We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. Tepe Emisyon ve Çapraz-talk Tayini (Ayrıca Bakınız Şekil 2) <ol><li> Emisyon tepe ve verici arasındaki çapraz konuşma (kumarin türevi V450) ve akseptör (fluorescein), boyalar miktarını belirlemek 405 nm eksitasyon bireysel fluorophores hem ile etiketlenmiş hücrelerin spektral tarama işlemi gerçekleştirmek için. </li><li> Verici ve alıcı kanalları (buradan 455-465 nm ve 525-535 nm) için kullanılacak olan her bir boyadaki zirve içinde 10 nm bant genişliği belirler. Dalga boyu üzerinde normalleştirilmiş yoğunluğu arsa ve alıcı kanalı ve tersi (Şekil 2) donör boya çapraz konuşma ortalama yüzdesini hesaplamak. </li></ol> Y&#39;nin 2. Hazırlık Hücre Kültürü Enfeksiyon için enterocolitica Suşları <ol><li> Aşağıdaki suşları kullanın: WA-314 PMK-ova ve (WA-314 17 PMK-bla ve PMK-ova 17, sırasıyla plazmidler ile transforme) WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-) 17 314ΔYopE plazmid ile transforme PMK&#39;yi-bla </li><li> Enfeksiyon çizgi Y. önce en az iki gün enterocolitica suşları WA-314 PMK-ova, WA-314 PMK-bla ve WA-314ΔE WA-314 PMK-bla ve WA-314 PMK-ova için (kanamisin gerekli antibiyotikleri içeren LB-agar plakaları üzerinde hisse senedi kriyo gelen PMK-bla ; kanamisin ve WA-314ΔE PMK-bla için tetrasiklin) ve 27 ° C&#39;de O / N büyür. Daha sonra bir haftaya kadar 4 ° C plakaları tutun. </li><li> Enfeksiyondan bir gün önce, ilgili suşlarının bir koloni ile istenen antibiyotik içeren LB-ortamı içinde 3 ml inoküle ve 180 rpm&#39;de bir çalkalama 27 ° C &#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Enfeksiyonun günde antibiyotikler olmadan, taze LB-ortamı içinde 40 ml O / N kültürünün 2 ml&#39;sini aşılamak ve tip III sekresyon sisteminde ekspresyonunu indüklemek için 180 rpm&#39;de bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C &#39;de 90 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Uygun bir tüp içine kültürleri aktarın ve C buz üzerinde veya 4 ° kültürleri tutmakbundan sonra. 5000 xg ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kültürler santrifüj. </li><li> Buz 2-3 ml soğuk PBS bakteriyel pelletini. Bir spektrofotometre kullanılarak, 8 x 10 8 cfu / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar bakteri süspansiyonu ile seyreltilir. Ayrı ayrı ilgili optik yoğunluk belirlenir. HeLa hücrelerini enfekte kadar buz üzerinde bu süspansiyon tutun. </li></ol> 3. Kaplama HeLa Hücreleri <ol><li> 96 gözlü bir levhanın gözleri içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden ve 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde yetiştirmek 200 ul DMEM içinde bir gün enfeksiyon tohum önce 1.5 x 10 4 hücre HeLa hücreleri. Her bir suş (üç farklı inkübasyon kez) üç kuyu Seed. </li></ol> 4. HeLa Hücreleri Enfeksiyon ve CCF4 ile yükleme <ol><li> Orta bakteriyel süspansiyon 3.5 ul ekleyerek HeLa hücreleri enfekte ve nazikçe orta kez pipetleme karıştırın. Bakteriler üzerinde çökelmesi için izin verHücre başına yaklaşık olarak 100 bakteri MOI (enfeksiyon kısmı) hücrelere. Bir zaman süreci için -90 dakikada, -60 dakika ve -30 dakikada enfeksiyonları başlatmak ve ortak bir uç noktası elde etmek için 0 dakika kadar bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyon tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde HeLa hücreleri çıkarmadan orta aspire ve CCF4 ihracat azaltmak için efektör ve 2.5 mM probenesid ekspresyonunu durdurmak için 20 ug / ml kloramfenikol içeren PBS 50 ul ekle. </li><li> Bu noktada, bir mikroskop kademesine 96 oyuklu plaka transfer ve de her biri daha sonraki analizler için uygun noktalar tanımlar. 10 dakika içinde bu adımı tamamlayın (edinim ayrıntıları için bakınız bölüm 5.1). </li><li> Ortalama de, 20 içeren CCF4 / AM yükleme çözeltisi (0.24 ul çözelti A, 1.2 ul çözelti B, 70 ul, 18.56 ul çözelti C (çözelti A, B, ve C CCF4 / AM yükleme kiti içinde temin) ve 50 ul PBS (ekleme Çok p kullanılarak ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesid)ipette oda sıcaklığında 5 dakika inkübe vb. Şimdi çalışma kesintisiz itibaren. </li><li> Yükleme solüsyonu aspire ve çok pipet kullanılarak 20 ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesit içeren 100 ul PBS ilave edin. Sonra hızla mikroskop aşamaya 96 plaka aktarmak ve yükleme çözümünün aspirasyonu 10 dakika içinde alımı başlatabilirsiniz. </li></ol> 5. Lazer Tarama Mikroskopi ve Veri Analizi <ol><li> Görüntü edinimi <ol><li> Fototoksisite, Photobleaching ve çapraz uyarma toplam foton sayısını en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için bir şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın. <ol><li> Modern bir konfokal lazer tarama mikroskobu, aynı anda aktif donör ve alıcı kanalları, 8 bit derinliği ile yüksek hassasiyet GaAsP-dedektörleri seçin 2.5 Airy birimlerinin (yani, geniş optik kesit) detektör iğne deliği açmak, 20X yüksek sayısal açıklık daldırma objektif kullanın ~ 750 nm piksel boyutu, 3 kat çerçeve ortalama ve Excit405 nm diyot lazer% 10 e. </li><li> Doğru miktar aynı değere her iki kanal dedektör kazancını ayarlamak sağlamak ve herhangi doymuş piksel önlemek için. Not: Burada kazançları% 150 kuruldu. </li></ol></li><li> 1 ml şırınga ile, örneğin kuyu dibine batırma orta yayarak sürekli daldırma emin olun ve herhangi bir hava kabarcığı yakalama kaçının. </li><li> Iletilen ışık etkinleştirin ve her kuyuda bir görüş temsilcisi alanını bulmak. Bir doğru kalibre otomatik sahne kullanın ve yazılımı konumunu işaretleyin. </li><li> Boyama için plakasının sökülmesinden sonra, (bölüm 4.3) plaka takın ve fokal sürüklenme önlemek için üst kısmında bir ağırlık ilave. Lazer tarama modu ile kaydedilen pozisyonları gözden geçirin ve düzgün odaklama ve yanal konumunu ayarlamak. </li><li> 2 saat kadar, 2 dakika süre zaman atlamalı ayarlayın ve alımı başlatabilirsiniz. </li></ol></li><li> Resim miktar (örneğin Bitplane Y verilecek) bu tür IMARIS gibidir <ol><li> Piksel matrislerin aritmetik hesaplamaları izin veren yazılım içine veri kümesi aktarın. Sürükleyip bağışçı ve yazılım simgesine alıcı kanalı hem de içeren kaynak dosya bırakarak bunu yapın. </li><li> Aynı ofset kullanarak her iki kanallarda arka plan çıkarın. Bunu yapmak için, Menü&#39;yü tıklatın ve sonra Görüntü tıklayın&gt; İşleme&gt; Baseline Çıkarma. Her kanalı seçin ve bazal değeri girin. </li><li> Yeni bir kanal oluşturarak, önceden belirlenmiş düzeltme faktörü f (1.1 bakınız) ile alıcı kanalı (CH2) içine donör kanalı (Ch1) ve boşaltma-through düzeltin: Ch2 &#39;= CH2 - Ch1 * f Not: verici kanalı içine alıcı bir boşaltma yoluyla gürültü seviyesi üzerinde tespit edilememiştir. <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Arithmetics tıklayın ve butonu abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Daha sonra Menü&gt; Düzenle&gt; Kanallar Sil&#39;i tıklatarak Kanal 2 silin. Emin olunkanamaya-yoluyla düzeltilmiş alıcı kanalı olarak kalır yeni Kanal 2. İsteğe bağlı: Menü&gt; Düzenle&gt; Görüntü Özellikleri giderek orijinal rengine gri kanal rengini değiştirin. Channel 4&gt; Haritalı Renk&gt; Temel Rengi seçip yeşil, örneğin değiştirin. </li></ol></li><li> Göreceli FRET katsayısını belirlemek için aşağıdaki işlemi ile yeni bir kanal oluşturun: = CH3 Ch2 &#39;/ (Ch1 + CH2&#39;), <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Aritmetik gidin ve ./ (CH1 + CH2) CH2 girin </li></ol></li><li> 8 bit görüntüde FRET kanalının uygun görünüm için, dördüncü kanal oluşturmak: Ch4 = 255 * Ch3 <ol><li> Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Kanal Aritmetik gidin ve 255 * CH3 girin. Menü&gt; Düzenle&gt; Görüntü Özellikleri giderek kanal rengini değiştirin. Channel 4&gt; Haritalı Renk&gt; Renk Tablosu Dosya&gt; Jet seçin. </li></ol></li><li> Kanallar CH3 ve Ch4 tha bir 3x3 medyan filtre uygulamakt görüntüler gürültüyü azaltır. Bunu yapmak için, Menü&gt; Görüntü İşleme&gt; Düzleştirici&gt; Medyan Filtre tıklayın. Her iki kanal seçin ve bir filtre boyutu &quot;3x3x1&quot; uygulanacaktır. </li><li> Hücresel sinyal ölçümü için doğru ofset ayarlayarak Ch4 hücrelerin tespit etmek ve çok küçük yapılar dahil büyüklük olarak yapı filtre. <ol><li> Seçin Görünüm Aşan ve simgesi &quot;Yeni Yüzey Ekle&quot; düğmesine tıklayın. Yüzey penceresinde algılama algoritma parametreleri tanımlayın. Daha hızlı işlem için, iki onay kutularını &quot;Segment İlgi sadece Bölge&quot; ve &quot;nihayet Süreç tüm Image&quot; etkinleştirin. Boyutlarını düzenleyerek ilgi bölgeyi tanımlamak. </li><li> Kaynak kanalı olarak Kanal 4 seçip eşik&gt; Arka Plan Çıkarma (Yerel Kontrast) tarafından eşiğini ayarlamak ve 10 um çapı ayarlayın. Maksimum intensi elle 0&#39;a asgari yoğunluk eşiğini ve maksimum eşik ayarlamakty. Alana göre yapılarını Filtre ve örneğin, 187 μm² minimum değeri ayarlayın. Yüzey algılama bitirin. </li></ol></li><li> Donör floresan yoğunluğu (Ch1) ve bağıl FRET katsayısı (Ch3) ve hücresel varlık kendi standart sapmaları için ortalama değerler ayıklayın. Bunu yapmak için, Yüzey özelliklerine gidin. Yüzeyler Stil / Kalite&gt; Yüzey seçerek yapıların görünümünü değiştirin. Filtreler sekmesini tıklayarak bütün yapıları seçiniz. Seçimi&gt; birleştirmek Süreç giderek tespit yapıları birleştirin. Istatistik sekmesini tıklayarak MS Excel yüzey istatistiklerini İhracat&gt; İhracat Tüm istatistikleri Dosyaya. </li><li> Zaman içinde bu değerler çizilir. Transloke efektör miktarını temsil ettiği uygun bir parametre olarak her bir durum için donör kanalı floresan artış maksimum eğim 10 dakika aralığını belirlemek. M = Δ donör floresan yoğunluğu / Δ süresi (min) olarak eğimi hesaplayın. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Type+III+Secretion+Systems:+Specialized+Nanomachines+for+Protein+Delivery+into+Target+Cells.">Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells.</a> Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).</li><li>Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+functions+of+pathogenic+Yersinia+species.">Effector functions of pathogenic Yersinia species.</a> Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).</li><li>Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia's+stratagem:+targeting+innate+and+adaptive+immune+defense.">Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense.</a> Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).</li><li>Viboud, G. I., Bliska, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+outer+proteins:+role+in+modulation+of+host+cell+signaling+responses+and+pathogenesis.">Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis.</a> Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system:+traffic+control.">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).</li><li>Pettersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+virulence+factor+expression+by+pathogen+target+cell+contact.">Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact.</a> Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).</li><li>Schweer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+necrotizing+factor+of+Yersinia+pseudotuberculosis+(CNFY)+enhances+inflammation+and+Yop+delivery+during+infection+by+activation+of+Rho+GTPases.">The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases.</a> PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).</li><li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+necrotizing+factor-Y+boosts+Yersinia+effector+translocation+by+activating+Rac+protein.">Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein.</a> J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).</li><li>Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+controls+type+III+effector+delivery+into+host+cells+by+modulating+Rho+activity.">Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity.</a> PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).</li><li>Aili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Yersinia+Yop-effector+delivery+by+translocated+YopE.">Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE.</a> Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).</li><li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+YopE+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway+fine-tunes+Yop+delivery+into+host+cells+and+facilitates+systemic+spread+of+Yersinia+enterocolitica+in+host+lymphoid+tissue.">Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue.</a> Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).</li><li>Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YopB+of+Yersinia+enterocolitica+is+essential+for+YopE+translocation.">YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation.</a> Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).</li><li>Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+pathogenic+type+3+secretion+system+in+action.">Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).</li><li>Sory, M. P., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+hybrid+YopE-adenylate+cyclase+from+Yersinia+enterocolitica+into+HeLa+cells.">Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells.</a> Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).</li><li>Schlumberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+type+III+secretion:+Salmonella+SipA+injection+into+host+cells.">Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).</li><li>Koberle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+enterocolitica+targets+cells+of+the+innate+and+adaptive+immune+system+by+injection+of+Yops+in+a+mouse+infection+model.">Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model.</a> PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).</li><li>Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cells+targeted+by+Salmonella+type+III+secretion+in+vivo.">Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo.</a> PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).</li><li>Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plague+bacteria+target+immune+cells+during+infection.">Plague bacteria target immune cells during infection.</a> Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+type+III+secretion+system+activity+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).</li><li>Heesemann, J., Laufs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+mobilizable+Yersinia+enterocolitica+virulence+plasmid.">Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid.</a> J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).</li><li>Zumbihl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxin+YopT+of+Yersinia+enterocolitica+induces+modification+and+cellular+redistribution+of+the+small+GTP-binding+protein+RhoA.">The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA.</a> J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz burada başarılı Y. tarafından efektör translokasyon kantitatif analizi için bir TEM-1 beta-laktamaz muhabiri bazlı analiz uygulamalı enterocolitica. Bu, hassas bir özel ve oldukça basit bir tekniğin bir çok farklı varyasyonlar literatürde tarif edilmiştir. Bu çalışmada, lazer tarama mikroskobu floresan sinyalleri en hassas ve kesin tespiti için yürütülmüştür. Özellikle, verici ve alıcı boyalar ve bağımsız olarak ayarlanabilen tespit bant genişlikleri arasında çapra...

Tip III salgılama sistemleri, doğrudan ökaryotik hedef hücrelere bakterisel olarak kodlanmış proteinlerin efektör sağlamak için gram negatif bakterilerin farklı cins tarafından kullanılan özel bir protein ihracatı makinelerdir. Salgılanması mekanizmasının kendisi yüksek ölçüde korunmuş olsa da, efektör proteinler uzman setleri hücresel sinyal yolları değiştirmek ve belirli bir bakteriyel hastalık stratejileri 1 kolaylaştırmak için farklı bakteri türleri arasında gelişmiştir. Yersinia durumunda, yedi efektör proteinler olarak adlandırılan Yops (Yersinia dış proteinler) &#39;ye kadar, konakçı hücre temas üzerine transloke ve örneğin, fagositoz ve sitokin üretimi, immün hücresi tepkilerini bozmak için birlikte hareket edilir, bakterilerin hücre dışı sürdüreceği 2-4. Translokasyon süreci sıkı farklı aşamalarında 5 kontrol edilir. Bu T3SS birincil aktivasyon hedef ce onun temas ile tetiklenen olduğunun tespit edilmesill 6. Ancak, bu inisiyasyon kesin mekanizması henüz aydınlatılamamıştır olmaktır. Yersinia ise translokasyon sözde ince ayar bir ikinci düzey Up-by veya aşağı-düzenleyen hücresel Rho GTP-bağlayıcı proteinlerin Rac1 veya RhoA aktivitesini elde edilir. Invazın veya sitotoksik nekrotizan faktör Y (CNF-Y) örneğin Rac1 Aktivasyon GAP transloke YopE işlevini (GTPaz protein aktive) ise Rac1 aktivitesini aşağı düzenler ve buna göre bir negatif geribildirim türü translokasyonu azaltır, artan translokasyon 7-9 yol açar mekanizması 10,11. Geçerli ve hassas yöntemler translokasyon Yersinia konak hücre etkileşim sırasında nasıl düzenlendiği araştırmak için önkoşuldur. Birçok farklı sistemleri özel avantajları ve sakıncaları ile birlikte, her biri bu amaç için kullanılmaktadır. Bazı yaklaşımlar western blot analizi ile, ardından farklı bir deterjan enfekte hücrelerin parçalanması değil, bakteri dayanmaktadır. ThBu yöntemlerin e ortak dezavantajı küçük ama kaçınılmaz bakteriyel lizis potansiyel bakteri ilişkili efektör proteinleri ile hücre lizat kirletir olmasıdır. Ancak, hücre dışı proteinler ve efektör ökaryotik hücrelerde seçici parçalanması digitonin sonraki kullanımının indirgemek için proteinaz K ile hücrelerinin tedavi, bu sorunu 12 en aza indirmek için önerilmiştir. Önemli olarak, bu deneyler, en önemlisi, çoğunlukla, ticari olarak mevcut değildir, yüksek kaliteli, anti-efektör antikorları bağlıdır. Girişimleri floresan proteinleri küresel üçüncül yapısı ve sekresyon 13 önce onları açılmak için salgılama aygıtının yetersizlik muhtemelen başarılı nedeniyle değildi translokasyon izlemek için GFP gibi efektör proteinlerin çeviri füzyonlarının ve floresan proteinleri kullanmak için. 14 ya da Flash cyclolysin Bordetella pertussis toksin Ancak, CYA gibi birçok farklı raportör etiketleri (kalmodulin-bağımlı adenilat siklaz) etki alanıetiketi başarıyla translokasyon analiz etmek için kullanılmıştır. Flash etiket, çok kısa bir Tetracysteine ​​(4Cys) motifi etiketi, sekresyon işlemi bozmadan biarsenical boya Flash ile etiketlenmesi için izin verirken, eski deneyinde CYA enzimatik aktivitesi, hücre içi füzyon proteininin sinyal yükseltmek için kullanılır 15. Burada uygulanan yaklaşım, Charpentier vd., Ilk kez bildirilmiştir transloke efektör TEM-1 beta-laktamaz füzyonları 16 (Şekil 1 A) Förster rezonans enerji transferi (FRET) boya CCF4 hücre içi dönüşüm dayanır. CCF4 / AM kumarin türevi (donör) ve flöresan kısmı (akseptör) bir cephalosporin çekirdek ile birbirine takılmış olduğu, bir hücre nüfuz edici bileşiktir. Ökaryot hücreye pasif girmesinden sonra, CCF4 / AM bileşik esterlenmiş floresan olmayan ücret ve floresan CCF4 hücresel esterazlarla işlenir ve bu sayede tuzakhücre içinde. 530 nm&#39;de bir yeşil floresan sinyali yayan floresein kısım için FRET 405 nm sonuçlara kumarin parçasının Uyarım. Beta-laktamaz FRET tarafından sefalosporin çekirdek ayrılmasından sonra bozulur ve kumarin kısmının uyarma nm AR460 mavi floresan emisyonuna yol açar. Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, in vitro olarak translokasyonu analizi sağlar ve aynı zamanda in vivo, örneğin, bu teknik, in vivo 17-19 translokasyon için hedeflenen lökosit popülasyonları tanımlamak için, bir fare enfeksiyon modelinde kullanılmıştır. Sinyallerin okunması plaka okuyucusu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Unutmayın ki, yöntem aynı zamanda enfeksiyon süreci 20,21 sırasında canlı hücre mikroskopi gerçek zamanlı translokasyonu izlemek için imkanı sağlar. Burada lazer tarama mikroskobu readou floresan uygulanmıştırfloresan sinyalleri t en yüksek hassasiyet ve doğruluk sağlar olarak. Özellikle, yetenek yüksek duyarlı dedektörler ile birlikte nanometre hassasiyetle emisyon penceresini floresens optimize edilmiş ve çapraz konuşma minimize kolaylaştırır ayarlamak için. Buna ek olarak, bu mikroskopi kurulum translokasyonun gerçek zamanlı izleme için uyarlanabilir ve potansiyel olarak hücresel düzeyde-konak etkileşim aynı anda analiz için izin verir. Bir Y. Bu çalışmada translokasyon oranları enterocolitica vahşi tip suş ve hypertranslocator fenotip 10,11 sergileyen YopE silme mutant örnek bir analiz edildi.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (black, clear bottom)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>Immersol W immersion oil&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&amp;#160;nm diode laser 50&amp;#160;mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6 software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td></tr><tr><td>MatLab compiler runtime</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Patojenik Yersinia spp dahil olmak üzere birçok gram-negatif bakteriler. Ökaryotik hedef hücrelere efektör proteinleri yerini değiştirmek için tip III salgı sistemlerini kullanır. Konak hücre içinde efektör proteinler bakteriler yararına hücresel fonksiyonları manipüle. Daha iyi translokasyon ölçmek için konak hücre etkileşimi, hassas ve doğru deneyleri sırasında tip III sekresyon kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada Yersinia enterocolitica efektör proteini fragmanı füzyon göre bir deneyde (Yersinia dış proteini; YopE) uygulanmasını tarif eder. Translokasyon kantitatif analiz için TEM-1, beta-laktamaz olan deney bir hücre bölünmesinden dayanır geçirgen FRET boyası transloke beta-laktamaz füzyonu (CCF4 / AM). Floresein bozulur ve kumarin yarımının uyarım mavi flüoresans emisyonlarına neden olan beta-laktamaz göre CCF4 sefalosporin çekirdeğin ayrılmasından sonra, kumarin gelen FRET.Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, bir fare modelinde in vitro translokasyon analizi için ve aynı zamanda in vivo, örn sağlar. Floresan sinyalleri tespit levhası okuyucu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Farklı Yersinia mutantlar tarafından HeLa hücrelerine efektör füzyonlarının nitro translokasyon, burada açıklanan kurulum lazer tarama mikroskobu ile izlenir. Gerçek zamanlı olarak beta-laktamaz efektör füzyon ile FRET raportör hücre içi dönüşümünü kayıt sağlam bir nicel sonuçlar sağlar. Biz burada bir Y. tarafından artan translokasyon gösteren, örnek verileri göstermek vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında enterocolitica YopE mutant.

Kantitatif hedef hücrelere efektör translokasyon analiz etmek için tarif edilen yönteme kapasitesini göstermek için, farklı bir translokasyon kinetiği iki Yersinia suşlar üzerine çalışıldı: Y. ve onun türevi WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 barındıran WA-314) (virülans plazmid pYVO8 22 barındıran serogrup O8) enterocolitica vahşi tip suş WA-314. Daha önce iş olduğunu gösterdi Y. Fonksiyonel YopE sergilediğini anlamlı olarak yüksek Yop tr...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions at JoVE.com

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Görüntüleme.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Video: Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Genetik

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Biyoloji

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host cells. Upon entry, the injected effector proteins cooperatively modulate eukaryotic signaling pathways and reprogram cellular functions, enabling bacterial entry and survival. Monitoring and localizing these secreted effector proteins in the context of infections provides a footprint for defining the dynamic interface of host-pathogen interactions. However, labeling and imaging bacterial proteins in host cells without disrupting their structure/function is technically challenging. 
Constructing fluorescent fusion proteins does not resolve this problem, because the fusion proteins jam the secretory apparatus and thus are not secreted. To overcome these obstacles, we recently employed a method for site-specific fluorescent labeling of bacterial secreted effectors, as well as other difficult-to-label proteins, using genetic code expansion (GCE). This paper provides a complete step-by-step protocol to label Salmonella secreted effectors using GCE site-specifically, followed by directions for imaging the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) 
Recent findings suggest that the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via GCE, followed by bio-orthogonal labeling with tetrazine-containing dyes, is a viable technique for selective labeling and visualization of bacterial secreted proteins and subsequent image analysis in the host. The goal of this article is to provide a straightforward and clear protocol that can be employed by investigators interested in conducting super-resolution imaging using GCE to study various biological processes in bacteria and viruses, as well as host-pathogen interactions.

This article provides a straightforward and clear protocol to label Salmonella secreted effectors using genetic code expansion (GCE) site-specifically and image the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM)

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler