I. NanoDrop 2000c Spektrofotometre NanoDrop teknolojisi Küvet veya kapiler kullanmadan microvolume örnekleri iki optik kaideleri arasında tutun ve ölçmek için yüzey gerilimi kullanan yenilikçi bir örnek tutma sistemi dayanmaktadır. NanoDrop 2000c spektrofotometre proteinlerin 0.5-2 mcL damlacıkları, DNA, RNA ve diğer biyomoleküllerin hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bu teknolojiyi kullanır. Moleküler teknikler sürekli analiz için küçük miktarlarda malzeme kullanmak geliştikçe bu yeteneği giderek daha önemli hale gelmiştir. Microvolume spektrofotometre örnek sınırlı olduğu koşullar için idealdir. Bol miktarda örnek mevcuttur Ancak, kullanım kolaylığı, hızlı ölçüm döngüsü ve ve geniş konsantrasyon aralığında spektrofotometre uygun hale getirmek. Ölçüm döngüsü de büyük ölçüde bilim adamlarının kendi iş akışı boyunca verimliliği artırmak yardımcı azalır. Microsample doğrudan algılama yüzey üstüne yerleştirilir ve yüzey gerilimi, fiber optik uçları arasında bir sıvı sütunu oluşturulur. Bu sıvı sütunu dikey bir optik yol oluşturur. Xenon flaş lambası, ışık kaynağı ve lineer bir CCD dizi örnek geçer ışığında analiz etmek için kullanılır kullanan bir spektrometre sağlar. Sistemi gibi küvetler gibi geleneksel çevreleme cihazlar kaldırma birçok avantajı vardır: çok küçük miktarda numune ölçüm için gerekli olan temizleme sadece bir laboratuvar beziyle optik yüzeyleri silerek gerektirir ve yol uzunluğu ölçümü sırasında gerçek zamanlı olarak değiştirilebilir. NanoDrop 2000c dilüsyonları olmadan, olası protein konsantrasyonu ölçümleri en geniş yelpazesi sunmaktadır (1 mm ile 0.05 mm) otomatik olarak en uygun yol uzunluğunu belirler. Yol uzunluğu kısaltarak, daha yüksek protein konsantrasyonları ölçülebilir. Bu etkili, çok protein örnekleri için dilüsyonları gerçekleştirmek için gereksinimini ortadan kaldırır. Örneğin, NanoDrop 2000c BSA konsantrasyonlarının 400 mg / ml gibi yüksek ölçebilirsiniz. NanoDrop 2000c Spektrofotometre, DNA, RNA, protein, ve diğer biyomoleküllerin absorbans ölçmek için tam bir spektrum spektrofotometre. Bu video protokolü proteinlerin ölçümü üzerinde durulacak. II. A280 Absorbans Ölçümler kullanarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini a. A280 Ölçümler Prensibi Triptofan, 280 nm Tirozin, fenilalanin kalıntı veya Sistein-Sistein disülfit bağları ve sergi absorbans içeren saflaştırılmış proteinler Protein A280 yöntemi uygulanabilir. Bu yöntem, saflaştırılmış protein konsantrasyonu hesaplamak için kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ile birlikte A280 absorbans değeri kullanır. Doğrudan A280 ölçümleri avantajı bir standart eğri nesil protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli değildir. Örnek bir uncharacterized protein solüsyonu, hücre lizatı, ya da ham protein ekstresi ise, daha sonra, BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry testleri gibi NanoDrop 2000/2000c önceden yapılandırılmış kolorimetrik yöntemler kullanarak önerilir. b. Microvolume Protein A280 Ölçümler - Başlangıç <ol><li> Protein A280 uygulama ana menüden seçin. </li><li> Açılan listeden ölçülecek numune türü seçin. En bilinmeyen protein karışımları 1 Abs = 1 mg / ml. Varsayılan ayarı için tavsiye edilir Eğer önceden karakterize saflaştırılmış protein ölçümü, daha sonra kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ve molekül ağırlığı da daha doğrusu protein konsantrasyonu belirlemek için girmiş olabilir. </li><li> Konsantrasyon birimleri açılan listeden seçin. </li></ol> c. Microvolume Protein A280 Ölçümleri - Körleme <ol><li> Uygun bir tampon kullanarak boş bir kurun. Protein asılı olduğu tampon kullanmak önemlidir. Kullanılan tampon aynı pH ve örnek çözüm olarak benzer bir iyonik gücü olmalıdır. Not: RIPA tamponlar, 280 nm&#39;de çok absorbans katkıda bulunan ve bu nedenle doğrudan A280 protein ölçümleri ile uyumsuz. RIPA tamponunda askıya proteinler, protein konsantrasyonu RIPA tampon uyumlu kolorimetrik assay kullanılarak belirlenecek tavsiye edilir. </li><li> Pipet 2 alt kaide üzerine uygun bir kararma çözüm mcL, kol alt ve Boş tıklayın. </li><li> Boş bir çözüm kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri silin. </li></ol> d. Ölçüm Microvolume Protein A280 Ölçümleri Son derece önemli noktalar: örnek homojenlik.Böyle bir küçük hacimli bu yana önemli ölçülen. Yavaşça örnekleri homojen olduğundan emin ama iyice ölçümü için bir kısım alınarak hemen önce örnekleri bir arada. Karıştırma ve pipetleme sırasında kabarcıklar tanıtan kaçının. Farklı proteinler arasındaki yüzey gerilimi değişkenliği nedeniyle, uygun sütun oluşumunu sağlamak için numune 2 mcL yükleme öneririz. Her zaman düşük tutma pipet uçları kullanın. Pipet ucu dışarıda kalarak çözüm önlemek için çözüm sınır dışı bir örnek yüklemek için, optik alt kaide yüzeye pipet ucu dokunun. Blowout ve örnek kabarcıkları giriş önlemek için, numunenin tam bir miktardan daha az boşaltınız. <ol><li> Uygun alan bir örnek kimliğini girin, 2 boş ve tıklama ölçün açıklandığı gibi ilk örnek mcL yükleyin. Her bir ölçüm için, örnek bir taze 2μL kısım kullanılmalıdır. </li><li> Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek çıkarın. </li></ol> e. Temizleme Microvolume Protein A280 Ölçümler Sıradan bir, tüy bırakmayan bir laboratuar silin genellikle ölçümler arasındaki optik kaideleri temizlik için yeterlidir. f. Yenileme Protein A280 ölçümler yapma Yüzey içeren çözeltiler ve reaktifler formu için örnek sıvı sütunu önlenmesi, zaman içinde ölçüm kaide yüzeyleri uncondition olabilir. Düzleşme alt kaide üzerinde damlacık bir optik yüzey şarta bağlı olma göstergesidir. Yüzey özellikleri tehlikeye varsa, kaideleri yenileme örnek sütun oluşumu sağlamak önemlidir. Eğer bu olursa, devetüyü şiddetle laboratuar silin ya da yönetmen olarak (PR-1) NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik kullanarak optik yüzeyler. III. Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini Kolorimetrik Tahliller a. Kolorimetrik algılama ilkesi NanoDrop 2000c spektrofotometre kolorimetrik testleri kullanarak uncharacterized protein çözümleri, cep lizatları, ve ham protein ekstreleri de ölçmek için kullanılan olabilir. Kolorimetrik yöntemleri boya, görünür dalga boyu aralığında ışığı emer yeni bir kompleks üretmek için örnek protein bileşeni ile etkileşim gerektiren dolaylı yöntemler. NanoDrop 2000c spektrofotometre BCA, Bradford, Pierce 660 ve Lowry yöntemleri de dahil olmak üzere birçok önceden yapılandırılmış kolorimetrik testleri vardır. BCA testi kolorimetrik tahlil microvolume spektrofotometre kullanarak bir örnek olarak gösterilebilir. (Ekran görüntüsü) BCA (Bicinchoninic Asit) testi genellikle seyreltik protein çözümleri ve proteinlerin varlığında önemli UV (280 nm) absorbans bileşenler için kullanılan ortak bir kolorimetrik yöntemle. Protein A280 yönteminin aksine, Protein BCA yöntemi örnek protein konsantrasyonu ölçülebilir önce bir standart eğri oluşturulur olmasını gerektirir. Bu yöntem algılama reaktif bicinchoninic asit (BCA) kullanır. Protein varlığında oluşan Cu-BCA şelat 562 nm&#39;de ölçülür ve 750 nm dalga boyunda normalize edilir. b. Microvolume BCA Testi Ölçümleri BCA Testi Hazırlık <ol><li> BCA reaktif A, B BCA reaktif, Uyumluluk reaktif, Sulandırma tampon ve Albumin (BSA) standartlarına: Gerekli reaktifler indirgen uyumlu kiti (Thermo Scientific Pierce kedi hayır 23250) bulunur. </li><li> Oda sıcaklığına kadar bilinmeyen tüm proteinler ve protein standartları dengelenmesi ve iyice karıştırın. </li><li> Standartları ve reaktif bir 50:1 oranı kullanılarak ölçülecek numune için yeterli taze çalışan reaktif hazırlayın: B </li><li> Mikro testi için örnek çalışma reaktifi 1:1 oranında kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 10 mcL ekleyin. Yüksek oranda test için örnek çalışma reaktifi 20:01 oranı kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 190 mcL ekleyin. Örnekler için uygun oranı belirlemek için Pierce BCA kiti edebiyatına bakın. </li><li> Her tüp içeren reaktif standart ya da numune 10 mcL ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız. </li><li> 37 tüpleri ° C&#39;de 30 dakika. </li><li> Reaksiyonların, oda sıcaklığında (~ 10 dakika) gelmesini sağlayın. </li></ol> c. Standart Eğri oluşturma Microvolume BCA Testi Ölçümleri <ol><li> Protein BCA yöntemi ana menüden seçin. Dalga boyu doğrulama penceresi belirirse, kol aşağı doğru olduğundan emin olun. </li><li> Sağ bölmede tabloda her bir standart konsantrasyon değerleri girin. Yazılım, referans ve en fazla 7 addit sağlarional standartları. Referans ve / veya standartlara çoğaltır ölçülmelidir. Not: standart eğri üretimi için minimum gereksinimi iki standartları ölçüm veya sıfır referans ve en azından tek bir standart ölçüm. Bu beklenen tahlil konsantrasyon aralığında karşılamak için gerekli ilave standartlar dahil olması tavsiye edilir. </li><li> Boş bir kurun. Kolorimetrik deneyleri için boş genellikle H 2 O. deiyonize </li><li> Pipet dH 2 O 2 mcL alt kaide üzerine, kol alt ve Boş tıklayın. Sadece boş bir sonraki tüm ölçümler, referans ve standartları karşılamak için gerekli. </li><li> Alt kaide üzerine herhangi bir protein ile sadece çalışan reaktif ve tampon içeren 2 mcL kısım pipetleme referans oluşturulması. Alt kol ve tıklama ölçün. </li><li> Standartları sekmesi altında, istenilen standart ve alt kaide üzerine istenen standart pipet 2 mcL vurgulayın. Alt kol ve tıklama ölçün. Tüm standartları için bu işlemi tekrarlayın. Önce tüm standartlara ölçme örnekleri ölçmek için emin olun. Standart Eğri standart eğri görüntülemek için Göster&#39;i tıklatın. </li></ol> d. Microvolume BCA Testi Ölçümleri 2 mcL Protein Ölçümleri <ol><li> Standartlarının tüm ölçülen sonra, Örnekleri düğmesini tıklatın. Örnek kimliğini girin. Örnek alt kaide üzerine 2 mcL Yük ve Ölçme tıklatın. Her bir ölçüm için örnek taze 2 mcL kısım kullanılmalıdır. </li><li> Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek silin. </li></ol> e. Microvolume BCA Testi Ölçümleri Temizleme ve Yenileme Temizlik ve yenileme doğrudan A280 absorbans ölçümleri açıklandığı gibi gerçekleştirin. Temsilcisi Sonuçlar: Microvolume A280 ölçüm doğrudan veya dolaylı bir kolorimetrik tahlil ya protein konsantrasyonu tayini yapılır. A280 ölçüm örnek protein ilgi yok katsayısı dayalı protein konsantrasyonu belirler. BCA kolorimetrik tahlil örneği bilinen protein konsantrasyonları, standart bir eğri tabanlı protein konsantrasyonu belirler.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve araçları üreten Thermo Fisher Scientific çalışanları.

Microvolume kantitatif iki ölçüm yüzeyleri arasında bir sıvı sütunu oluşturmak için bir örnek içsel yüzey gerilimi özellikleri kullanır. Çevreleme cihazın bulunmaması, yol uzunluğu aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, gerçek zamanlı olarak değiştirmenize olanak sağlar. Bu özellik, protein konsantrasyonları dinamik aralık gibi ölçüm hızı önemli ölçüde artar. Örnek az miktarda kullanarak, örnekleri çok sayıda bilim adamları daha fazla ölçümleri almak ve daha iyi kalite kontrolü sağlamak için izin hızlı ve doğru bir şekilde analiz edilebilir. Buna ek olarak, ve gerekirse, değerli örnekleri bir ölçüm aldıktan sonra kurtarıldı olabilir. Böyle küçük hacimli ölçülen zaman, örnek homojenlik örnekleme hatalarını önlemek için son derece önemlidir. Düşük tutma pipet uçları her zaman yükleme örnekleri için kullanılan ve örnek çoğaltır arasındaki ipuçlarını değiştirilmesi gerekir. Kaide yüzeyleri düzgün bir şekilde temizlenmeli ve en doğru sonuçları elde etmek için klimalı olmalıdır. Son olarak, örnek sınırlı microvolume spektrofotometre ideal olmakla beraber, kullanım kolaylığı, hız ve geniş dinamik aralık spektrometre örnek bol olduğunda uygun hale.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Geleneksel spektrofotometri Küvet veya kapiler içine yerleştirerek örnekleri gerektirir. Bu genellikle, genellikle protein analizi için kullanılan sınırlı örnek hacmi nedeniyle pratik. Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrofotometre numune miktarının 0.5-2 mcL düşük hacim sağlayarak, sıvıların yüzey gerilimi özelliklerini kullanarak iki ölçüm yüzeyleri arasındaki microvolume örnekleri tutan yenilikçi bir örnek saklama sistemi ile bu sorunu çözer. Küvet veya kılcal damarların ortadan kaldırılması, dinamik aralık ölçülebilir protein konsantrasyonları önemli ölçüde artırırken ölçüm zamanını azaltır yol uzunluğu gerçek zamanlı değişiklikleri, sağlar. Dilüsyonları için ihtiyaç da ortadan kaldırılabilir ve ölçüm yüzeyleri sadece laboratuar silin ile silinebilir olarak numune ölçümü için hazırlıklar nispeten kolay. Bu video makale A280 absorbans okumaları veya BCA kolorimetrik tahlil kullanarak microvolume miktarda protein ölçümü için geleneksel protein konsantrasyonu tespiti yöntemlerine değişiklikler sunar.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

113.9K Görüntüleme.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Kanser Araştırmaları

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Kimya

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Biyomühendislik

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

Sulu Medyada Nanomalzemelerin UV-Vis Spektroskopik Karakterizasyonu

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

Mühendislik

Kütle Fotometrisi Analizi Konsantrasyon Aralığının Mikroakışkanlar ile Genişletilmesi

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

Yazar Gündemi: MassFluidix Teknolojisi Kullanılarak Çözeltideki Düşük Afiniteli Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Biyokimya

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biyoloji

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Boyut Dışlama ICP-MS kullanarak Nicel Metalloproteomic Analiz Standartları

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Sulu Medyada Nanomalzemelerin UV-Vis Spektroskopik Karakterizasyonu

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Mikroakışkanların Kütle Fotometrisi ile Birleştirilmesiyle Mikromolar Derişimlerde Protein Kompleksi Oluşumunun Analizi

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması