Fettsäuremethylester-Standards werden auch gezeigt (Supplemental Abbildung 4). Diese Methode ist qualitative und quantitative erkennt Unterschiede zwischen Proben, daher der Wert für Mutanten-Analyse. Die Mengen der einzelnen Monomeren werden nach der Methode des internen Standards zur Quantifizierung, dass sie Vergleiche von Monomer Fluss zwischen den Proben bestimmt. Es sollte klargestellt werden, jedoch, dass die Spitzengröße (total ion counts) möglicherweise nicht die Molverhältnisse der Monomeren in der Polyester reflektieren. Wir sind inklusive editierbare Tabellen von Monomeren zu Monomermengen in Arabidopsis Blatt Cutin als Fettsäuremethylester und TMSi Derivate (Supplemental Datei 1), oder Ass berechnen<html> tyl-Derivate (Supplemental Datei 2) von Alkoholen. Diese Tabellen müssen möglicherweise angepasst werden, wenn Proben aus verschiedenen Organen oder Pflanzen extrahiert werden. Als Beispiel haben wir analysiert haben Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) Wildtyp-Blätter und zwei bisher dadurch Null-Mutante Allele des CYP86A2 / ATT1 Gen att1-1 (m-1) und att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytochrom-P450-Monooxygenasen der CYP86A Familie codieren vermeintliche ω-Oxydasen und beteiligen sich an Suberin und Cutin Monomer-Biosynthese. Die Ergebnisse (Figur 4) zeigen, signifikante Verringerungen in den Lasten der drei Hauptlipid Monomere in den mutierten Blätter im Vergleich zu WT-Blätter. In Übereinstimmung mit vorhergesagten Funktion des Enzyms, 16: 0, 18: 2 und 18: 1 Dicarboxylate sind speziell in att1 Mutanten beeinflusst. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53.386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die Lipid Polyester-Analyse. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figur 2. Mechanismus der NaOMe-katalysierte Transmethylierung Reaktion. Die nucleophilen Methoxidanion greifen die Carbonyl Kohlen von Lipid Polyester eine instabile tetraedrische Zwischenprodukt (A), die leicht dissoziiert in Fettsäuremethylester und Alkoholat-Anionen (B) zu bilden. Diese Alkoholate sind konjugierte Basen, und zur Reaktion mit Methanol, die Regenerierung der katalytisch aktiven Methoxidanion dadurch erhalt zusätzliche Depolymerisationsreaktionen (C). Wenn Wasser in die GegenwartSystem, wird es mit Natriummethoxid reagieren, um Natriumhydroxid, eine starke Basis, die irreversibel hydrolysiert Ester, um unerwünschte freie Fettsäuren produzieren zu bilden. Essigsäuremethylester wird als Co-Lösungsmittels 15 hinzugefügt, um kleine Mengen von Natriumhydroxid innerhalb des Systems (D) entfernen. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Gesamt Ionenchromatogramm von Wildtyp-Arabidopsis thaliana Blatt Cutin Monomeren. (A) O -trimethylsilyl (TMSi) ether und (B) Acetat-Hydroxyl-Derivate. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Abbildung 4. Cutin Monomerzusammensetzung von Arabidopsis thaliana WT und zwei Nullmutante Allele des CYP86A2-Gen. (Mutante-1 = att1-1; Mutant 2 = att1-2) Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert (n = 4) . Ab 13 angepasst ist, mit Erlaubnis von © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> STADT Abbildung 1. Peak-Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software. Peaks entsprechend dem ermittelten Monomere und internen Standards werden durch ihre retenti identifiziert<html> pünktlich (Spalte C) und Flächenwerte sind in der Spalte tabellarisch D. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> STADT Datei 2. Inhalts Arabidopsis Cutin Monomere (Trimethylsilylether-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Zusätzliche Datei 3. Tabelle Arabidopsis Cutin Monomere (O-Acetyl-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester).com / files / ftp_upload / 53.386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> STADT Abbildung 4. GC / FID Spuren von (AB) Fettsäuremethylester (FAME) Retentionsindex-Standards (Peaks werden mit jedem gesättigten FAME Kettenlänge bezeichnet); und (C) acetyliert A. thaliana WT Blatt Cutin Monomeren. Zahlen Sie auf Spitzen entsprechen: 16: 0 FAME (1), Ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), Sinapinsäure (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH-18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-Dioh 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbonsäuredimethylester; FAME: Fettsäuremethylester; IS1: interner Standard 1, 17: 0 FAME; IS2: Innen standard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Aufrufe.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Serie: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Forschung

Chemie

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Biologie

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

Chemische Isolierung, Quantifizierung und Trennung von Hautlipiden Reptilien

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Umwelt

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Gewinnung von Lignin mit hohen Gehalt an β-O-4 durch milde Ethanol Extraktion und seine Wirkung auf die Depolymerisation Ausbeute

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...