Genetik kod genişlemesi veya GCE, diğer etiketleme stratejilerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Özel olarak etiketlenmiş proteinleri yerleştirmemizi sağlar ve görselleştirmelerini sağlayan parlak organik floroforlarımız vardır, böylece protein fonksiyonunu bozabilecek floresan protein füzyonları yapan stratejilerden kaçınabiliriz. Bu yöntem başka herhangi bir sisteme uygulanabilir.
Örneğin, Zika CO proteinini etiketlemek için kullandık ve bu, daha sonra konakçı hücreleri enfekte ettiğini gözlemleyebileceğimiz etiketli Zika virüsü sağlamamızı ve üretmemizi sağlıyor. Başlamak için, 100 mikrolitre birincil kültürü, mililitre kloramfenikol başına 35 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren beş mililitre LB ortamına aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6'ya ulaşana kadar 250 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.
LB ortamını, kanonik olmayan bir amino asit olan bir milimolar TCO ile desteklenmiş modifiye N-minimal ortam ile değiştirin. Ve bakterileri 30 dakika boyunca 34 santigrat derecede büyütün. % 0.2 arabinoz, mililitre kloramfenikol başına 25 miligram ve mililitre ampisilin başına 100 miligram ekleyin ve hücreleri 250 RPM'de sallayarak altı saat daha büyütün.
Altı saat sonra, bakterileri kanonik olmayan amino asitler veya ncAA içermeyen taze MgM ortamı ile 30 dakikalık bir aralıkta dört kez yıkayın. Bakterileri santrifüj edin, PBS tamponunda tekrar askıya alın ve fazla ncAA'ları gidermek için karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, bakterileri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüj edin ve daha fazla kullanım için saklayın.
Bir kontrol deneyi için, ncAA yokluğunda ncAA taşıyan proteinleri eksprese ederek aynı deneyi tekrarlayın. PBS'de TCO'nun yokluğunda veya varlığında TCO ile birleştirilen SseJ'yi eksprese eden salmonella hücrelerini yeniden askıya alın. PBS'de optik yoğunluğu 600 nanometrede dörde ayarlayın ve hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 20 mikromolar Janelia Fluor 646 tetrazen veya 20 mikromolar BDPFL tetrazin ile inkübe edin ve 250 RPM'de bir ila iki saat çalkalayın.
Hücreleri pelet haline getirin ve% 5 DMSO ve% 0.2 Pluronic F-127 içeren PBS ile üç ila dört kez yıkayın. Peletin %5 DMSO içeren PBS'de tekrar askıya alınması. Karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, PBS ile iki kez daha yıkayın.
Konfokal mikroskop kullanarak hücreleri hemen görüntüleyin veya karanlıkta oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca PBS'de% 1.5 paraformaldehit ile sabitleyin. HeLa hücrelerini 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit ve% 95 nemde, penisilin streptomisin'e ek olarak% 10 FBS ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM'de kültürleyin ve koruyun. Enfeksiyondan bir gün önce bakterileri kültürleyin ve ortogonal tRNA sentetaz çifti içeren pEVOL plazmidini ve SseJ geni içeren pWSK29 plazmidini barındıran tek bir vahşi tip salmonella kolonisini, 250 RPM'de çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede standart LB suyu içeren beş milimetre antibiyotik içinde aşılayın.
Sekiz kuyucuklu bir slaytta% 10 FBS büyüme ortamı içeren 500 mikrolitre DMEM'de mililitre başına seyreltilmiş bir hücre stoğunu onarın ve kuyu başına 50.000 HeLA hücresini tohumlayın. Oda slaytını 24 saat boyunca bir inkübatörde 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve% 95 nemde tutun. Bakteriyel enfeksiyon için, 100 mikrolitre gecelik bakteri kültürünü, mililitre kloramfenikol başına 35 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren üç mililitre LB ortamına seyrelterek, pEVOL plazmidi ve SseJ geni içeren pWSK29 plazmidini barındıran alt kültür vahşi tip salmonella.
Beş ila yedi saat boyunca 250 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. HeLa hücre enfeksiyonunu başlatmak için, HeLa hücrelerini inkübatörden çıkardıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa% 10 FBS içeren 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Enfeksiyon başlayana kadar odayı karbondioksit inkübatörüne geri kaydırın.
Beş ila yedi saatlik inkübasyondan sonra, salmonella kültürünü, 600 nanometredeki optik yoğunluk bir mililitre DMEM büyüme ortamında 0.2 olacak şekilde seyreltin ve oda slaytının her bir kuyucuğuna gerekli miktarda salmonella inokulum ekleyin, böylece enfeksiyonun çokluğu 100 olur. Enfekte olmuş hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe ettikten sonra, hücre dışı salmonella'yı çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile üç kez yıkayın. Bu zaman noktasını enfeksiyondan sıfır saat sonrasına ayarlayın ve bir saat boyunca mililitre gentamisin başına 100 mikrogram içeren 500 mikrolitre tam ortam ekleyin.
İnkübasyondan sonra, yine, hücreleri daha önce gösterildiği gibi DPBS ile üç kez yıkayın ve oda slaytının her bir kuyucuğuna% 0.2 arabinoz, mililitre başına 10 mikrogram gentamisin ile desteklenmiş tam ortamın 500 mikrolitresini ekleyin. Bir kontrol deneyinde, TCO olmadan HeLa hücrelerinin benzer enfeksiyonlarını gerçekleştirin. Oda slaytını karbondioksit inkübatöründe 10 saat inkübe ettikten sonra, tüm ortamı TCO içermeyen taze tam ortamla değiştirin ve HeLa hücrelerini her biri önceden ısıtılmış DPBS ile 30 dakikalık bir aralıkta dört kez yıkayın.
Daha sonra hücreleri TCO olmadan taze tam ortamla yıkayın. Enfeksiyondan 12 saat sonra, ortamı hücrelerden aspire edin ve hücreyi önceden ısıtılmış DPBS ile iki veya üç kez yıkayın. Kuyucukların bir grubunda, 500 mikrolitre boya çözeltisi karışımı bir tane ekleyin ve aynı oda slaydının kuyucuklarının başka bir grubunda, boya çözeltisi karışımı iki 500 mikrolitre ekleyin.
Oda slaytlarını bir ve 1/2 ila iki saat boyunca karbondioksit inkübatörüne geri yerleştirin. Enfeksiyondan 13.5 ila 14 saat sonra, HeLa hücrelerini önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez durulayın ve FBS ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. 30 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi önceden ısıtılmış DPBS ile tekrar yıkayın ve ardından 30 dakikalık bir aralıkta dört kez taze DMEM ile yıkayın.
Enfeksiyondan 16 saat sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek HeLa hücrelerini paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti aspire edin. PBS ile üç kez durulayın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede PBS'de saklayın.
Hücreleri mikroskopa getirin ve görüntüleme odasını numune tutucudaki mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından, kuyucuktaki ortamı 0,4 mililitre taze yapılmış GLOX BME görüntüleme tamponu ile değiştirin. İlgilenilen bir HeLa hücresini tanımlamak için lazer gücünü yaklaşık bir miliwatt'a düşürün ve numuneyi düşük 647 nanometre lazer yoğunluklarıyla aydınlatırken odak düzlemini ve lazer ışını açısını ayarlayın.
HILO aydınlatma açısını ayarlayın. Hedef yapının kesirli sınırlı görüntüsüne bir referans yakalayın ve lazeri maksimum gücüne döndürerek floroforları karanlık duruma getirin. Ön amplifikatör kazancını üçe ayarlayın ve kare aktarımını etkinleştirin.
Ardından dSTORM ölçümlerinde daha yüksek hassasiyet için EM kazancını 200 olarak ayarlayın. Lazer gücünü, yanıp sönen olayların uzay ve zamanda ayrıldığı uygun bir seviyeye ayarlayın. Pozlama süresini 30 milisaniyeye ayarlayın ve almaya başlayın.
10.000 ila 30.000 kare elde edin. Benzer satın alma işlemini farklı yatırım getiri'lerinde tekrarlayın. dSTORM'un görüntülerin yeniden yapılandırılması için J görüntüsünü açın ve ham verileri içe aktarın.
Thunderstorm eklentisini açın ve cihaza karşılık gelen kamera ayarını yapılandırın. Analizi çalıştırmaya gidin ve görüntü filtreleme, yerelleştirme yöntemleri ve moleküllerin alt piksel lokalizasyonu gibi uygun ayarları yapın. Görüntü yeniden yapılandırmasını başlatmak ve işlem sonrası son sonuç analizine başlamak için Tamam'ı tıklatın.
TCO ile birleştirilen SseJ'yi eksprese eden Salmonella, Janelia Fluor 646 tetrazin ile muamele edilir ve TCO yokluğunda veya varlığında Janelia Fluor 646 floresan ile görüntülenir. SseJ'nin floresansı yalnızca TCO mevcut olduğunda algılanır. HeLa hücreleri, 16 saat boyunca psseJ-HA barındıran salmonella ile enfekte edilir, anti HA antikoru, LPS ve DAPI ile sabitlenir ve immün olarak boyanır.
Beklendiği gibi, enfekte olmuş hücrelerde SseJ bağımlı salmonella kaynaklı filamentler veya SIF'ler oluşur. TCO yokluğunda, amber kodonu baskılanmaz ve enfekte HeLa hücrelerinde SseJ'ye bağımlı SIF'ler yoktur. SseJ'e bağımlı SIF'ler, SseJ'nin genetik kod genişlemesi veya GCE kullanılarak SseJF10TCOHA ekspresyonu ile kurtarıldığını açıkça gösteren TCO varlığında gözlenir.
HeLa hücrelerinde salgılanan SseJF10TCOHA'nın iki alternatif boya karışımı bir ve iki boya karışımı kullanılarak SPIEDAC tıklama reaksiyonları yoluyla etiketlenmesi özgüllüğü burada gösterilmiştir. Click boya Janelia Fluor 646 TZ, TCO ve P vault plazmidi varlığında SseJ HA taşıyan vahşi tip Salmanella ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde herhangi bir arka plan etiketlemesi olup olmadığını gözlemlemek için daha fazla kullanıldı. SseJ, floresan sinyalinin SseJ'ye özgü olduğunu gösteren hücre içi veya spesifik olmayan floresan sinyalleri olmadan konakçı hücrenin sitoplazmasına salındı.
HeLa hücrelerinde GCE işaretli SseJ'nin süper çözünürlüklü görüntülemesi bu şekilde sunulmuştur. Gözlem altındaki bir HeLa hücresinin parlak alan görüntüsü burada gösterilmektedir. TCO ve Janelia Fluor 646 ile etiketlenmiş salgılanan SseJ'in kırınım sınırlı geniş alan görüntüsü ve SseJ dekorlu SIF'lerin karşılık gelen dSTORM görüntüsü burada sunulmaktadır.
Ek, kutulu bölgedeki süper çözümlenmiş bir SseJ'nin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. NCAA stok çözümleri NaOH'da hazırlandı. Medyaya eklemeden önce veya sonra nötralize etmeyi unutmayın.
İlgilenilen proteini etiketledikten sonra, hücreyi iyice yıkayın, böylece arka plan sinyali minimum olur. GCE prosedürümüzü takiben, artık bakterilerdeki herhangi bir virülans faktörünü etiketleyebilir ve görüntüleme tekniklerimizi kullanarak aktivitesini takip edebiliriz.
