R. W. H. V McGill Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) eğitim programı içinde Bionanomachines tarafından desteklenmiştir. A. K. M., s. E. J. NSERC hibe 327028-09 (A. K. M) ve 238562 (s. E. J.) tarafından desteklenmiştir.

1. numune hazırlama
<ol><li>İstenen biomolecule13arındırmak. Not: 2 M NaCl üç kez deiyonize su 3 kDa molekül ağırlığı kesme membran ile santrifüj filtre kullanarak üç tur ardından karşı değiş tokuş sonra bu protokolü kullanır satın kokain bağlama DNA aptamer MN4.</li>
	<li>Sentez ve arındırmak veya istenen thermolabile ligand13satın alın. Not: MN4 thermolabile ligand kokain bağlar. MN4 da bir negatif kontrol ligand thermolability deneysel bu sıcaklıklarda kullanılır kinin bağlar.</li>
	<li>Arabellekleri arıtılmış biomolecule diyaliz ve ligandlar (20 mM sodyum fosfat ve 140 mM NaCl tampon, pH 7.4, MN4 ve burada kullanılan ligandlar) dağılması hazırlayın.</li>
	<li>Biomolecule diyaliz boru kullanarak arabellek en az 2 litre karşı diyaliz ile 0,5 - 1,0 kDa kesme.</li>
	<li>(Çalışma arabellek adlandırılır) son arabellek iyice ile tampon equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.</li>
	<li>Ligandlar istenen kitlelerin tartmak ve onları süzülmüş çalışma arabellekte geçiyoruz. İstenen ligand konsantrasyonu doğru tartmak için çok küçük kitlelerin gerektiriyorsa, bir konsantre ligand hisse senedi çözüm (örneğin 10 x) olun. Not: Tüm DSC deneyler için örnek aynı çalışma tampon kullanmak ve ligand, Yani, hiç bir deney bu arabellek neden olur nerede ligand çalışma arabelleği biomolecule daha farklı bir toplu iş çözülür gerçekleştirmek önemlidir veri aktarımında uyuşmazlığı.</li>
	<li>Biomolecule hisse senedi çözüm iyice çalışma arabellek ile equilibrated 0.2 µm filtre ile filtre.</li>
	<li>Absorbans ölçümleri tarafından biomolecule konsantrasyonu belirlemek (260 nm için nükleik asitler gibi MN4 ve 280 nm proteinler için).</li>
	<li>Hazır biomolecule ve ligand 4 ° C buzdolabı (MN4 ve burada kullanılan ligandlar için uygun), ya da -20 depolamak veya-80 ° biomolecule ve ligandlar donma ve uzun vadeli depolama hoş görürsen C gereklidir. Degas degasser DSC yükleme önce bir masa üstü arabellek, biomolecule ve ligand çözümlerinde ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Gaz Giderme daha yüksek sıcaklıklarda DSC kabarcık oluşumu önlemeye yardımcı olur. Kabarcıklar DSC tepe şekil ve taban çizgisi belirsiz sinyal eserler neden.</li>
</ol>2. DSC hazırlık
<ol><li>DSC'den gelen basınç kolu sökün ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Silikon tüp çalışma arabelleğinden çalıştırın ve başvuru kılcal ön flanş (metal açılış) ekleyin.</li>
	<li>Arka başvuru flanş açık örnek flanş bağlanarak başvuru ve örnek kılcal damarlar arasında bir köprü oluşturun.</li>
	<li>Silikon tüp bir parça bir atık şişesi vakum çizgi eklenmiş ile çalışan arka örnek flanş iliştirin.</li>
	<li>DSC ile çalışma arabellek 200 mL sifonu çekmeyi vakum hattı açın.</li>
	<li>DSC çalışma arabellek ile başvuru kılcal yükleyin. Yaklaşık 3-5 cm silikon tüp bölümlerini başvuru kapiller flanşlar iliştirin.</li>
	<li>1 mL pipet ucu arka flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin. Çalışma arabelleği bir pipet ile 0.8 mL çizmek ve pipet ucu ile tampon ön başvuru flanş'ın silikon tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Pipet pompası pass açık silikon tüp yoluyla çalışma arabellek içine referans kılcal aşağı hafifçe bastırın ve pipet ucu yukarı arka flanş'ın içine eklenir. Çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda açık silikon tüp ulaşana kadar pipet pistonu tuşuna basın, daha sonra çalışma arabellek düzeyi sadece yukarıda arka silikon tüp ulaşana kadar pipet pompası bırakın.<ol>
<li>İleri geri baloncuklar başvuru kılcal hacmindeki temizlemek için çalışma arabellek geçen yineleyin. Not: Genellikle, çözüm ileri geri, 10 geçişleri herhangi bir kabarcıklar temizlemek yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arka pipet ucu başparmak ile kap ve arka pipet ucu ve onlara bağlı silikon tüp ile başvuru flanşlar kaldırmak için açık pipet yavaşça çekin.</li>
	<li>Örnek kılcal çalışma arabellek olduğu gibi adımları 2.6-2,9 ile yükleyin. Siyah bir plastik kap üzerinde arka başvuru ve flanşlar, örnek yer açık flanşlar bırakarak ortaya çıkardı.</li>
	<li>Basınç kolu takın.</li>
	<li>DSC yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve bir kez güç okuma stabilize; yukarı ok arabirimin üstündeki kırmızı tıklatarak araç basınç DSC güç üst kutusunda belirtilen enstrüman sıcaklık ve basınç okuma ile birlikte arabiriminin değil. Not: Monitör DSC okuma güç su geçirmezlik maddeler. Gücünü değişimler fazla ~ 10 µW eserler verilerde neden olabilir kılcal kabarcık oluşumu gösterir. Çözümler kaldırıldı ve degassed daha fazla devam etmeden önce.</li>
	<li>Çalışma arabellek ile DSC ileriye ve geriye doğru tarama yaparak equilibrate. Ekranın sol tarafında "Deneysel yöntemi" sekmesinde, "Tarama" seçeneği DSC sıcaklık tarama modunda çalıştırmak için seçili olduğundan emin olun. Not: Tarama aralığı, tarama hızı, düşük ve yüksek sıcaklık denge zaman ve taramaları sayısı sıcaklık deneysel parametreleridir.<ol>
<li>"Deneysel yöntem" sekmesi altında "Sıcaklık parametreleri" ilave "Isıtma için" düğmesini tıklatın. Alt ve üst deneysel sıcaklıkları, 1 ° C/dk'ya tarama hızı ve 60 için 1 ile 100 ° C girin denge dönemin s.</li>
		<li>Denge süre altında giriş "Serisi Ekle" düğmesini tıklatın. (Bir Isıtma ve soğutma bir inceden inceye gözden geçirmek için) 2 halk pencere "eklemek için adımları" alanına girin ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusunu işaretleyin. Tıkırtı "OK"; eklenen tarama arabirimi alt kısmında görünür. Her tarama olarak parametreleridir onay istenen.</li>
		<li>Deneme arabirimin üstündeki yeşil "Oynat" düğmesini tıklatarak başlatın. İstediğiniz klasöre gidin ve deneme popup penceresinde kaydetmek için bir dosya adı girin. Deney devam eden "Veri" sekmesi "Deney yöntemi" sekmesini sağ tıklatarak görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Thermolabile Ligand DSC veri toplama
Not: En az prosedür beş deney oluşur: arabellek başvuru deneyler ve ligand olmadan (temel çıkarma için kullanılan, konuyabakın), örnek ücretsiz biomolecule ligand bağlı biomolecule ile deneyler ve daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile ligand bağlı biomolecule.
<ol><li>Başvuru deneyler temel çıkarma örnek verileri için çalıştırın. Her iki kılcal çalışma arabelleği ile DSC yeniden ve 1 ° C min-1 bir üst (yüksek sıcaklık) ile uygun sıcaklık aralığında birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek toplamak denge zaman 120 s.<ol>
<li>Önceki arabellek denge inceden inceye gözden geçirmek arabirimin alt kısmından her ayrı ayrı vurgulama ve arabirimin tam ortasında kırmızı X tıklayarak silin. Yeni taramaları "Serisi Ekle" düğmesini tıklayarak "eklemek için adımları" için alanı 20 girmek ve "alternatif Isıtma/soğutma" kutusu denetimi ekleyin. Tamam'ı tıklatın ve yukarıdaki gibi yeşil play butonuna tıklayarak deneme çalıştırın.</li>
		<li>3.1 - adımları yineleyin 3.1.1 ligand başvuru elde etmek için her iki kılcal damarlar içinde istenen konsantrasyonu içeren çalışma arabellek ile deneyler için ligand (120 kullanarak iki ayrı deney toplamak s ve 600 s yüksek sıcaklık denge kez sırasıyla, thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit edinme kullanılmak üzere). Not: Burada kullanılan tarama hızı biomolecule sonraki deneylerde, ileriye ve geriye doğru taramaları ( konuyabakın) termal denge sağlanır. Oranları < 0,1 0,2 ° C min-1 için gürültülü yerlerde yol ve DSC deneylerde uygun değildir-inceden inceye gözden geçirmek. Sıcaklıklar ligand doymuş biomolecule erime sıcaklığı iyi ücretsiz biomolecule erime sıcaklığı aşağıda kuyudan genişletmek (~ MN4 için 20-80 ° C). (Örneğin, 10 ileri ve 20 toplam 10 ters taramalar için yeterli) tarama tekrarlanabilirlik doğrulayın.</li>
		<li>(Örneğin, kokain ve kinin) birden fazla ligandlar kullanıyorsanız, DSC ile çalışma (2.5 adımından tekrar) arabelleği ligand kılcal damarlar kaldırmak ve Çapraz bulaşma engellemek için çalıştırma arasında 200 mL sifonu çek. Not: Çoğalt bir deney üzerinde ücretsiz biomolecule ligand bağlı çalıştırdıktan sonra önceki ligand şiddetle kapiller duvarları adsorbs ve yeterli arabellek kızarma ile kaldırılmaz kontrol için gerçekleştirmek yararlıdır. Ücretsiz biomolecule için yerlerde ligand bağlı deneme sonra bir daha büyük büyüklük ve daha yüksek denatürasyon sıcaklık kaydırılır görünüyorsa, büyük olasılıkla önceki ligand kızarma sonra Kalorimetresi hala mevcut olduğunu. % 20 ile kılcal kuluçka tarafından adsorbed ligand kaldırmak Contrad-70 plastik kapaklar ve basınç kolu kapalı 60 ° C'de 1 h için. DSC yazılım, denge süre girilen sıfır ile "İzotermal" süresi ve 60 ° C izotermal ısı için deneysel yöntem sekmesini seçin 3.600 s altında için deneysel modunu değiştirmek. "Deneysel yöntem Ekle" seçeneğini tıklatın. İzotermal deney ekranın alt bölümünde görünür. Tamamlanma sonra araç 2 litre deiyonize su ile Temizleme ve 2.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnek deneyler DSC başvuru taranan gibi yükleme yordamı ve deneysel parametreleri kullanarak çalıştırın. Ücretsiz biomolecule veri kümesi için örnek kılcal çalışma arabellek istenen konsantrasyon, ücretsiz biomolecule içerirken, başvuru kılcal çalışma arabellek içerdiğinden emin olun.<ol>
<li>Ligand bağlı deneyler için başvuru kılcal çalışma arabellekte ligand mevcuttur ve biomolecule artı ligand örnek kılcal arabellekte çalışma vardır emin olun. Adım 2,5 olduğu gibi farklı ligandlar eklemeler arasında sistem floş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biomolecule ile ek deneme bağlı thermolabile ligand nerede yüksek sıcaklık denge dönemi için 600 artırılır gerçekleştirin s ve diğer tüm deneysel parametreleri olan adım 3.2.1 ile aynı. Not: Yüksek sıcaklık denge dönem için ikinci ligand bağlı deneme süresi sadece ligand kısa denge zaman deneme daha hızlı tükenmiş olması için seçilir. Eğer tarama sayısının bir fonksiyonu olarak yavaş yavaş çürüme ligand bağlı doruklarına ilk deneme (örneğin, birbirini izleyen en yüksek maxima farklılıkları vardır ≤ 0,5 ° C), tahmin etmek için yüksek sıcaklık denge dönemde 10 - için 20 - kat artar yeterince ligand ikinci deneme sırasında tüketmek. Ligand dönüşüm oranı sabit doğru hesaplama ikinci deneme ilk göre ligand swifter tükenmesi olmasını gerektirir. İki deney küresel analizinden elde ligand konsantrasyonu-ecek var olmak benzer ve ligand tükenmesi yeterince ikinci denemede hızlandırılmış değildir Eğer bu nedenle kullanılamaz.</li>
</ol>4. veri işleme
<ol><li>Açık DSC deneme DSC veri analiz yazılımı dosyalarında ( Tablo malzemelerigörmek) ve e-tablolar ham güç veri verme.</li>
	<li>Yazılım için uygun veri içine ham güç veri içeren tablolar içe aktarın.</li>
	<li>Temel örnek veriler arabellek güç veri--dan belgili tanımlık özgür ve ligand bağlı biomolecule deneyler çıkararak çıkarma. Not: thermolabile ligand deneme için her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalıyor. Bu nedenle, örnek tarama 1 arabellek taramasından 1 çıkarmak idealdir. Kokain ile arabellek taramaları kayda değer olarak ligand dönüşüm devam eder ve bu nedenle bir tek thermolabile ligand arabellek tarama thermolabile ligand bağlı verilerin hepsini çıkarmak için kullanılabilir değiştirmeyin bulduk.</li>
	<li>Temel düşülen örnek güç veri ısı kapasitesi için dönüştürün. Not: Tahmini14,15,16-ebilmek var olmak biomolecule'nın kısmi belirli birim dönüştürme gerektirir. Güç ısı kapasitesi için dönüştürmek için denklem oldu daha önce açıklanan17.</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>Genel olarak kısa denge zaman thermolabile ligand bağlı ısı kapasitesi dataset temel, ligand konsantrasyonu, katlama ve4daha önce açıklandığı gibi parametreleri bağlama ligand tek bir dizi uygun.</li>
	<li>Global uzun denge zaman veri kümesi için uygun4daha önce açıklandığı gibi thermolabile ligand dönüşüm oranı sabit hesaplamak için yineleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Değişiklikler ve sorun giderme
Şekil 1 ve Şekil 2 kullanılan küresel uygun analiz ayrıntılarını olmuştur daha önce açıklanan4. Burada, performans ve thermolabile ligandlar ile DSC bağlama deneyler analiz pratik açılardan anahat. Yalnız thermolabile ligand ligand çıkarılır için DSC temel alınan Not + biomolecule dataset, etkili bir şekilde serbest veya termal dönüşüm ...

Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) quantitating biyomoleküler bağlama ve katlama etkileşimleri1,2,3için güçlü bir yöntem olduğunu. DSC gücü onun yetenek bağlama ve mekanizmaları katlama aydınlatmak ve karşılık gelen termodinamik parametreler2,3verim için içerir. Ayrıca, DSC çözüm fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilebilir ve etiketleme biomolecule veya ligand, örneğin, fluorophores, spin-etiketleri veya nükleer izotoplar4gerektirmez. Araç biomolecule ligand de denatüre için gereken ısı miktarı ölçüm sıcaklığı, inceden inceye gözden geçirmek. Elde edilen yerlerde ligand bağlayıcı ve süreçleri katlama yöneten termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılır. DSC veya diğer termodinamik teknikleri tarafından sağlanan bilgi uyuşturucu biomolecules1,5,6,7,8hedefleme tasarımını rehberlik için önemlidir. Ancak, tekrarlanan yüksek sıcaklıklara tarama (~ 60-100 ° C) sorunlu olabilir. Örneğin, birçok pharmaceutically önemli bileşikler düzenlenmesi veya yüksek sıcaklık9,10,11, Yanisürekli maruz üzerine ayrışma geçmesi, onlar thermolabile. Etkileşimleri DSC tarafından genellikle bağlama muayene thermogram termodinamik analizler12tekrarlanabilirlik doğrulamak için birden fazla ileriye ve geriye doğru inceden inceye gözden geçirmek gerekir. İlk bir ligand termal dönüşümü değişmiş bağlama özellikleri ile ikincil bir forma yol açar şekil ve art arda gelen yerlerde, konumunu telaffuz farklılıkları sırasında her tarama ile ilk ligand konsantrasyonu azalır bu yana Termal dönüşümü ürünleri birikir. Bu veri kümeleri için geleneksel analizleri mükellef değildir.
Biz son zamanlarda biyomoleküler katlama yöneten ve bağlama etkileşimleri için başvurulan tek bir ligand bağlı deneme termodinamik parametreler komple set verir thermolabile ligand DSC veri kümeleri için küresel uygun yöntem geliştirdik 4ücretsiz biomolecule için gerekli thermogram. Analiz örnek gerektirdiği ve deneysel zamanı azaltır ~ 10 kat standart DSC yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında. Biz muhasebesi ligand için bu varsayarak tarafından termal dönüşümü sırasında her tarama nereye thermogram bağlı değildir ligand konsantrasyonu yüksek sıcaklık bölümü olur. Bu nedenle, ligand konsantrasyonu termodinamik parametreler ayıklamak için kullanılan thermogram bölümünü içinde bir sabittir. Nasıl oranı sabit ligand termal dönüşümü için daha uzun bir yüksek sıcaklık denge süre ile bir ek deneme yaparak elde edilebilir Ayrıca gösterdi. Ligand termal dönüşümü daha az sıcaklık bağımlı nerede sistemleri için (Yani, kayda değer bütün sıcaklıklarda meydana gelen), analiz değişken ligand konsantrasyonu içerecek şekilde değiştirilmiş. Burada biz hızla benzoylecgonine yüksek sıcaklıklarda dönüştürür thermolabile ligand kokain huzurunda DNA aptamer MN4 için bu yordamı göstermek (> 60 ° C). Kinin dönüşüm deneysel bu sıcaklıklarda geçmesi değil ve ayrıca MN4 için bağlar ligand thermolability için bir negatif kontrol kullanılır. Biz thermolabile ligand DSC veri kümeleri ve termodinamik ve Kinetik parametreleri katlama, bağlama ve ligand dönüştürme işlemleri verimli onların analiz edinimi tanımlamak.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Diferansiyel kalorimetre tarama (DSC) miktarının biyomoleküler katlama ve bağlama etkileşimleri yöneten termodinamik parametreler için bir güçlü bir tekniktir. Bu bilgiler yeni ilaç bileşikler tasarımda önemlidir. Ancak, birçok pharmaceutically ilgili ligandlar DSC analizleri içinde kullanılan yüksek sıcaklıklarda kimyasal olarak kararsız vardır. Ligandlar ve termal olarak dönüştürülür ürünleri konsantrasyonları Kalorimetresi hücre içinde sürekli değişiyor çünkü böylece, bağlama etkileşimleri ölçme meydan okuyor. Burada, thermolabile ligandlar ve DSC dönüştürme işlemleri hızla katlama, bağlama ve ligand termodinamik ve Kinetik bilgi almak için bir iletişim kuralı'nı mevcut. DNA aptamer thermolabile ligand kokain bağlar MN4 için bizim yöntem uygulamış. Thermolabile ligand dönüştürme için hesapları yeni bir küresel uygun analiz kullanarak, tam bir katlama ve bağlama parametreler kümesi elde DSC deneyler bir çifti. Buna ek olarak, gösterdiğimiz oranı sabit thermolabile ligand dönüşüm için yalnızca bir ek DSC veri kümesi ile temin edilebilir. Biomolecule, yavaş katlanır, yavaş bağlama ve thermolabile ligand hızlı tükenmesi geri dönüşü olmayan toplama dahil olmak üzere belirlenmesi ve birkaç daha karmaşık senaryo verileri analiz etmek için yönergeler sunulmaktadır.

Thermolabile ligand DSC için temsilcisi veri şekil 1' de gösterilir. Thermolabile ligand bağlı pik yüksekliği ve pozisyon gittikçe vardiya bu ilişkisiz biomolecule doğru thermolabile ligand her inceden inceye gözden geçirmek ile (Şekil 1a) tükenmiş gibi. Ücretsiz denatürasyon profil thermolabile ligand dönüşüm (Şekil 1b) son nokta için bir başvuru olarak kullanılır. Veri kin...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K Görüntüleme.  McGill University. Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Kimya

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Biyokimya

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-ligand etkileşimleri için yüksek verimli termal kayma testleri

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Termal Kayma Testleri Yoluyla Proteinlerin Yapısal ve Biyokimyasal Çalışmalarını İlerletmek

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Selenoprotein O'ya Substrat Bağlanmasını Araştırmak için Termal Kaydırma Testinin Kullanılması

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre