This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Zigotik Embriyo Gelişimi <ol><li> Bitki Materyali <ol><li> Büyüme Medicago, bir 14 saatlik aydınlık periyoduyla serada 23 ° C / 19 ° C gündüz / gece sıcaklığı yabani tip Jemalong ya da yüksek oranda yeniden generable onun yakınındaki izogenik, (2HA olarak da bilinir) genotip Jemalong 2HA 13 truncatula. <ol><li> Suyun tohumu girin ve bir gece suda bekletin izin, böylece tohumun ekim önce Pierce (23 G iğne ile), tohum kaplama yüzeyi. Tam tohum örtecek kadar su ekleyin. </li><li> Saksı karışımı içinde her 15 cm çapında pota 3 tohum ekmek (10 kapların toplam) (kaba kum, perlit, lif-turba (1: 1: 1) artı Osmocote Exact Standardı 5 g: Yavaş salimli gübre) ve aktarma sera. Bitki tırmanmak sapları için pot ve çevre başına 1 bitki bir kafes tarafından var bu yüzden çimlenme sonrası sağlıklı fide saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Hasat Bölmeler <ol><li> W gelen bakla toplayınJemalong veya 2HA uygun erken embriyo aşamalarında elde etmek ild türü olarak ilk 9 nitelendirdi. Not: Farklı bölme aşamaları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir ve karşılık gelen embriyo aşamaları, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Ayrı aşamaları 6 ve 7 (Tablo 2) yardım etmek için sahneye 6 geçen süreyi. Tablo 1 gereğince kriterleri kullanılarak hasat farklı pod aşamalarını kontrol ölçün. </li></ol></li><li> Bölmelerinden ovüllerin Kesme ve embriyo aşaması kontrol <ol><li> Gerekirse tek başına ince forseps kullanarak bakla veya stereo mikroskop ve forseps gelen ovüllerin izole edin. Gerekirse embriyo aşaması hızla standart bileşik mikroskobu (Şekil 3B) kullanılarak kontrol edilebilir. </li><li> Arabic 7.5 g sakız, 100 g klor hidrat, 5 ml gliserol, damıtılmış deiyonize su 60 ml su ihtiva eden Hoyer çözeltisi modifiye hazırlayın. 3-5 saat veya gece boyunca karıştırılarak çözülür. </li><li> Daha fazla rafine içind mikroskopi modifiye Hoyer çözümü 15,16 disseke ovüllerin temizleyin. Dikkatle berrak olana kadar oda sıcaklığında (ovül karşılamak için yeterli) Hoyer çözeltisi, küçük bir hacim içinde sağlam ovüllerin ve yeri al. </li><li> Diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile örnekleri görüntüleyin. Bir dijital fotoğraf makinesi 9 (Şekil 2) iwth görüntüler çekin. </li><li> Pod merkezi bölgesinde en üniforma ovüllerin edinin ve gerekli sayıda birikir. Bir örnek, Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. Daha fazla analiz için gerekli sıcaklıkta buz ve mağaza ovüllerin (-80 ° C için nükleik asitler) toplayın. NOT: histolojik kesitlerin analizi, transmisyon elektron mikroskobu ile ilgili detaylar için, ve in situ melezleme kağıtları 8,9 bakınız. </li></ol></li></ol> İn Vitro 2. Somatik Embriyo Gelişimi <ol><li> Bir M. kullanın truncatula çeşidi tŞapka kolaylıkla kültür embriyoları meydana edebilmektedir. Yaprak eksplantlarından için bu protokol için 2-4 aylık olduklarında 2HA bitkiler 13,17 kullanın. </li><li> Bir uzatma kök son neredeyse tamamen genişletilmiş üç yapraklı yapraktan broşürler alın. </li><li> Dehidratasyonu önlemek için bir kültür tencerede nemli kağıt havlu üzerinde üç yapraklı yaprakları tutun. NOT: üç yapraklı yaprak hasat edilir sonra da en az gecikmeyle kullanılabilir olması gerekir. </li><li> Kültür ortamının hazırlanması <ol><li> 4: 1: agar 5 orta (ağırlık% 0,8: hacim) içinde 9 cm Petri kapları P4 10 kullanın. Not: P4 10: 4: 1: 5, orta P4 bazal ortamı 18 artı 10 uM 1-naftalenasetik asit (NAA), 4 uM 6-benzilaminopurin (BAP), 1 uM absisik asit (ABA) ve 5 uM gibberellik oluşmaktadır asit (GA). GA + ABA kullanımı embriyo oluşumunu hızlandırır ve embriyo sayısı 14 maddi artışlara neden olmaktadır. </li><li> 1 L P4 bazal ortamı Makyaj; (calciu yaptığı büyük tuzlarından oluşan,) ayrı ayrı m minör tuzları ve vitaminler (Tablo 3), şelatlanmış demir (ayrı makyaj), kazamino asitler (kasein hidrolizat), 30 g sakroz, 8 g agar. </li><li> Uygun parçalar halinde -20 ° C&#39;de ana tuzlar, kalsiyum, kazamino asitler, minör tuzları ve vitaminler mağazası stok çözeltileri. 4 ° C&#39;de şelatlı demir saklayın. </li><li> • 7H FeSO 4 1,853 g eklenirken karıştırılırken iyonu giderilmiş damıtma suyu yaklaşık 900 ml Na2EDTA • 7.44 g 2H 2 O çözündürülmesiyle şelatlı demir (200x) makyaj, daha sonra 98-99 ° C&#39;ye kadar bir çözüm getirmek 2 O. Terkip maddeleri, çözündüğü zaman son olarak 1 L tamamlanır. Amber içinde saklayın 4 ° C&#39;de şişe renkli. </li><li> Tablo 4&#39;de olduğu gibi hisse senedi çözümleri ile P4 bazal ortamı Makyaj. Ortamda hormonlar 10 uM NAA, 4 iM BAP, 1 uM ABA, 5 mcM GA (Tablo 4 ve Tablo Spesifik Malzeme bakınız). NAA Ekleve önceki BAP otoklavda bir şınngaya bağlanmış bir 0.22 um filtre ile filtre sterilizasyonu, otoklav yaklaşık 55 ° C&#39;ye kadar soğutulduktan sonra, ABA ve GA ekleyin. Nazik dönen ile iyice karıştırın. </li><li> Otoklav öncesinde 1 M KOH ile pH 5.8 medyayı ayarlayın. 20 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklav. </li><li> Filtre sterilize ABA ve GA, ekleme ve bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine steril 9 cm Petri kapları içine medya yaklaşık 25 ml dökün otoklav sonra. Serin ve ağar kapaklı kapalı olarak ayarlamanıza olanak tanır. Sonra kapağı üzerine koymak ve kapağın üzerinde hiçbir yoğuşma olmadığından emin olun. (Kapak kondens önlemek için bir karton kutu içinde) 4 ° C&#39;de gerekli ve mağaza gibi etiket. </li></ol></li><li> Yaprak dokusu sterilizasyonu <ol><li> UV-sterilize laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine çalışın. </li><li> Yeri önceden otoklavlanmış yay çay demlik mesh topun içine bırakır. </li><li> Bir cul etanol:% 70 (v v) yaprakları içeren çay demliği daldırın30 saniye boyunca Ture pot. NOT: Bu prosedürde tüm adımları kullanın 250 ml otoklavlanırlar kapak polikarbonat kültür tencere vida. </li><li> Boşaltın ve daha sonra transferi ve 1 yaprak dokusu sokmak: 8 (hac: hac) ile seyreltilmiş ağartma maddesi (% 0.5 klorin), 10 dakika boyunca karıştırılır. Zaman zaman hafifçe karıştırılır. </li><li> Çamaşır suyu boşaltın ve steril deiyonize distile su içeren bir kültür tencerede çay demliği aktarın. Yavaşça girdap ve fazla suyu boşaltın. Steril deiyonize distile su taze kültür pot ile bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Steril deiyonize damıtılmış su, taze kültür kap steril forseps çay infüzyon edicinin yaprakları çıkarın. Steril kapağını tekrar ve tersini ve dönen tarafından durulayın. Eksplantlar hazırlamak için hazır olana kadar steril su üzerinde yüzen yapraklar bırakın. </li></ol></li><li> Eksplantlarındaki hazırlanması ve Kaplama <ol><li> Steril teknikleri kullanarak, bir neşter ile kenarından bireysel sterilize broşürler Döşeme ve iki ya da thr içine kalan dikdörtgen kesilmişdikdörtgen eksplantlar her eksplant (Şekil 5A) merkezinde orta damar ile (8-10 x 3-5 mm) ee. NOT: eksplant büyüklüğü ilk Kalluslaştırma başlatılması oldukça önemlidir. Take-away gıda kapları steril kapaklarındaki kesme yürütmek. </li><li> Plaka 9 cm çapında Petri kapları (Şekil 5B) agar-katılaşmış kültür ortamında 6 eksplantlar. Her zamanki yaprak yönünü korumak için aşağı eksplantlar abaxial tarafı Plate. </li><li> Yemeğin etrafında gergin Parafilm (Şekil 5C) ile Petri kapları mühür. Doku şimdi inkübasyon için hazırdır. </li></ol></li><li> Doku Kuluçka <ol><li> Kültür süresi boyunca sıcaklığı kontrol edilen bir oda ya da büyüme odasında 28 ° C&#39;de karanlıkta inkübe edin. NOT: eksplantlar, dediferansiyonunu başlatmak hücre bölünmesi, çoğalması (kallus oluşumu) ve embriyogenez (farklılaşma) uğrayacaktır. </li><li> Farklılaştırarak expla altkültürütaze ortama 3 hafta sonra NTS. Bu altkültür bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabinede, steril paslanmaz çelik spatula ve forseps kullanılarak tüm eksplant aktarın. Kalluslu oluşur ve kallus Şekil 5C büyük bir boyutunu aşıyor gibi taze ortama alt kültüre zaman bireysel yara dokusunun% 50 transfer. </li><li> Yaklaşık 4 hafta içinde ilk embriyoların uyun. Senkronize bir derece olsa da, 4-8 haftalık kuluçka dönemi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak (Şekil 6A, B). Deneysel hedefleri doğrultusunda bir mikroskop ve işlem altında toplayın. </li><li> Eksplantlar 3 ay boyunca embriyo üretmeye devam edeceğiz, böylece her 3 haftada bir altkültürü ve periyodik embriyolar kaldırmak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

açıklanan protokoller oldukça yalındır ve tüm çağdaş hücre ve moleküler teknikler ile baklagil embriyogenezde soruşturma izin verir. Bu avantaj ve in vivo ve in vitro yaklaşımlar hem de dezavantajları vardır tanır. Hem olgunlaşmamış tohumlar 19 kültürüne göre erken embriyogenez daha fazla odaklanmak sağlar. In vivo çalışmalarda durumunda neler açıklanan ağırlıklı birçok embriyo çalışmaları için uygundur b?...

Hasat alan ve toplam üretim 1&#39;de hububat ikinci baklagiller, yaklaşık 20.000 tür ve Leguminosae (Fabaceae veya) ailesi ile yüksek bitkilerin üçüncü büyük aileyiz vardır. Soya üçüncü büyük kültür bitkisidir. Tahıl baklagiller diyet proteini üçte biri ve insan tüketimine 2 bitkisel yağ üçte biri ile ilgili sağlar. Onların N 2 sabitleme kapasitesi ile Baklagiller ayrıca tohum kotiledonlarında soya, mağazalar protein ve yağ gibi. Sürdürülebilir tarımsal sistemlere Medicago truncatula katkıda önemli genetik ve genomik kaynakların 3,4 ile genetik ve genomik baklagil modelidir. M. iken truncatula giderek baklagil tohum biyolojisi 5-7 ve embriyojenezi 8,9 incelemek için istihdam edilmiştir baklagil-rhizobium simbiyoz 4 anlamada ilerlemeler sağladı. Arabidopsis embryogenesis yoğun 10,11 okudu ama ben olmuştursa olmayan baklagil ve embriyogenez ayrıntıları Medicago&#39;dan 8,10 özdeş değildir. M&#39;de zigotik embryogenesis truncatula farklı bir çok hücreli hipofiz, bir endoployploid uyutucuya ve bazal transferi hücresinin 8, ilginç özelliklere sahiptir. Somatik embriyojenez (SE), yaygın olarak bitkiler 12 rejenerasyonu için kullanılır. Baklagil modelinde M. In truncatula, ebeveyn Jemalong dan geliştirilmiştir tohum çizgisi Jemalong 2HA (2HA) somatik embriyogenez 13 yüksek oranlarına sahip. üretilen embriyoların sayısı son zamanlarda önemli ölçüde köklü orta 14 hem gibberelik asit (GA) ve absisik asit (ABA) eklenerek artış olmuştur. GA ve ABA genellikle antagonistik 14 hareket verilen sıradışı sinerjik bu durumda GA ve ABA hareket içinde. kallustan embriyoların embriyogenez evresi hali hazırda visuall saptanmasına olanak sağlamaktadır yüzeyi üzerinde gelişebiliry ve kolaylıkla hasat edildi. Somatik embriyojenez incelenmesi (Jemalong) (2HA) embriyonik ve embriyonik olmayan olan izojenik hatlarının yakınında kolaylaştırır olması ve in vivo ve farklı deneysel olanaklar sağlar in vitro sistemlerde de sahip. Embriyo gelişimi hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması anlayış tohum ve bitki gelişimi için gereklidir. Baklagiller, diğer çeneklilere olduğu gibi, insan beslenmesi için kullanılan ürünler depolamak embriyo kotiledonları olduğunu. Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve doğru embriyo desenlendirme içerir. 8 gün sonra gübreleme, M&#39;de truncatula embriyo erken kotiledon aşamaları ulaşır. morfolojik karakterizasyon tam sera koşullarında döllenme sonrasında gün gösterilmez. Böylece, gelişmekte olan embriyo aşamasına belirtmek için verimli bir standart yaklaşım, genetik REGUL okuyan değerlidirErken zigotik embriyojenezin tirme. Bu yazıda, baklagil modelde M. de embriyogenezin biyolojik çalışmalar için gelişen embriyolar toplamak için iki standart protokolleri sağlamak truncatula. İlki ikinci kolayca erişilen büyük embriyo sayıları sağlamak için kültür yaprak eksplantlarından yoluyla somatik embriyogenesis ise embriyogenez ve pod morfolojisi ilişkilendirerek Zigotik embriyolar toplamaktır.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Dissolve in small amount of ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Or similar, with suitable optics</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavable</td></tr></tbody></table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

Tek bir hücre zigot başlayarak Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve morfogenez geçer ve morfolojik öncesi küresel, küresel, kalp, torpido ve kotiledon aşamalarında ile karakterizedir. Bu ilerici gelişme karmaşık bir moleküler ağ sıkı yönetmelik altındadır. Benzer bir gelişme aşamasında yeterli bir erken embriyolar Hasat erken embriyogenez hücresel ve moleküler düzenleme incelemek için gereklidir. Medicago&#39;dan örneğin 8 gün erken kotiledon aşamaya ulaşmak için truncatula ise erken embriyogenez kısa hızlı morfolojilerinden uğrar çünkü bu kolay değildir. Burada, iki yaklaşımlarla sorunu gidermek. İlki zigotik embriyo aşamasına işaret yardımcı embriyo gelişimi ve bakla morfolojisi arasında bir bağlantı kurar. Bu, özellikle bakla spiraller ve dikenler geliştirilmesi sayısına dayanır. In vivo s tamamlayacak alternatif bir yoltudies somatik embriyoların üretilmesi için kültür yaprak eksplantlarından yoluyladır. Orta sıra dışı bir hormon kombinasyonu içeren - bir oksin (1-naftalenasetik asit), bir sitokinin (6-benzilaminopurin), absisik asit ve gibberellik asit. farklı aşamalarında diseksiyon olmadan kallus dışında büyüyen ayırt edilebilir.

F - Farklı embriyo aşamaları Şekil 2A gösterilmiştir ise F - Farklı embriyo aşamalarına karşılık gelen zigotik embryogenesis farklı pod yapılarda Şekil 1A gösterilmiştir. Aynı aşamada bakla seçerek, Yumurtacığa örnekleri oldukça tekdüze (Şekil 3A) elde edilebilir ki. RT-qPCR embriyoyu kullanarak belirli genler kolayca algılanır ve zaman derste 9 değerlendirilebilir. Bazı ek diseksiyon embriyo <st...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Görüntüleme.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genetik

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Gelişim Biyolojisi

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biyoloji

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Tek Hücreli Dizileme için Gastrolama Fare Embriyosunun İzolasyonu ve Genotiplemesi

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Çözünürlüğünde Soya Özgü Mutant Embriyoları Analiz Etmek İçin Bir Boru Hattı

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Mutant Bütün Fare Embriyolarının Tek Hücreli RNA Dizilimi: Epiblasttan Gastrulasyonun Sonuna Kadar

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon