This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Zygotic Sviluppo embrionale <ol><li> Impianto Materiale <ol><li> Far crescere la Medicago truncatula wild type Jemalong o il suo vicino isogenico, altamente ri-generabile genotipo Jemalong 2HA 13 (noto come 2HA) in una serra con un fotoperiodo 14 ore e 23 ° C / 19 ° C di temperatura giorno / notte. <ol><li> Pierce la superficie del rivestimento del seme (con un ago G 23) prima di seminare il seme in modo che l&#39;acqua è permesso di entrare il seme e ammollo in acqua durante la notte. Aggiungere acqua sufficiente a coprire interamente il seme. </li><li> Seminare 3 semi in ogni 15 centimetri pentola diametro (totale di 10 vasi) in miscela di impregnazione (grossa sabbia, perlite, fibra di cocco-peat (1: 1: 1) più 5 g di Osmocote standard Exact: concime a lenta cessione) e trasferimento serra. Conservare la piantina più sano dopo la germinazione per cui vi è 1 pianta per vaso e surround un traliccio per l&#39;impianto nasce a salire. </li></ol></li></ol></li><li> Baccelli raccolta <ol><li> Raccogliere baccelli del wtipo ild Jemalong o 2HA per ottenere le opportune fasi embrione precoce come prima descritto 9. NOTA: Le diverse fasi pod sono mostrati in figura 1 e le fasi embrionali corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. </li><li> Verificare le diverse fasi pod al momento della raccolta in base a criteri come da tabella 1. Misurare il tempo trascorso dallo stadio 6 per aiutare fasi distinte 6 e 7 (Tabella 2). </li></ol></li><li> Dissezione ovuli da baccelli e controllando la fase embrionale <ol><li> Isolare ovuli da cialde utilizzando una pinza sottile da solo o un microscopio da dissezione stereo e pinze, se necessario. Se necessario, la fase embrionale può essere rapidamente controllata usando un microscopio composto standard (Figura 3B). </li><li> Preparare modificato soluzione di Hoyer contenente 7,5 g gomma arabica, 100 g di cloralio idrato, 5 ml di glicerolo, 60 ml di acqua distillata deionizzata. Sciogliere mescolando per 3-5 ore o durante la notte. </li><li> Per ulteriori affinared microscopia cancellare gli ovuli sezionato in soluzione 15,16 modificata di Hoyer. Prendere con cautela ovuli intatti e posto in un piccolo volume di soluzione di Hoyer (sufficiente a coprire l&#39;ovulo) a temperatura ambiente fino chiaro. </li><li> Guarda i campioni con contrasto interferenziale differenziale (DIC) ottica. Catturare le immagini iwth una fotocamera digitale 9 (Figura 2). </li><li> Ottenere gli ovuli più uniformi dalla regione centrale del baccello e accumulare il numero desiderato. Un esempio è mostrato in Figura 3A. Raccogliere gli ovuli su ghiaccio e conservare a temperatura desiderata (acidi -80 ° C per nucleici) per ulteriori analisi. NOTA: Per i dettagli sulla analisi delle sezioni istologiche, microscopia elettronica a trasmissione, e ibridazione in situ consultare documenti 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Somatic sviluppo embrione in vitro <ol><li> Utilizzare un M. truncatula cultivar tcappello è in grado di formare facilmente embrioni in coltura. Per questo protocollo per espianti fogliari utilizzare le piante 2HA 13,17 che sono 2-4 mesi di età. </li><li> Prendere volantini dall&#39;ultima foglia trifogliato quasi completamente ampliata di uno stelo allungamento. </li><li> Mantenere le foglie trifogliolate su carta umida spugna in una pentola coltura per evitare la disidratazione. NOTA: Una volta che le foglie trifogliolate vengono raccolti hanno bisogno di essere utilizzato con un ritardo minimo. </li><li> Preparazione del terreno di coltura <ol><li> Utilizzare il P4 10: 4: 1: 5 medie agar (0,8% w: v) in 9 piatti cm Petri. NOTA: Il P4 10: 4: 1: 5 media consiste mezzo P4 basale 18 più 10 mM di acido 1-naftalenacetico (NAA), 4 mM 6-benzilaminopurina (BAP), 1 mM di acido abscissico (ABA) e 5 mM gibberellico Acido (GA). L&#39;uso di GA + ABA accelera la formazione dell&#39;embrione e provoca un aumento sostanziale nel numero di embrioni 14. </li><li> Portare il supporto basale P4 in 1 L; costituito da importanti sali (fare Calcium separatamente), sali e vitamine minori (Tabella 3), di ferro chelato (make up a parte), Casamino acidi (caseina idrolizzato), 30 g di saccarosio, 8 g di agar. </li><li> Conservare le soluzioni stock di grandi sali, calcio, acidi, sali Casamino minori e vitamine a -20 ° C in aliquote adatti. Conservare ferro chelato a 4 ° C. </li><li> Portare il ferro chelato (200x) sciogliendo 7,44 g di Na 2 EDTA • 2H 2 O in circa 900 ml di acqua distillata deionizzata agitando, quindi portare la soluzione a 98-99 ° C durante l&#39;aggiunta di 1.853 g di FeSO 4 • 7H 2 O. Infine portare a 1 L quando gli ingredienti sono sciolti. Conservare in ambra bottiglie a 4 ° C colorato. </li><li> Portare il mezzo basale P4 con le soluzioni madre come in Tabella 4. Gli ormoni nel mezzo sono 10 pM NAA, 4 mM BAP, 1 pM ABA, 5 mM GA (vedere Tabella 4 e Materiali specifici Tabella). Aggiungere la NAAe BAP prima autoclave e aggiungere ABA e GA dopo autoclavaggio e raffreddamento a circa 55 ° C, per mezzo del filtro di sterilizzazione con un filtro di 0,22 micron attaccato ad una siringa. Mescolare bene agitando delicatamente. </li><li> Regolare i media a pH 5,8 con 1 M KOH prima della sterilizzazione in autoclave. Autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Dopo autoclave aggiungere il filtro ABA sterilizzato e GA, e versare circa 25 ml di media in sterili 9 centimetri piastre di Petri in una cappa a flusso laminare o un armadietto a rischio biologico. Fresco e lasciare che l&#39;agar impostato con il coperchio. Poi mettere il coperchio e assicurarsi che non vi è alcuna condensa sul coperchio. Etichetta come richiesto e conservare a 4 ° C (in una scatola di cartone per evitare che il coperchio di condensa). </li></ol></li><li> Sterilizzazione di Leaf Tissue <ol><li> Lavorare in una cappa a flusso laminare-UV sterilizzati o armadio rischio biologico. </li><li> Inserire lascia in palla maglie di una precedenza autoclavato tè primavera infusore. </li><li> Immergere tè infusore contenente le foglie nel 70% (v: v) di etanolo in un culpentola ture per 30 sec. NOTA: per tutti i passaggi di questa procedura usa da 250 ml con tappo a vite pentole cultura policarbonato che vengono sterilizzati in autoclave. </li><li> Scolare e poi trasferire e immergere il tessuto fogliare in 1: 8 (v: v) candeggina diluita (0,5% cloro) per 10 min. Agitare delicatamente di tanto in tanto. </li><li> Scolare la candeggina e trasferire l&#39;infusore tè in una pentola di coltura contenente acqua distillata deionizzata sterile. Agitare delicatamente e drenare l&#39;acqua in eccesso. Ripetere ancora una volta con una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile. </li><li> Togliere le foglie dalla infusore tè con pinza sterile a una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile. Avvitare il tappo sterile e lavare capovolgendo e vorticoso. Lascia foglie galleggianti in acqua sterile fino al momento di preparare espianti. </li></ol></li><li> Preparazione e placcatura espianti <ol><li> Usando tecniche sterili, tagliare singoli depliant sterilizzati dal bordo con un bisturi, e tagliare il rettangolo rimanenti in due o three espianti rettangolari (8-10 x 3-5 mm) con la metà vena del centro di ogni espianto (Figura 5A). NOTA: La dimensione del espianto è molto importante nell&#39;avvio del prima formazione del callo. Effettuare il taglio sui coperchi sterili da contenitori di cibo take-away. </li><li> Piastra 6 espianti di agar-solidificato terreno di coltura in 9 cm di diametro di Petri (Figura 5B). Piatto il espianti lato abaxial giù per mantenere consueto orientamento foglia. </li><li> Sigillare le piastre di Petri con Parafilm (Figura 5C) allungate intorno al piatto. Il tessuto è ora pronto per l&#39;incubazione. </li></ol></li><li> Tissue Incubazione <ol><li> Incubare le piastre al buio a 28 ° C in un ambiente a temperatura controllata o armadio crescita durante il periodo di coltura. NOTA: Le espianti avvieranno dedifferenziazione, subire la divisione cellulare, la proliferazione (formazione del callo) e embriogenesi (differenziazione). </li><li> Sottocultura il fornire i chiarimenti di differenziazionenti dopo 3 settimane a mezzo fresco. A questo subcultura trasferire l&#39;intera espianto usando una spatola inox sterili e pinze, in una cappa a flusso laminare o un armadietto rischio biologico. Come avviene formazione del callo e il callo supera la dimensione del più grande in figura 5C, trasferire il 50% del callo specifico quando subcoltura terreno fresco. </li><li> Osservare i primi embrioni in circa 4 settimane. Mentre vi è un grado di sincronia, raccogliere diverse fasi di embrione in un periodo di incubazione di 4-8 settimane (Figura 6A, B). Raccogliere sotto un microscopio e di processo dissezione in funzione degli obiettivi sperimentali. </li><li> Sottocultura ogni 3 settimane e rimuovere periodicamente embrioni in modo che gli espianti continueranno a produrre embrioni per 3 mesi. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. 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E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

I protocolli descritti sono relativamente semplice e permettono indagini dell&#39;embriogenesi legume con tutta la cellula contemporanea e tecniche molecolari. Si riconosce che ci sono vantaggi e svantaggi di entrambi in vivo e in vitro approcci. Entrambi permettono maggiore attenzione per embriogenesi precoce rispetto alla cultura dei semi immaturi 19. Nel caso di studi in vivo quanto descritto è prevalentemente l&#39;isolamento dell&#39;ovulo dal bacc...

I legumi sono la terza più grande famiglia di piante superiori con circa 20.000 specie e la (o Fabaceae) famiglia delle leguminose sono secondi a cereali in superficie coltivata e produzione totale 1. La soia è la terza più grande coltivato. Legumi granella forniscono circa un terzo delle proteine ​​alimentari e un terzo di olio vegetale per il consumo umano 2. Legumi con la loro capacità di fissaggio N 2 contribuiscono a sistemi agricoli sostenibili. Medicago truncatula, come la soia, i negozi di proteine ​​e olio nelle cotiledoni di suoi semi ed è un modello di legume genetica e genomica, con notevoli risorse genetiche e genomiche 3,4. Mentre M. truncatula ha consentito progressi nella comprensione del legume-rhizobium simbiosi 4 è stato sempre impiegato per studiare sementi di leguminose biologia 5-7 e embriogenesi 8,9. Arabidopsis embriogenesi è stato ampiamente studiato 10,11 ma isa non legume ei dettagli dell&#39;embriogenesi non sono identici a Medicago 8,10. Zigotica in M. truncatula ha caratteristiche interessanti, con un ipofisi multicellulare distintivo, un suspensor endoployploid e cellule basali trasferimento 8. Embriogenesi somatica (SE) è comunemente utilizzato per la rigenerazione piante 12. Nel modello legume M. truncatula, la linea seme Jemalong 2HA (2HA) è stato sviluppato dal genitore Jemalong di avere alti tassi di embriogenesi somatica 13. Il numero di embrioni prodotti è stata recentemente sostanzialmente aumentato aggiungendo sia l&#39;acido gibberellico (GA) e l&#39;acido abscissico (ABA) al mezzo di lunga data 14. In questo caso, GA e ABA agiscono in sinergia, che è inusuale visto che GA e ABA di solito agiscono antagonisticamente 14. Gli embrioni ottenuti da callo sviluppano sulla superficie che permette la fase dell&#39;embriogenesi per essere facilmente determinata Visually e prontamente raccolto. Avendo in prossimità di linee isogeniche che sono embryogenic (2HA) e non-embriogenetica (Jemalong) facilita l&#39;indagine di embriogenesi somatica e avendo sia in vivo che in vitro sistemi fornisce diverse possibilità sperimentali. La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo embrionale è essenziale per le sementi di comprensione e lo sviluppo delle piante. In legumi, come in altre dicotiledoni, sono i cotiledoni dell&#39;embrione che immagazzinare i prodotti che vengono utilizzati per l&#39;alimentazione umana. Embriogenesi precoce coinvolge rapida divisione cellulare, e corretta patterning dell&#39;embrione. In circa 8 giorni dopo la fecondazione, la M. truncatula embrione raggiunge stadi cotyledon iniziali. La caratterizzazione morfologica non è esattamente indicato da giorni dopo la fecondazione in condizioni serra. Così, un approccio standardizzato efficace per indicare la fase di embrioni in via di sviluppo è prezioso per lo studio della genetica regulzione del primo zigotica. In questo lavoro, mettiamo a disposizione due protocolli standardizzati per raccogliere embrioni in via di sviluppo per gli studi biologici della embriogenesi nel modello legume M. truncatula. Il primo è quello di raccogliere gli embrioni zigotici associando embriogenesi e pod morfologia mentre il secondo è embriogenesi somatica via espianti fogliari coltura di fornire un gran numero di embrioni facilmente accessibili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

Embriogenesi precoce a partire da una singola cellula zigote attraversa rapida divisione cellulare e la morfogenesi, ed è morfologicamente caratterizzato da fasi di pre-globulare, globulari, cuore, siluri e cotyledon. Questo progressivo sviluppo è sotto la stretta regolazione di una rete molecolare complessa. Raccolta sufficienti embrioni in uno stadio di sviluppo è essenziale per studiare la regolazione cellulare e molecolare del primo embriogenesi. Questo non è semplice da inizio embriogenesi subisce una rapida morfogenesi in breve tempo ad esempio, 8 giorni per i Medicago truncatula per raggiungere la fase cotyledon precoce. Qui, affrontiamo il problema da due approcci. Il primo stabilisce un legame tra lo sviluppo embrionale e pod morfologia nell&#39;aiutare indica la fase dell&#39;embrione zigotico. Questo è particolarmente basa sul numero di spirali pod e sviluppo delle spine. Un modo alternativo per integrare in vivo sTUDI è via espianti fogliari coltura per la produzione di embrioni somatici. Il supporto include una combinazione di ormoni insolito - un&#39;auxina (acido 1-naftalenacetico), un citochinine (6-benzilaminopurina), acido abscissico e acido gibberellico. Le diverse fasi possono essere individuate a crescere senza il callo senza dissezione.

Per zigotici embriogenesi differenti strutture pod corrispondenti alle diverse fasi embrionali sono mostrate in Figura 1A - F mentre le diverse fasi embrionali sono mostrati in Figura 2A - F. Selezionando baccelli nella stessa fase, campioni di ovuli che sono piuttosto uniforme può essere ottenuta (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrione geni specifici possono essere facilmente individuati e gli studi del corso di tempo valutato 9.</s...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Views.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Ricerca

Genetica

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Biologia dello sviluppo

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Biologia

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Isolamento e genotipizzazione di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autore in primo piano: una pipeline per analizzare embrioni mutanti specifici per il lignaggio con risoluzione di una singola cellula

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Integrazione mirata CRISPR/Cas9-mediata In Vivo usando una strategia basata su unendo fine omologia-mediata

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di