This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. 접합체 배아 개발 <ol><li> 식물 재료 <ol><li> 성장 Medicago는 14 시간의 광주와 유리 공장과 23 ° C / 19 ° C 일 / 밤 온도에서 야생형 Jemalong 또는 매우 다시 생성 가능한 그 근처 동종 (2HA라고도 함) 유전자형 Jemalong 2HA 13 truncatula. <ol><li> 물이 씨앗을 입력하고 물에 하룻밤 담가 허용되도록 씨앗을 파종하기 전에 피어스 (23 G 바늘) 씨 코트의 표면. 완전히 씨앗을 충당하기 위해 충분한 물을 추가합니다. </li><li> 포팅 혼합물의 각 15cm 직경 냄비에 3의 씨앗을 뿌리고 (10 냄비의 총) (굵은 모래, 펄라이트, 야자 껍질의 섬유 - 이탄 (1 : 1 : 1)을 더한 Osmocote 정확한 표준의 5g : 느린 방출 비료) 및 전송 유리 공장. 식물이 올라 줄기를 위해 냄비와 서라운드 당 1 공장은 격자에 의해이 때문에 발아 후 건강한 묘목을 유지. </li></ol></li></ol></li><li> 수확 포드 <ol><li> W에서 포드를 수집Jemalong 또는 2HA 적절한 초기 배아 단계를 얻기 ILD 유형은 제 9 기재. 주의 : 다른 포드 스테이지가도 1에 도시되고 대응하는 배아 단계는도 2에 도시되어있다. </li><li> 분리 스테이지 (6 및 7) (표 2)을 돕는 단계 (6)로부터의 경과 시간. 표 1에서와 같은 기준을 사용하여 수확에서 다른 포드 스테이지를 점검 측정한다. </li></ol></li><li> 포드에서 난자를 해부 및 배아 단계를 확인 <ol><li> 필요에 따라 단독으로 미세 집게를 사용하여 포드 또는 스테레오 해부 현미경과 집게에서 난자를 분리합니다. 필요한 경우 배아 단계 신속 표준 화합물 현미경 (도 3b)을 이용하여 확인할 수있다. </li><li> 아랍어 7.5 g 검, 100g의 클로 랄 하이드레이트, 5 mL의 글리세롤, 증류수 60 mL의 탈 이온수를 함유하는 용액을 호이어의 변성 준비한다. 3-5 시간 또는 하룻​​밤 교반 용해. </li><li> 더 조정을 위해D 현미경 수정 호이어의 솔루션 (15, 16)의 해부 난자을 취소합니다. 조심스럽게 명확 때까지 실온에서 (난자를 커버하기에 충분) 호이어의 솔루션의 작은 볼륨에서 그대로 난자와 장소를 선택하십시오. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 광학 샘플을 볼 수 있습니다. 디지털 카메라 (9) (그림 2) iwth 이미지를 캡처합니다. </li><li> 포드의 중심 지역에서 가장 균일 한 난자를​​ 확보하고 필요한 수를 축적. 일례가도 3a에 도시되어있다. 추가 분석을 위해 요구되는 온도에서 얼음 저장에 난자 (-80 ° C에 대한 핵산)를 수집합니다. 참고 : 조직 학적 섹션의 분석, 투과 전자 현미경에 대한 자세한 내용 및 현장 하이브리드에 논문 8, 9를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 체외 2. 체세포 배아 개발 <ol><li> 엠을 사용하여 truncatula 품종의 T모자는 쉽게 문화의 배아를 형성 할 수있다. 잎 외식이 프로토콜 2-4 개월이다 2HA 공장 13, 17을 사용합니다. </li><li> 신장 줄기의 최신 거의 완전히 확장 세 잎의 잎에서 전단지를 가져 가라. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 문화 냄비에 축축한 종이 타월에 세 잎의 잎을 유지합니다. 주 : 세 잎의 잎이 수확되면 그들이 최소한의 지연으로 활용 될 필요가있다. </li><li> 배양 배지의 제조 <ol><li> 4 : 4 : 1 : 한천에 5 배지 (W 0.8 % : V)에 9cm 페트리 접시 (P4) (10)를 사용합니다. 참고 : P4 10 : 4 : 1 : 5 매체는 P4의 기저 매체 18 플러스 10 μm의 1 naphthaleneacetic 산 (NAA), 4 μm의 6 benzylaminopurine (BAP), 1 μm의 아브 산 (ABA)와 5 μm의 지베렐린으로 구성 산 (GA). GA + ABA의 사용은 배아 형성을 가속화하고 배아 번호 14의 실질적인 증가를 야기한다. </li><li> 1 리터의 P4의 기저 매체 메이크업; (calciu을 주요 염으로 구성된) 별도로 미터 사소한 염과 비타민 (표 3), 킬레이트 철 (별도 구성), 카사 미노산 (카제인 가수 분해물), 30g의 자당, 8g 한천. </li><li> 적당한 분량 씩 -20 ° C에서 주요 염, 칼슘, 카사 미노산, 약간의 소금과 비타민의 상점 재고 솔루션을 제공합니다. 4 ℃에서 킬레이트 철을 저장합니다. </li><li> • 7H 다음날에 FeSO4의 1.853 g을 추가하는 동안 교반하면서 탈 증류수 약 900 ml의 나 2 EDTA •의 7.44 g의 2H 2 O를 용해하여 킬레이트 철 (200X)를 확인 후 98 ~ 99 ° C의 솔루션을 가지고 2 O 성분이 용해 될 때 마지막으로 1 리터까지합니다. 호박에 보관은 4 ℃에서 병 색깔. </li><li> 표 4에서와 같이 주식 솔루션 (P4)의 기초 배지를 확인합니다. 매체의 호르몬은 10 μm의 NAA, 4 μM의 BAP, 1 μM의 ABA, 5 μm의 GA (표 4 및 특정 재료 표 참조). NAA 추가BAP 전에 가압 멸균 주사기에 부착 0.22 μm의 필터로 여과 멸균하여, 오토 클레이브 약 55 ° C로 냉각 후 ABA 및 GA를 추가한다. 부드러운 소용돌이에 의해 잘 섞는다. </li><li> 고압 증기 멸균에 앞서 1 M KOH으로 pH 5.8로 미디어를 조정합니다. 20 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브. </li><li> 필터 살균 ABA와 GA를 추가하고 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 멸균 9cm 페트리 접시에 미디어의 약 25 ml에 부어 고온 가압 멸균 한 후. 쿨과 한천은 뚜껑으로 설정할 수 있습니다. 그런 다음 뚜껑에 넣고 뚜껑에는 응축수가없는 있는지 확인하십시오. (뚜껑 응축을 방지하기 위해 판지 상자) 4 ° C에서 요구 및 저장소로 레이블. </li></ol></li><li> 잎 조직의 살균 <ol><li> 자외선 살균 층류 후드 또는 생물 학적 캐비닛에 작업 할 수 있습니다. </li><li> 장소는 이전에 멸균 봄 차 주입기의 메쉬 볼에 나뭇잎. </li><li> 막 다른 에탄올 70 %에 (V V)를 잎을 포함하는 차 주입기를 담가30 초 동안 진짜야 냄비. 참고 :이 절차의 모든 단계를 사용할 250 ml의 멸균되는 캡 폴리 카보네이트 문화 냄비 나사. </li><li> 배수 후 전송하고 1 잎 조직 몰입 : 8 (V : V)로 희석 표백제 (0.5 % 염소)을 10 분 동안. 때때로 부드럽게 소용돌이. </li><li> 표백제를 배출하고 멸균 탈 증류수를 포함하는 문화 냄비에 차 주입기를 전송합니다. 부드럽게 소용돌이와 여분의 물을 배수. 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 한 번 더 반복한다. </li><li> 멸균 탈 증류수 신선한 문화 냄비에 멸균 집게와 차 주입기에서 잎을 제거합니다. 멸균 캡 나사와 반전과 소용돌이로 헹군다. 외식을 준비 할 준비가 될 때까지 멸균 물에 떠있는 나뭇잎을 남겨주세요. </li></ol></li><li> 의 Explants 준비 및 도금 <ol><li> 멸균 기법을 사용하여, 메스 에지로부터 개별 멸균 전단을 트림 및 2 개 THR로 나머지 직사각형을 잘라직사각형 이식편 각 이식편 (도 5a)의 중앙에 중간 정맥과 (80-10 X 3-5mm)를 EE. 주 : 이식편의 크기는 제 캘러스를 개시에 매우 중요하다. 테이크 아웃 식품 용기에서 멸균 뚜껑에 절단을 수행하십시오. </li><li> 플레이트 9cm 직경 페트리 접시 (그림 5B)에서 한천 화 배지에 6 외식. 보통 잎의 방향을 유지하기 위해 아래로 외식 배축 측 플레이트. </li><li> 접시 주위에 뻗어 파라 필름 (그림 5C)와 페트리 접시를 밀봉합니다. 조직은 지금 배양을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 조직 배양 <ol><li> 문화 기간 동안 온도 조절 실 또는 성장 캐비닛에 28 ° C에서 어둠 속에서 번호판을 품어. 참고 : 외식이 탈분화를 시작 세포 분열, 증식 (캘러스 형성)과 배아 (차별화)을 받게 될 것이다. </li><li> 차별화 expla을 배양신선한 매체에 3 주 후에 NTS. 이 계대 배양에서 층류 후드 또는 생물 캐비닛, 멸균 스테인리스 주걱과 집게를 사용하여 전체 이식편 옮긴다. 캘러스가 발생 캘러스는도 5C에서 가장 큰 하나의 크기를 초과하는 신선한 배지로 계대 배양 될 때, 개별 캘러스의 50 %를 전달. </li><li> 약 4 주 만에 처음으로 배아를 관찰한다. 동시성의 정도가되지만, 4-8 주간의 배양 기간 동안 상이한 배아 수집 단계 (도 6a를, B). 실험 목적에 따라 해부 현미경 및 프로세스에 따라 수집합니다. </li><li> 외식 3 개월 동안 배아를 생산하기 위해 계속 수 있도록 매 3 주 배양과 정기적으로 배아를 제거합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests.

설명 프로토콜은 상대적으로 정직하고 모든 현대의 세포 및 분자 기술과 콩과 식물 배아의 조사를 할 수 있습니다. 우리는 장점과 생체 내 및 생체 외 접근 모두 단점이 있다는 것을 인정한다. 모두 미숙 씨 (19)의 문화에 비해 초기 배 발생에 더 초점을 수 있습니다. 생체 내 연구의 경우에 무엇을 설명하는 것은 주로 많은 배아 연구에 적합한 포드...

수확 면적과 총 생산량 1 곡물에 두 번째 콩은 약 20,000 종과 콩과 (또는 콩과 (Fabaceae)) 가족과 함께 고등 식물의 세 번째로 큰 가족입니다. 콩은 세 번째로 큰 재배 작물이다. 곡물 콩류는식이 단백질의 3 분의 1과 인간의 소비를 2 식물성 기름의 3 분의 1에 대해 제공합니다. 자신의 N (2) 고정 용량 콩은 그 씨앗의 자엽 콩, 저장 단백질과 기름처럼. 지속 가능한 농업 시스템에 Medicago의 truncatula 기여 상당한 유전자와 게놈 자원 3,4와 유전자 및 게놈 콩과 식물 모델이다. M. 동안 truncatula는 점점 콩과 식물 씨앗 생물학 5-7 및 배아 8,9을 연구하기 위해 사용 된 콩과 식물 - 근류균 공생 (4) 이해의 발전을 가능하게했다. 애기 배아 광범위 10,11 공부하지만 난되었습니다SA 비 콩과 식물과 배아의 세부 사항은 Medicago 8,10 동일하지 않다. 엠의 접합체 배아 truncatula는 특유의 다세포 뇌하수체, endoployploid suspensor 및 기저 전송 세포 8, 흥미로운 기능을 가지고 있습니다. 체세포 배 (SE)는 일반적으로 식물 (12)를 재생하는 데 사용됩니다. 콩과 식물의 모델 (M)에서 truncatula는, 부모 Jemalong에서 개발 된 종자 라인 Jemalong 2HA (2HA)는 체세포 배 (13)의 높은 비율을 가지고있다. 생성 된 배아의 개수는 최근 실질적 노포 매체 (14)에 모두 산 지베렐린 (GA)과 아브 산 (ABA)을 추가하여 증가하고있다. GA와 ABA는 일반적으로 길항 (14)의 역할을 주어진 특이한 시너지이 경우 GA 및 ABA의 행동합니다. 캘러스로부터 생성 된 배아는 배아의 단계를 용이 visuall 결정될 수 있도록 표면에 개발Y 쉽게 수확. 체세포 배의 조사 (Jemalong) (2HA) 배 발생 및 비 배아있는 동종 라인 근처에 용이 갖는 생체 내에서 서로 다른 실험 가능성을 제공 체외 시스템을 모두 가지고. 배아 개발의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이해 종자 및 식물 개발을위한 필수적이다. 콩에서 다른 쌍떡잎 식물에서와 같이, 이는 인간의 영양 섭취에 사용되는 제품을 저장 배아 자엽이다. 초기 배 발생이 빠른 세포 분열, 그리고 올바른 배아 패턴을 포함한다. 약 팔일 수정 후, M.에서 truncatula 배아 초기 자엽 단계에 도달한다. 형태 학적 특성은 정확하게 온실 조건의 수정 후 일에 의해 표시되지 않습니다. 따라서, 개발 배아의 무대를 표시 할 수있는 효율적인 표준화 된 접근 방식은 유전 regul 연구에 가치가있다초기 접합체 배아의 ATION. 본 논문에서는 콩과 식물 모델 엠에서 배아의 생물학적 연구 개발 배아를 수집하기 위해 두 개의 표준화 된 프로토콜을 제공 truncatula. 첫 번째를 손쉽게 대형 배아 번호를 제공하기 위해 배양 잎 외식 통해 체세포 배는 배 발생 동안 포드 형태를 연결하여 접합체 배아를 수집하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Dissolve in small amount of ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Or similar, with suitable optics</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavable</td></tr></tbody></table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

단일 세포 접합자부터 초기 배 발생이 빠른 세포 분열 및 형태 형성을 통해 진행하고, 형태 학적으로 전 구형, 구형, 심장, 어뢰 및 자엽 단계를 특징으로한다. 이 진보적 개발 복잡한 분자 네트워크의 타이트한 규제 받고있다. 개발의 유사한 단계에서 충분한 초기 배아를 수확하는 것은 초기 배아의 세포 및 분자 규제 조사를 위해 필수적이다. Medicago 예 : 팔일이 초기 자엽 단계에 도달 truncatula 동안 초기 배 발생이 짧은 빠른 형태 형성을 거쳐 때문에 이것은 간단하지 않다. 여기서 우리는 두 가지 방법으로 문제를 해결. 첫 번째는 접합체 배아의 단계를 나타내는 데 배아 개발 및 포드 형태 사이의 연결을 설정합니다. 이것은 특히 포드 나선과 등뼈의 개발의 수에 기초한다. 생체의를 보완하는 다른 방법tudies는 체세포 배아를 생산하는 배양 잎 외식를 통해입니다. 매체는 비정상적인 호르몬의 조합을 포함 - 옥신 (1 naphthaleneacetic 산), 사이 토키 닌 (6 benzylaminopu​​rine), 아브 산, 지베렐린 산을. 다른 단계는 절개없이 캘러스의 성장 식별 할 수 있습니다.

F - 다른 배아 단계는도 2a에 도시 동안 F - 다른 배아 단계에 해당하는 접합체 배아 다른 포드 구조에 대해서는 그림 1A에 표시됩니다. 동일한 단계에서 포드를 선택함으로써, 난자의 샘플 상당히 균일 (도 3a)를 얻을 수 있음. RT-qPCR의 배아를 이용하여 특정 유전자는 쉽게 검출 및 시간 과정 연구 9를 평가할 수있다. 일부 추가 ?...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K 조회수.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

비디오: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

연구

유전학

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

발생학

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

생물학

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분해능에서 계통 특이적 돌연변이 배아를 분석하기 위한 파이프라인

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜

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CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

Chimeras의 생성에 대한 Medaka의 태아 및 세포 이식의 Dechorionation

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리