We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2) <ol><li> Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet. </li><li> Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Sie die normierte Intensität über der Wellenlänge und die Berechnung der durchschnittliche Prozentsatz der Übersprechen der Donor-Farbstoff in der Akzeptor-Kanal und umgekehrt (Abbildung 2). </li></ol> 2. Herstellung von Y. enterocolitica Stämme für die Zellkultur-Infektion <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Stämme: WA-314 pMK-Eizellen und (WA-314 mit den Plasmiden pMK-bla 17 und PMK-17-Eizellen bzw. transformiert) WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformiert mit dem Plasmid pMK-bla 17) </li><li> Mindestens zwei Tage vor der Infektion Strähne Y. enterocolitica WA-314 pMK-Eizellen, WA-314 pMK-bla und cryo Bestände auf LB-Agarplatten, die die erforderlichen Antibiotika (Kanamycin für WA-314 pMK-bla und WA-314 pMK-Eizellen WA-314ΔE pMK-BLA ; Kanamycin und Tetracyclin für WA-314ΔE pMK-bla) und wachsen O / N bei 27 ° C. Danach halten die Platten für bis zu einer Woche bei 4 ° C. </li><li> Einen Tag vor der Infektion zu impfen 3 ml LB-Medium, das die erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie der jeweiligen Stämme und inkubieren O / N bei 27 ° C in einem Schüttler bei 180 UpM. </li><li> Am Tag der Infektion zu impfen 2 ml des O / N-Kultur in 40 ml frisches LB-Medium ohne Antibiotika und Inkubation für 90 min bei 37 ° C in einem Schüttler bei 180 rpm, um die Expression des Typ-III-Sekretionssystem induzieren. </li><li> Übertragen Sie die Kulturen in ein geeignetes Rohr und die Kulturen zu halten auf Eis oder bei 4 ° Cvon jetzt an. Zentrifugieren die Kulturen 10 min bei 5000 × g und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in 2-3 ml eiskaltem PBS. Verdünnen der Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 8 x 10 8 cfu / ml unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bestimmen Sie die entsprechende optische Dichte individuell. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis, bis die Infektion der HeLa-Zellen. </li></ol> 3. Überzug HeLa-Zellen <ol><li> Einen Tag vor der Infektion Saatgut 1,5 x 10 4 Zellen HeLa-Zellen in 200 ul DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte und pflegen in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Seed drei Brunnen für jeden Stamm (drei unterschiedlichen Inkubationszeiten). </li></ol> 4. Die Infektion von HeLa-Zellen und Laden mit CCF4 <ol><li> Infizieren HeLa-Zellen durch Zugabe von 3,5 ul der Bakteriensuspension auf das Medium und mischen durch vorsichtiges Pipettieren das Medium zweimal. Lassen Sie sich die Bakterien zu sedimentieren aufzu den Zellen bei einer MOI (Gruppierung of infection) von etwa 100 Bakterien pro Zelle. Für eine Zeit Kurs beginnen Infektionen bei -90 min, -60 und -30 min min und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator bis 0 min, um einen gemeinsamen Endpunkt zu erreichen. </li><li> Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird das Medium sorgfältig absaugen, ohne HeLa-Zellen und 50 &amp; mgr; l PBS, das 20 ug / ml Chloramphenicol, um die Expression von Effektoren und 2,5 mM Probenecid zu stoppen, um den Export von CCF4 reduzieren. </li><li> An dieser Stelle überweisen Sie den 96-Well-Platte in den Mikroskoptisch, und definieren geeignete Plätze für eine spätere Analyse in jede Vertiefung. Beenden Sie den Schritt innerhalb von 10 Minuten (für Details der Akquisition siehe Abschnitt 5.1). </li><li> Pro Loch, fügen Sie 70 ul CCF4 / AM Beladungslösung (0,24 &amp; mgr; l Lösung A, 1,2 ul Lösung B, 18,56 &amp; mgr; l Lösung C (Lösung A, B und C innerhalb CCF4 / AM Lade Kit enthalten) und 50 ul PBS (enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid) unter Verwendung einer Mehr pipette und Inkubation für 5 min bei RT. Von nun an Arbeiten ohne Unterbrechungen. </li><li> Absaugen Beladungslösung und 100 ul PBS, enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid mit einem Multipipette. Dann schnell die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen in den Mikroskoptisch und starten Akquisition innerhalb von 10 Minuten vom Streben der Beladungslösung. </li></ol> 5. Laser Scanning Mikroskopie und Analyse von Daten <ol><li> Bilderfassung <ol><li> Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung. <ol><li> In einer modernen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, mit einem 20X hoher numerischer Apertur Sionsobjektiv, öffnen Sie den Detektor Pinhole bis 2,5 Airy-Einheiten (dh breite optische Schnitte), wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit GaAsP-Detektoren gleichzeitig aktive Donor und Akzeptor-Kanäle, 8 Bit-Tiefe , ~ 750 nm Pixelgröße, 3-fach-Rahmen Mittelwertbildung und excite mit 10% einer 405 nm Laserdiode. </li><li> Um zu gewährleisten, stellen Sie die korrekte Quantifizierung Detektor-Verstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert und zu gesättigten Pixeln zu vermeiden. Anmerkung: Hier wurden die Gewinne zu 150% festgelegt. </li></ol></li><li> Sicherzustellen Überflutung durch Spreizen Sionsmediums zum Boden der Vertiefungen, beispielsweise mit einer 1 ml Spritze und das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Aktivieren Sie den Durchlicht und finden Sie eine repräsentative Sichtfeld in jeder gut. Verwenden Sie eine richtig kalibriert automatische Bühne und markieren Sie die Position in der Software. </li><li> Nach der Entfernung der Platte für die Färbung (siehe Abschnitt 4.3), legen Sie die Platte und fügen Sie ein Gewicht auf den Brenndrift zu vermeiden. Überprüfen Sie die gespeicherten Positionen mit der Laser-Scanning-Modus und stellen Sie den Fokus und Seitenlage richtig. </li><li> Stellen Sie den Zeitablauf bis 2 Minuten, die Dauer bis 2 Stunden und starten Akquisition. </li></ol></li><li> Bildquantifizierung (Beispiele für Bitplane Softw gegeben werdensind wie Imaris) <ol><li> Importieren Sie die Datenmenge in Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrix ermöglicht. Tun Sie dies durch Ziehen und Ablegen die Quelldatei, die sowohl den Donor und Akzeptor-Kanal auf das Software-Symbol. </li><li> Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit den gleichen Versatz. Um dies zu tun, klicken Sie auf Menü und dann auf Bild&gt; Verarbeitung&gt; Basisliniensubtraktion. Wählen Sie jeden Kanal und geben Sie den Ausgangswert. </li><li> Korrigieren Sie den Durchschlag des Spenders Kanal (CH1) in das Akzeptor-Kanal (CH2) mit der vorgegebenen Korrekturfaktor f (siehe 1.1), die Schaffung eines neuen Kanal: Ch2 &#39;= CH 2 - Ch1 * f HINWEIS: Ein Durchschlagen des Akzeptors in den Spender Kanal nicht über die Höhe der Rausch nachweisbar. <ol><li> Klicken Sie auf Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Danach löschen Sie Kanal 2, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Kanäle löschen. Sicherzustellen, dass dieDurchschlagen korrigiert Akzeptorkanal bleibt der neue Kanal 2. Optional: Ändern Sie den Kanal Farbe von grau auf die ursprüngliche Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Grundfarbe und ändern Sie es in zB grün. </li></ol></li><li> Erstellen Sie einen neuen Kanal mit den folgenden Vorgang, um die relative FRET Koeffizienten zu bestimmen: Ch3 = CH 2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben ch2 ./ (ch1 + ch2) </li></ol></li><li> Für die richtige Visualisierung der FRET-Kanal in einem 8-Bit-Bild, erstellen Sie einen vierten Kanal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie 255 * CH 3. Ändern Sie den Kanal Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Farbtabelle Datei&gt; Jet. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine 3x3 Medianfilter, um die Kanäle CH3 und CH4 that das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Um dies zu tun, Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Glätten&gt; Median-Filter klicken. Wählen Sie beide Kanäle und einen Filter Größe &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Zur Quantifizierung von zellulären Signalen, erkennen die Zellen in Ch4 durch geeignetes Einstellen der Offset und filtern Sie die Strukturen durch Größe, um zu kleine Strukturen auszuschließen. <ol><li> Wählen Sie die Surpass-Ansicht und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neue Oberflächen&quot;. Definieren Sie die Erkennungsalgorithmus Parameter in der Oberflächen Fenster. Für eine schnellere Verarbeitung, aktivieren Sie die beiden Checkboxen &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; und &quot;Prozess gesamte Bild endlich&quot;. Definieren Sie die Region von Interesse, indem Sie ihren Dimensionen. </li><li> Wählen Sie Channel 4 als Quellkanal und stellen Sie die Schwelle durch Thresholding&gt; Hintergrund Subtraktion (Local Contrast) und stellen Durchmesser bis 10 um. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle manuell auf 0 und die maximale Schwelle der maximalen intensiviertty. Filtern Sie die Strukturen durch Bereich und den Minimalwert auf zB 187 um². Beenden Sie die Oberflächenerfassung. </li></ol></li><li> Extrahieren der Mittelwerte für Donorfluoreszenzintensität (Ch1) und die relative FRET Koeffizienten (CH3) und ihre Standardabweichungen im zellularen Entität. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Oberflächeneigenschaften. Ändern Sie das Aussehen der Strukturen durch Auswahl Surfaces Style / Qualität&gt; Surface. Wählen Sie alle Strukturen, indem Sie auf die Registerkarte Filter. Vereinheitlichen Sie die erfassten Strukturen, indem Sie auf Auswahl&gt; Unify verarbeiten. Exportieren Sie die Oberfläche Statistiken in MS Excel, indem Sie auf der Registerkarte Statistik&gt; Export Alle Statistiken in Datei. </li><li> Zeichnen Sie diese Werte im Laufe der Zeit. Identifizierung der 10 min-Intervall der maximalen Steigung der Spenderkanal Fluoreszenzzunahme für jede Bedingung als eine vernünftige Parameter, um die Menge an transloziert Effektor darzustellen. Berechnung der Steigung m = Δ Donorfluoreszenzintensität / Δ Zeit (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen d...

Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine ​​sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11. Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine ​​und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine ​​und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine ​​und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15. Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene. In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (black, clear bottom)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Used for peak emission and cross-talk determination</td></tr><tr><td>Immersol W immersion oil&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&amp;#160;nm diode laser 50&amp;#160;mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6 software</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td></tr><tr><td>MatLab compiler runtime</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine ​​zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine ...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Aufrufe.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Serie: Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Genetik

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Biologie

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host cells. Upon entry, the injected effector proteins cooperatively modulate eukaryotic signaling pathways and reprogram cellular functions, enabling bacterial entry and survival. Monitoring and localizing these secreted effector proteins in the context of infections provides a footprint for defining the dynamic interface of host-pathogen interactions. However, labeling and imaging bacterial proteins in host cells without disrupting their structure/function is technically challenging. 
Constructing fluorescent fusion proteins does not resolve this problem, because the fusion proteins jam the secretory apparatus and thus are not secreted. To overcome these obstacles, we recently employed a method for site-specific fluorescent labeling of bacterial secreted effectors, as well as other difficult-to-label proteins, using genetic code expansion (GCE). This paper provides a complete step-by-step protocol to label Salmonella secreted effectors using GCE site-specifically, followed by directions for imaging the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) 
Recent findings suggest that the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via GCE, followed by bio-orthogonal labeling with tetrazine-containing dyes, is a viable technique for selective labeling and visualization of bacterial secreted proteins and subsequent image analysis in the host. The goal of this article is to provide a straightforward and clear protocol that can be employed by investigators interested in conducting super-resolution imaging using GCE to study various biological processes in bacteria and viruses, as well as host-pathogen interactions.

This article provides a straightforward and clear protocol to label Salmonella secreted effectors using genetic code expansion (GCE) site-specifically and image the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM)

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

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