This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

(Bir mertebe dahilinde yani) ayrışma sabiti için bir Yaklaşık Değer 1. Belirlenmesi <ol><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklanan bir karışım hazırlayın. </li><li> Mümkün olan en yüksek konsantrasyonda söz konusu ligandın stokları hazırlanması ve bu daha sonra en altı ile on kez seyreltilmiş hali. Yaklaşık Kd önceki veri bilindiği durumda, en az iki konsantrasyonları yukarıda ve Kd altında olması hedeflenmektedir. </li><li> Bir kısım QPCR plaka sekiz kuyulara karışımı 18 ul. Birinci oyuğuna çözücünün 2 ul ekleyin. Kalan yedi kuyuda olarak her biri ligand seyreltme serisi (adım 1.2) her bir üyesi, 2 ul ekle. </li><li> Tablada QPCR sızdırmazlık yerleştirin. Levhanın iyi bir sızdırmazlık elde etmek için, plakanın ortasında (özel reaktiflerin tabloya bakınız) bir el aplikatörü yerleştirin. Bir tarafa mühür aşağı pürüzsüz, ve daha sonra diğer yarısı üzerinde tekrarplakası. </li><li> Hava kabarcıklarını çıkarmak için iki dakika boyunca 500 xg&#39;de plaka santrifüj. </li><li> Bir StepOne QPCR enstrüman plakası yerleştirin. (Bu 40 dakika boyunca 99 ° C bir rampa ardından 25 ° C&#39;de 2 dakika duraklama, ve daha sonra 2 dakika duraklama sağlar) &quot;Erime eğrisi&quot; seçeneği, ROX filtreleri seçin, ve hızlı rampa hızı seçin. Termal denatürasyon çalıştırın. NOT: bir çalışma gerçekleştirmek için komut dosyaları http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. <ol><li> Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithal ve her iyi (şablon fil içeriğini ayarlamakes) yazarlarda mevcuttur. </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. NOT: Bu sonuçları analiz eder. Bu Excel İhracat sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat mümkündür. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li></ol></li><li> Sadece çözücü mevcudiyetinde protein Şekil 1A &#39;de gösterilene benzer bir sonuç verir olduğunu kontrol edin. Sonra, &quot;suret&quot; bölmesinde sonuçlarında gözlenen erime sıcaklıkları inceleyin. Bu artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığı belirgin bir artış gösterdiğinden emin olun. Not: erime sıcaklığı, ligand içermeyen protein arasındaki yarım olduğu İdeal olarak, bu (protein tam ligand bağlı olduğunu varsayarak) açık bir maksimum erime sıcaklığı ve yaklaşık Kd sağlayacaktırmaksimum. </li></ol> Ayrışma sabitinin belirlenmesi için 2. Deney hazırlığı <ol><li> Bir ana karışımı olarak Tablo 2&#39;de ayrıntıları verilen bir karışım hazırlayın. </li><li> Son deneyde on kat seyreltilerek on beş farklı konsantrasyonlarda stok ligand hazırlayın. İdeal olarak, konsantrasyonlarının yaklaşık Kd altında ve üstünde büyüklük en az iki sıra içerir ve tahmin edilen Kd konsantrasyonlarını merkezi. Bu iki tarafında başka dört puan ile, tahmini K d büyüklükte bir düzen içinde noktaların yedi odaklanın; bir seçim varsa, doyurarak değerlere daha fazla puanı bulunur. NOT: Gerekli, bu ligand stokları ligand çözünürlüğünün sınırlayıcı çift deneysel konsantrasyonda olduğu deneysel koşullar böyle değiştirmek mümkün değilse. </li><li> Master&#39;ın 120 ul ekleyinana karışımı elverişli bir şekilde sevk için bir rezervuar olarak hareket etmek, U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde sekiz çukurlara karıştırın. PCR plakasının bir kolonuna 18 ul dağıtılması için 8 kanallı pipet kullanın. Plaka üzerinde 8 x 6 deseninde 48 dolu gözenekli bir toplam elde etmek üzere bir başka beş sütun için tekrarlayın. </li><li> U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ayrı ayrı kuyucuklarına, 20 ligand stokların ul, veya solventin ekleyin. 8 kanallı pipet, aspire sekiz farklı bağlayıcı hisse senetleri (veya çözücü) 2 ul kullanma. Adım 2.3 master karışımı ile dolu PCR plaka bir sütun bu ekleyin. Iki başka sütunlar için aynı sekiz ligand / çözücü stokları ile tekrarlayın. Aspire 2 Geriye kalan sekiz ligandı ya da çözücü stoklarının ul, ve plakanın bir dördüncü sütunda bu ekleyin. Iki başka sütunlar için bu işlemi tekrarlayın. Bu, tüm 16 ligand ve çözücü numuneler için üç nüsha örnekler vereceğim. </li><li> Plaka üzerine yerleştirin QPCR conta (adım 1.4). </li><li> 500 xg&#39;de plaka santrifüjeİki dakika. </li><li> QPCR enstrüman plakası yerleştirin. Adım 1.6 belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın. </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithalat, ve de her içeriğini ayarlayın. NOT: şablon dosyalarını http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. <ol><li> Triplicates olarak sonuçlarını göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden &quot;çoğaltır&quot; sekmesini seçin. Kopyaların nasıl sıkı dayalı verilerin güvenilirliğini değerlendirmek. ShoulTriplikat yoksul tekrarlanabilir olduğunu göstermek d yakından ham verileri incelemek. </li><li> Erime sıcaklığını değerlendirmek için Boltzmann&#39;ı veya Türev yöntemleri kullanılarak verileri analiz edin. &quot;Sonuçları Replicatea&quot; sekmesini seçin ve &quot;tarafından Plot:&quot; geçiş, &quot;sonuç arsa Replicatea&quot; in arasındaki düğme &quot;Tm - Boltzmann&quot; ve &quot;Tm - Türev&quot;. Numune için büyük üretkenlik sağlar yöntemini seçin. Excel Export sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat. NOT: Birden fazla geçişler göstermek numuneler için, birden fazla eriyik modunda Türev yöntemi kullanmak hemen hemen her zaman en iyisidir. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li><li> Sonuçların yeniden üretilebilirlik sağlamak için, ayrı bir günde bir tekrarı dahil olmak üzere, en az iki kez deney tekrarlayın. Veri analizi (aşağıya bkz: adım 3) ShouldKd değeri, ilk tahmin etmek için önemli ölçüde farklı olduğunu göstermektedir, yaklaşık Kd değerleri iyi bir dizi sağlamak için (adım 2.2) uygun olarak, ligand konsantrasyonlarının değiştirilmesi. </li></ol> 3. Veri Analizi renatürasyonun altında ayrışma sabiti belirleme <ol><li> Ligand konsantrasyonlarının Excel&#39;de bir tablo ve erime sıcaklığını oluşturun. </li><li> GraphPad Prism yazılımı açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. NOT: Gösterilen bir örnek Şekil 1B olduğunu. Önceden yüklenmiş denklemler ve SPSS istatistik paketi kullanılarak alternatif talimatları ile bir komut dosyası, http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmesinde, analiz parametresini değiştirmek için seçeneği seçins (Ctrl + T). , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Tek sitesi ligand bağlanma&quot; olarak Tablo 3&#39;te detaylı denklemi yerleştirin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1C gösterilmiştir. Denklemleri önceden yüklenmiş ile komut kullanırken, ilgili denklem listede yerine girdi seçilebilir yönlendirilebilir. Bu denkleminin ekte verilmiştir. </li><li> Kutusunda &quot;Başlangıç ​​Değerlere için Kurallar&quot; seçin ve Tablo 3&#39;te ayrıntılı olarak başlangıç ​​değerleri için kurallar girin. </li><li> (Ligand verilmektedir aynı birimlerinde) ve protein nihai konsantrasyona girmek &quot;ile sürekli eşit&quot; olarak, parametre P sınırlandırmaktadır. </li><li> Analizi gerçekleştirmek için Tamam seçeneğini seçin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1D gösterilmiştir. Grafik yazılımı veri ve modele uyum gösteren bir figür oluşturur. T örnekleriöz konusu analizler temsilci verileri gösterilmiştir. </li></ol> Kooperatif Modelleri 4. Uydurma Veri Basit bir kooperatif modeli, ya da iki ayrı ayrılma sabitler tanımlanmıştır model seçmesini, bir kooperatif modeli veri sığdırmak için. Birinci yaklaşım, negatif işbirliğinden durumunda tercih edildiği veya ilk araştırma olarak edilir. Ancak, prensipte iki farklı ayrışma sabiteleri 18 modellemek için pozitif bir birliktelik durumlarda daha iyidir. Bu durumda, ardışık modelleme ligand bağlanma ya da ligandların bağlanma ya da bağımsız olarak varsayarak devam edebilir. <ol><li> , &quot;Basit kooperatif modeli&quot; olarak listelenen Tablo 3 denklemlerin birini yerleştirin, adım 3.3 de, Ancak protokolde 3. olarak &quot;iki ligandların Sıralı bağlama&quot; aynı ilk adımları uygulayın, veya 18 &quot;Bağımsız iki ligandların bağlanması&quot;. </li><li> Başlangıç ​​değerleri için ilgili kuralları seçinTablo 3&#39;te bu denklemlerin her biri ile ilişkili. </li><li> Verilere modelin uyum inceleyin. Veri kötü uygun olmalıdır, başka bir model düşünün. NOT: ayrıca dikkatle Protein Termal Shift yazılımıyla (adım 2.9) ile veri erime sıcaklığına takılmasını incelemek önemlidir: bazen iyi sonuçları almak için buraya parametrelerini değiştirmek için gereklidir. K d iki tarafında sınırlı bir veri seti, ya da (özellikle yüksek ligand konsantrasyonlarda) tek bir anormal noktası, ya önemli ölçüde etkileyebilir: Başka bir göz veri noktalarının aralığı ideal ve herhangi bir anormal noktaları olup olmadığını olmadığıdır Sonuçlar. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol> Erime Sıcaklığı İkili kaydırır gösteriliyor Curves 5. Uydurma Veri Bazen, yerine ligand bir derecelendirilmiş cevaptan daha, proteinler olmuşturÖrnek açık bir şekilde bağlanmış, bağlanmamış numune ayrılır bir ikili yanıtı kabul görülmektedir. Bir örnek, temsili sonuçlar (Şekil 4) sağlanır. Bu durumda, erime sıcaklıklarının montaj Kd için iyi bir uyum sağlamaz. <ol><li> Protein Termal Shift yazılım ham veri çıkışı ihracat. Her sıcaklık noktası için, sıfır ligand için ortalama floresan ve en yüksek ligand konsantrasyonlarının hesaplanması. Bu yanında, her bir veri noktasından sonuçları çizelgeye. NOT: Burada oluşturulan hata monte erime sıcaklıklarında hata daha azdır. </li><li> SPSS istatistik paket açın. SPSS bir veri pencerede her bir deney için sıcaklıkları, iki ortalama veri setlerini ve verileri kopyalayın. Değişken sekmesinde, &quot;düşük&quot; olarak ligandsız için ortalama veri kümesi ve &quot;yüksek&quot; olarak en yüksek ligand konsantrasyonu için ortalama veri kümesi ayarlayın. </li><li> Mevcut sözdizimi dosyasını indirinonline olarak http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . &quot;Çalıştır → Çalıştır tüm&quot; seçiniz. </li><li> İlgili ligand konsantrasyonlarında, yeni bir Excel çalışma kitabına orantılı bağlı sonuçları kopyalayın. </li><li> Graphpad yazılımını açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. Analiz sekmesinde, &quot;değişim analizi parametreleri&quot; seçeneğini seçin. , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Erime sıcaklığı ikili vardiya Analizi&quot; olarak listelenen Tablo 3&#39;te verilen denklemi girin. </li><li> &quot;İlk Değerler Kuralları&quot; kutusunu seçin ve Tablo 3&#39;te detaylı başlangıç ​​değerleri için kurallar girmek. &quot;Için Sabit eşit&quot; olarak, parametre P sınırlama ve liga gibi aynı birimlerde (protein nihai konsantrasyonu girinnd) verilmiştir. NOT: 3. bölümde protokol için bu kutucukları doldurulduktan örnekleri Şekil 1C, D gösterilmiştir. </li><li> Iyi bir uyum varsa, sonuçlar sonsuz ligand konsantrasyonunda beklenen sonuca ekstrapolasyonuyla geliştirilebilir. Her bir ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının model, ligand konsantrasyonu ve en yüksek değeri değeri inceleyin. Bu 0.99 veya daha büyükse, daha fazla analiz sonuçları iyileştirmek mümkün değildir. </li><li> 0,99 oranı daha az ise, ilave bir aşama, en yüksek ligand konsantrasyonu numunede bağlanmamış proteinin etkilerini gidermek için gereklidir. Aşama 5.2 &#39;de, (başka bir hücre kullanılabilir, ve R2&#39;nin Tablo 3&#39;te denkleme uygun şekilde değiştirilmesi) hücre R2 içinde (adım 5.7), en yüksek ligand konsantrasyonu noktasında bağlanmış ligand oranını mal. Yüksek ligand konsantrasyonu sonuçlarının sonra ortalama fazladan bir sütun oluşturun. FirsT hücresi &quot;lıgand konsantrasyonunu sonsuz uyarlanabilme&quot; olarak Tablo 3&#39;te listelenen denklemi kopyalama. Bu sütundaki kalan hücrelere bu formülü kopyalayın. NOT: Bu hesaplama, en yüksek ligand konsantrasyonuna bağlı olmayan proteinin etkisini ortadan kaldırır. Ligand serbest protein ve en yüksek ligand konsantrasyonu arasındaki fark, her bir sıcaklık noktasında tamamen bağlanmış ve bağlanmamış proteinin durumlar arasında beklenen farkı sağlamak için yüksek ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının tersi ile çarpılır. Bu fark, ilave ya da tam ligand bağlı proteini için beklenen floresan vermek üzere bağlanmamış durumda çıkartılmaktadır. </li><li> Bu yeni sütun ile SPSS veri sayfasında maksimum ligand konsantrasyonu için sütun değiştirin ve veri uydurma tekrarlayın. NOT: - model maksimum konsantrasyon derecesinden bağ bağlanmış olan orantılı bir başka önemli bir değişikliği ortaya çıkardığı takdirde 5.9 tekrar edilmesi gerekebilir 5.7 adımları(Bu durumda eğer, muhtemelen dahil daha yüksek bir ligand konsantrasyonu noktası deneyi tekrar ideal olacaktır) üzerine. </li><li> Protein, bir ikili kaydırma ve görüntüler kooperatif davranışı gösterir durumda, denklem aşama 4,1 olanlar ile ikame edilmelidir aşama 5.5 önerdi. &quot;Top&quot; ve &quot;Bottom&quot; parametreleri sırasıyla 1 ve 0 ile değiştirilmesi gerekir. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design.">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li><li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology.">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li><li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery.">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li><li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry,+thermal+shift+(ThermoFluor)+assay,+and+multiangle+or+static+light+scattering.">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li><li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability,+protein+crystallization,+and+structure+determination.">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li><li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+our+mistakes:+the+'unknown+knowns'+in+fragment+screening.">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li><li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery.">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li><li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions.">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li><li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands.">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li><li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase:+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor.">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li><li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII.">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li><li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region.">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li><li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant.">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).</li><li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+WcbI,+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme.">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li><li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein.">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li><li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans:+a+screening+test+for+binding+specificity.">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li><li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL.">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li><li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Diferansiyel tarama fluorimetry proteinleri karakterize ve potansiyel protein ligandları teşhis etmek için güçlü ve çok yönlü bir yöntem olarak gücünü göstermiştir. (Özellikle daha az iyi finanse laboratuvarlarda) protein stabilizasyonu, ilaç keşif ve hızlandırılması kristalleşme 10,23-25 ​​de iyi belgelenmiş başarıları bu bileşiklerin ilk taraması için cazip bir yöntem yaptık. Proteinlerine ilave bileşikler, belirgin bir erime sıcaklığı, 7,9 açıkça doza bağlı bir artış göstermektedir. Ancak, afinite için bileşikleri sıralaması yardımcı olmak için görünür bağlanma sabitleri belirlemek için bu deneylerin sonuçlarını kullanmak için birkaç girişimleri olmuştur. Burada, sistematik bir ligandın varlığında, proteinler için belirgin bir ayrışma sabiti belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Burada sunulan sonuçlar DSF hızlı ve güçlü bir şekilde için ayrışma sabitinin tahminleri sağlayabilir göstermektedirBir protein-lijand kombinasyonu. Gözlemlenen veriler parametrelerin olası değerine ilişkin varsayımlar yapmak için gerek kalmadan, K d hızlı bir belirlenmesini sağlamak üzere piyasada mevcut araçları ile manipüle edilebilir. Yöntem, istenilen protein hem de zaman içinde hasis olma, bazı benzer yöntemlere kıyasla önemli bir avantajı vardır. Burada tarif edilen deney, deney başına (üç kopya halinde tekrarlanan deneylerde yaklaşık 0.4 mg) bir protein 0.13 mg tüketecektir. Bu ortalama bir 40 kDa proteini ile tek bir deney benzer miktarda tüketmek izotermal titrasyon kalorimetri (ITC), olumlu ile karşılaştırır. Bu protokol için gerekli deneylerin tam set deney tek bir set için, hazırlık olmak üzere yaklaşık 4 saat etkilerdi. Yine, bu tür güçlü iken, genellikle en iyi verilerin elde etmek için önemli bir optimizasyon gerektirebilir ITC veya yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemlere göre önemli ölçüde daha hızlı olması muhtemeldir. Bizim sonuçlar dikkatli ham verileri incelemek için bir gereklilik olduğunu ortaya koymaktadır, bu verilerin uygun erime sıcaklığını belirlemek için, ve erime sıcaklığı verilerinin uygun ayrışma sabiti belirlemek için. İlk sorun, protein erimesi üretilen ham veri şeklidir. Bazı durumlarda, şekil Şekil 1A gözlenene yaklaşık olmayabilir. Ortak sorunlar ligand düşük sıcaklık değişimleri, yüksek arka floresan ve sıcaklık sıradışı çoklu geçişleri içerir. Düşük sıcaklık geçişi ligandlann bir dizi bağlayıcı görülür. Bu yöntem için, en önemli parametre sıcaklık geçişi ile karşılaştırıldığında, Tm ölçüm hatasıdır. , Üçlü Ölçümlerin standart sapması bağlanmamış ve tam bağlı protein arasındaki erime sıcaklık geçişinin% 10&#39;unu yok olduğunda veri genellikle gayet iyi takılabilir. Deneyimlerimiz bu nerede böyle tempıcaklık kaymalar, tek tek veri noktalan son derece hassas ise sadece 2 ° C, bu ayar, verilerin yerleştirilmesi için yeterli olabilir bulunmaktadır. İkinci bir konu alışılmadık eğrileri şekillenir. Ligan bağlama proteininin açılımı modları etkiler gibi bu, genellikle, serbest protein ve ligand bağlı şekilde farklılık gösterir. Bu durumda, kullanıcı, veri erime sıcaklığı ve ayrışma sabiti belirlemek için kullanılacak olan modellerin uygun dikkate alınarak kullanılabilen olmadığını değerlendirmelidir. Başka bir genel sorun, proteine ​​bir kofaktör eklenmesi (örneğin, heksokinaz örneğimizde MgCI2), en güvenilir veri elde etmek için gerekli olmasıdır. Bizim deneyim ilk okutmalarında iyi sonuçları elde etmek esastır aşamasında deneyde tüm olası faktörlerin dikkatli dikkate olmuştur. Ayrıca alternatif teorik tedaviler bu verilerin 15,17 özelliklerini ortaya çıkarabilir. Son olarak, bu C edilen bazı proteinler için nadir değildirontain doğal olarak yüksek eşiğe göstermek için hidrofobik bölgeler maruz bırakılmıştır. Başka yerde yoğun 6,9 gözden geçirilmiş, bu problemlere çözümler vardır. Özel olarak, kullanıcı (örneğin, Şekil 4) ve türevlerinin kullanılması durumunda, birden fazla erir modellenmelidir olup Boltzmann veya türevi modelleri kullanmak için olmadığını değerlendirmelidir. Açılımı termal modelleme iki yöntem Boltzmann yöntemi tutmasına eğrisine düzenli bir sigmoid şekli varsayarak, Boltzmann denklemi deneysel verilere uygun farklı. Bunun aksine, yöntem, her türev noktası (Şekil 1A &#39;da alt panel) deneysel veriler birinci türevi alır ve en birinci türevinin noktası olarak erime sıcaklığı dikkate alır. 3 ° C - türevi Yöntem genel olarak, yaklaşık 2 ile daha yüksek bir erime sıcaklığına döndürür. Çoğu protein, daha tutarlı döndürüriki yöntemden biri için sonucu (yani, üçlü deney için erime sıcaklığının standart hatası daha düşüktür). Bu genellikle iyice eğrisi açılma proteinin tam bir şekli ile ilgili olup, bu deneysel her durumda en iyi yöntemi belirlemek için gereklidir. Türevi modeli kullanıldığında, birden fazla erime olayları dikkate almak da önemlidir. Bazı veriler açıkça çoklu geçişler için kanıt göstermek ve bu durumlarda sonuçlar, bu birden fazla erime olayları modellenmiştir olmadığını yorumlamak daha kolay olması muhtemeldir. Bu protokolün bağlamında, ligand eklenmesi bir protein tersi (en termal kırılgan subdomain stabilize ederek, örneğin) bir tek geçiş birden fazla erime geçişleri sahip kaydırmaya veya neden olabilir genellikle böyledir. Bu nedenle ham veri kullanmak için iyi olacak hangi yaklaşım dikkate alınarak önce birlikte incelendiğinde olduğunu savunmaktadır. M takibenBireysel erime sıcaklıklarının odelling, başka sorunları protokol bölümünde sunulan modeller bu uydurma ortaya çıkabilir. Bu analiz, çoğunlukla gözlenen veri ve modelin arasındaki tutarsızlıkları vurgular gibi dikkatle, bir logaritmik ölçek kullanarak ayrışma sabiti denkleme uyum incelemek için zorunludur (e .g., Şekil 3). Elde edilen sonuçlar genel olarak sağlam iken, yorumlanması bakım verilerden daha iyi sonuçlar elde etmek için fırsat ve en anlama sahiptir. Bu verilerin gündeme belirli bir konu DSF de, birliktelik gösterebilir proteinler, ya da birden fazla bağlayıcı olaylara konulmalıdır yorumudur. Bu, şimdiye kadar sadece çok özel bağlama etkinlikleri (örneğin, WcbM, boyut dışlama kromatografisi ile, bir multimer olarak işlev gören en homologu 26 bir multimer olan protein, [bir veri sahip olmaları beklenir proteinler bu olguyu gözlemledikgösterilmiştir]). Bu günün tüm açık DSF denatürasyondan gözlenen olumsuz kooperativiteye enzim sonuçta olumsuz bir birliktelik göstereceğini belirtir ki değil: ziyade, bu yöntemleri daha geniş bir yelpazede kullanarak daha fazla iyice incelenmesi gerekir karmaşık bağlayıcı bir göstergesi olabilir. Bu tür proteinlerin daha kapsamlı çalışmaların ilginç etkilerini tespit etmek olasıdır ki, bize düşündürmektedir. Bu yöntemi kullanarak ayrışma sabiti için verilen değerler, genel olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi ve yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemler tarafından sağlananlar gibi aynı mertebededir. Ancak, gözlenen mutlak değerleri, bu yöntemler kullanılarak gözlemlenen daha sıklıkla yüksektir. Bu, en azından kısmen ayrışma sabiti ligandı ile proteinin erime sıcaklığında görülmektedir gerçeğinin bir sonucudur. Bu Kd fizyolojik sıcaklıklarda daha yüksektir. Dissociation, sabit denklemler ile reaksiyonun sıcaklığı ile ilgili olup: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (C θ standart referans konsantrasyonunu, Δ G reaksiyonun Gibbs serbest enerjisi değişim r, R, molar gaz sabitidir, Δ H reaksiyonda entalpi değişimi ve Δ S reaksiyonunda değişim entropi .) Bu yöntemin ölçülebilir aralığında ayrışma sabitleri ile reaksiyonları, genellikle olumsuz bir Δ Rg sahip olacak ve bu nedenle denkleme sıcaklığındaki bir artışın etkisi [1] ayrışma sabiti arttırılması olacaktır. Her iki Gibbs serbest enerjisini oluşturan Δ H ve Δ S terimler (denklemi [2]) sıcaklık vardıre göre 27 ve ayrışma sabitinin üzerindeki etki, bu sıcaklık bağımlılıkları büyüklüğü ve işareti bağlıdır ve zorunlu olarak etkileşim bağlı olacaktır. Sonuç olarak, bu yöntemle belirlenen ayrılma sabitleri oda sıcaklığında çalışmasına yöntemlerle belirlenen zaman daha yüksek olduğu beklenmedik bir durum değildir. Sıcaklık bağımlılık da, tabii ki, fizyolojik sıcaklıkta daha düşük sıcaklıklarda ayrışma sabiti temin etme eğilimindedir birçok yöntem, bir sorun teşkil etmektedir. Bu ITC farklı olarak, etiketlenmiş bir yöntem olduğu DSF yöntemin diğer bir sorun teşkil etmektedir. (SYPRO Turuncu) kullanılan flüoresan etiket hidrofobiktir ve bu nedenle bazı durumlarda proteinlerin hidrofobik ligandlan ile rekabet edebilir. Sonuç olarak, bazı durumlarda, elde edilen ayrışma sabiti yapay bağlı etiket ile rekabete yükseltilecek muhtemeldir. Bununla birlikte, çeşitli ligandların karşılaştırma (birincil kullanım içinDSF), afinite ile fark bileşiklerin sıralamasını etkiler için yeterince büyük olması olası değildir. Bu yöntemin olası bir dezavantajı, elde edilebilir tespit sınırıdır. Prensip olarak, doğru protein konsantrasyonunun% 50&#39;den daha düşük olduğu, ve bu aralıkta daha değerleri şüpheli doğruluk olması muhtemeldir için Kd değerini ölçmek mümkün olmamalıdır. Aralığın bu sonunda algılama sınırı protein ve boya konsantrasyonlarının azaltılması ile biraz uzatılabilir iken, cihazın, söz konusu protein konsantrasyonundaki azalma daha da engeller. Benzer şekilde, duyarlılık üst ucu ligandın çözünürlükleri tarafından belirlenir. Kd için matematiksel olarak sağlam bir tahmininin elde edilmesi için, yaklaşık olarak bir ligand konsantrasyonu gerektirmektedir ligand-bağlı biçimde de mevcut olan protein,% 90 veri elde edilmesi için çok önemlidirly on kat K d (hayır birliktelik varsayarak). Saptama sınırı bu sebeple, ilgili tampon içinde ligandın çözünürlüğüne onda biri olacaktır. Bu yöntem algılama sınırları tipik olarak protein ve ligand bağlı mM 1 uM ila yaklaşık 1 ila 100 arasında olacağı anlamına gelir. Sonuç olarak, diferansiyel tarama fluorimetry proteinlerin geniş bir aralığına uygulanabilirdir çok yönlü bir tekniktir. Burada yer alan yöntem kullanılarak, hızla ve ucuz bir şekilde farklı ligandlar için bir proteinin afinitesini belirlemek mümkündür. Bu durum özellikle küçük laboratuvarlarda, protein saflaştırma ve istikrar uygulama, metagenomes enzimlerin işlevini veya spesifisitesini ortaya çıkması için büyük bir potansiyele sahiptir ve ilaç keşfi.

Bütün proteinler, diğer çok büyük moleküllerin basit iyon diğer moleküllerin çeşitli bir yelpazede değişen afinitelere sahip, bağlayacaktır. Birçok durumda, proteinler (örneğin, kinaz ATP bağlanma) normal fonksiyon parçası olarak küçük moleküllü ortaklara bağlanmaktadırlar. Diğer etkileşimleri fonksiyonu ile ilişkili olabilir, ancak araçları (kristalleşme başarısını yükseltir, veya çözelti içinde proteinlerin muhafazasına yardımcı olacak şekilde proteinleri stabilize örneğin küçük molekül) deneysel olarak yararlıdırlar; önleyicileri olarak hareket eden ve böylece enzimin aktivitesini modüle edebilen aktif alanlarının ve proteinlerin allosterik sitelere bağlanan küçük moleküller iken. Ortak protein molekülleri için afinitesini belirlemek için kullanılabilecek teknikler, geniş bir yelpazede bulunmaktadır. Izotermal titrasyon kalorimetre 1 bu tepkiler üzerine zengin bilgiler sunmaktadır yaygın olarak etiket ücretsiz, bir &quot;altın standart&quot; olarak görülüyor ve fırsatları sınırlıdırDeney rtifacts. Ancak, enstrümantasyon ve deneysel set-up otomasyon duyarlılığı son gelişmelere rağmen, hala protein gereksinimi açısından nispeten pahalı en iyi düşük-orta verim olmasıdır, ve orta ile etkileşimleri en uygundur yüksek afinite (Kd 100 uM ila 10 nM) 2&#39;dir. Böyle kayn veya iki tabakalı enterforemetre 3 teklif daha throughputs ve hassasiyet elde etmiş gibi diğer etiket ücretsiz yöntemler 100 Da gibi düşük küçük moleküllerin tespit. Ancak, bu yöntemler için yüksek verimlilik araçları nispeten pahalı, ilgili projelerin sürekli bir verimlilik olacak, sadece nerede haklı, ve pek çok akademik laboratuvarlara erişilemez olması muhtemel olan. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF veya thermofluor) birinci ilaç keşfi için bir yöntem olarak 2001 4&#39;te tarif edilmiştir. Bu metho olarakd, proteinleri bir floresan boya ile kuluçkalanır (başlangıçta naftalen-sülfonik boyalar kullanılmıştır), proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanması üzerine flüoresanını değiştirir edilmektedir. Protein boya Numune daha sonra ısıtılır ve ısı arttıkça floresan izlenir. Proteinin, açılma ve proteinin hidrofobik parçaları maruz kalma sıcaklığı (Şekil 1A) bir fonksiyonu olarak floresansta bir karakteristik örneğini ortaya çıkarmaktadır. Deney, herhangi bir ticari kantitatif PCR cihazda küçük hacimlerde gerçekleştirilebilir ve bu nedenle tek bir deneyde, bir numune aynı anda çok sayıda (enstrüman modeline bağlı olarak, genellikle 48, 96 ya da 384 örnekleri,) test edilebilir. Deneyler genellikle örnekleri 5 yüksek kapasiteli analiz etme olanağı sağlayan bir saat civarında gerçekleştirilebilir. Metodolojiye daha fazla iyileştirmeler, daha iyi spektral özellikleri 6,7 ile boyaların benimsenmesini gördük </sup&gt;, genel veri analizi için araçlar ve ilk tarama 8,9 protokolleri önerdi. Yöntemin uygulama yelpazesi hazırlanması ve proteinlerin 10 depolanması için en iyi koşulları oluşturulması ve kristalleşme 11 yardım için potansiyel bağlanma ortakları belirlenmesi üzerine özel bir odaklanma ile, genişletilmiştir. Yöntemin, nispeten yüksek miktarda protein, görece düşük maliyetli bir (~ 2 reaksiyon başına ug) ve zayıf bağlanma molekülleri okuyan uygulanabilirliği Akademik bağlamda, özellikle 12-14, DSF parçası bazında ilaç tasarımı için değerli bir araç yaptı. Protein-ligand etkileşimleri okuyan DSF geniş uygulama olmasına rağmen, az sayıda çalışma bu çalışmalardan ayrılma sabitlerinin belirlenmesini tarif etmişlerdir. Ancak, bu seyrek veri veya bazı durumlarda e takılmalıdır birçok parametre ile, proteinin açılımı anlatan detaylı denklem üretmek eğilimi var7,15-17 stimated. Bu yöntemler, örneğin olağandışı geçişleri gösteren sıkı bağlayıcı bileşikler, ya da proteinler olarak, zor durumlarda özellikle önemlidir. Ancak, birçok laboratuvarlar için, bu ayrıntılı analizler rutin kullanım için çok zahmetlidir. Bu nedenle, farklı senaryolar için alternatif tedaviler öneriyoruz, ve bu farklı protein-ligand etkileşimleri kaynaklanan veri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bizim yöntem ısmarlama veri analiz yazılımı mevcut olduğu için StepOne QPCR enstrümanı kullanır; bu, veri analizi hızlandırır iken, diğer cihazlarla elde edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmış yöntemler kullanılarak 9 işlenebilir ve aynı alt analizi gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>StepOne real time PCR instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td></tr><tr><td>Protein thermal shift software v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast optical 48-well plates&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optical sealing tape&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td></tr><tr><td>U-bottomed 96-well plates</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td></tr><tr><td>SPSS statistics version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>Hand applicator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Yöntem çok çeşitli henüz protein arasındaki ayrışma sabiti belirlenmesi ve küçük molekülleri etkileşim için kullanılabilir. Ancak bunların çoğu uzman ekipmana ihtiyaç ve genellikle etkili güvenilir deneyler kurmak ve verileri analiz etmek için bir uzmanlık derecesi gerektirir. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) artan ya da fizyolojik ortakları belirlemek için ya da vurma çıkarılması için küçük moleküller için etkileşen proteinlerin başlangıç ​​taranması için güçlü bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, nicel PCR için uygun olan ve en enstrümantasyon kurumlarda kullanılabilir böylece uygun bir PCR makinesi sadece gerektirmesi avantajına sahiptir; protokollerin mükemmel bir aralık zaten mevcuttur; ve yöntemin birden fazla kullanım için literatürde güçlü örneği yoktur. Geçmiş çalışma DSF verilerinden ayrışma sabitleri hesaplarken çeşitli araçları önerdi, ancak bu matematiksel talep ediyorlar. Burada, demlenmeyeonstrate DSF deney verileri orta düzeyde bir miktarının sapma sabitlerini hesaplamak için bir yönteme ilişkindir. Bu veriler, tipik olarak toplanmış ve bir gün içerisinde analiz edilebilir. Biz basit bir bağlama olaylardan toplanan verileri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini farklı model göstermek ve kooperatif bağlanma veya bağlama bağımsız siteler mevcut nerede. Son olarak, biz standart modeller geçerli değildir bir durumda veri analizi bir örnek sunuyoruz. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen kontrol proteinleriyle ilgili toplanan verilerin, ve araştırma programı iki protein ile gösterilmiştir. Genel olarak, bizim yöntem araştırmacılar hızla DSF kullanarak protein-ligand etkileşimleri içine daha fazla fikir edinmek için basit bir yol sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

61.4K Görüntüleme.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biyokimya

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Biyoloji

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Biyomühendislik

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Floresan kullanarak bileşik-protein bağlanmasının yüksek hassasiyetli tespiti

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Erişilebilirlik ve Verimlilik için PCR Yöntemlerini Kolaylaştırma

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti