This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

<ol>
	<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design.">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li><li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology.">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li><li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery.">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li><li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry,+thermal+shift+(ThermoFluor)+assay,+and+multiangle+or+static+light+scattering.">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li><li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability,+protein+crystallization,+and+structure+determination.">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li><li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+our+mistakes:+the+'unknown+knowns'+in+fragment+screening.">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li><li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery.">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li><li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions.">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li><li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands.">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li><li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase:+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor.">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li><li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII.">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li><li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region.">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li><li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant.">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).</li><li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+WcbI,+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme.">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li><li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein.">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li><li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans:+a+screening+test+for+binding+specificity.">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li><li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL.">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li><li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

fluorimetry סריקת ההפרש הוכיח את כוחה כשיטת חזקה ותכליתית לאפיון חלבונים, וזיהוי ligands חלבון הפוטנציאלי. ההצלחות המתועדות היטב בזירוז ייצוב חלבון, גילוי תרופות (במיוחד במעבדות פחות מימנו גם) והתגבשות 10,23-25 ​​עשו את זה בשיטה אטרקטיבית לסינון ראשוני של תרכובות. תרכובות הוסיפו לחלבונים מצביעות על עלייה ברורה במינון תלויה ב7,9 טמפרטורת התכה לכאורה. עם זאת, יש כבר כמה ניסיונות להשתמש בתוצאות מהניסויים אלה כדי לקבוע קבועים המחייבים לכאורה כדי לסייע בדירוג תרכובות לזיקה שלהם. כאן, אנו מציגים שיטה לקביעה באופן שיטתי קבוע דיסוציאציה לכאורה לחלבונים בנוכחות ליגנד. התוצאות שהוצגו כאן מראות כי DSF במהירות ובאופן עמיד יכול לספק הערכות של קבוע דיסוציאציה לשילוב חלבון ליגנד. ניתן להשפיע נתונים נצפו עם כלים זמינים מסחרי כדי לספק נחישות מהירה של ד K, ללא הצורך להניח הנחות באשר לערך הצפוי של פרמטרים. יש שיטת יתרון משמעותי על פני כמה בשיטות דומות של להיות חסכן בשני חלבונים וזמן הנדרשים. הניסוי המתואר כאן יצרוך 0.13 מ&quot;ג חלבון לכל ניסוי (כ 0.4 מ&quot;ג לניסויים חוזרים ונשנים בשלושה עותקים). זה משווה לטובה עם calorimetry טיטרציה בידוד התרמי (ITC), שבו ניסוי יחיד עם חלבון kDa 40 ממוצע יצרוך כמות דומה. הסט המלא של ניסויים הנדרשים לפרוטוקול זה היה לצרוך כ -4 שעות, כולל הכנה, לסט אחד של ניסויים. שוב, זו עשויה להיות משמעותי יותר מהר מאשר שיטות כגון ITC או תהודת plasmon פני השטח, אשר לעתים קרובות תוך עוצמה דורש אופטימיזציה ניכרת כדי להשיג נתונים הטובים ביותר. התוצאות שלנו מראות כי יש עדיין דרישה לבחון בזהירות את הנתונים הגולמיים, בכושר של נתונים אלה כדי לקבוע את טמפרטורת ההתכה, ואת ההתאמה של נתוני טמפרטורת התכה כדי לקבוע את קבוע דיסוציאציה. אתגר ראשון הוא הצורה של נתונים הגולמיים המופקים בהיתוך החלבון. בחלק מהמקרים, את הצורה לא להתקרב לזה שנצפה באיור 1 א. נושאים משותפים כוללים משמרות בטמפרטורה נמוכות על יגנד מחייבים, הקרינה רקע גבוהה, ומעברים מרובים יוצא דופן בטמפרטורה. משמרות טמפרטורה נמוכה נתפסות על כריכת מספר הליגנדים. לשיטה זו, הפרמטר הקריטי ביותר הוא השגיאה במדידת T מ &#39;, בהשוואה לשינוי הטמפרטורה. נתונים בדרך כלל יכולים להיות מצוידים בצורה סבירה כאשר סטיית התקן של מדידות בשלושה עותקים לא תעלה על 10% שינוי טמפרטורת ההתכה בין חלבון מאוגד וכרוך באופן מלא. הניסיון שלנו הוא שבו זמני כגוןמשמרות erature רק 2 מעלות צלזיוס, זה יכול להיות מספיק עבור התאמת הנתונים, אם נקודות נתוני הפרט הן מאוד מדויקות. נושא שני הוא בצורה יוצאת דופן עקום. אלה נבדלים לעתים קרובות בין חלבון החופשי וטפסים ליגנד קשורים, כיגנד המחייב משפיע התגלגלות מצבים של החלבון. במקרים אלה, המשתמש חייב לשקול אם הנתונים ניתן להשתמש עם התחשבות הולמת במודלים שישמשו לקביעת טמפרטורת התכה וקבועה דיסוציאציה. בעיה נפוצה נוספת היא כי תוספת של cofactor לחלבון (לדוגמא, MgCl 2 בדוגמא שלנו עם hexokinase) נדרש כדי להשיג את הנתונים אמינות ביותר. הניסיון שלנו היה ששיקול דעת של כל הגורמים צפויים בניסוי בשלב של לקיחת קריאות ראשוניות היא חיונית להשגת התוצאות הטובות ביותר. יתר על כן, טיפולים תיאורטי חלופיים יכולים לחשוף תכונות של נתונים אלה 15,17. לבסוף, אין זה נדיר עבור חלבונים מסוימים שגontain מקורי נחשף אזורים הידרופובי להראות הקרינה רקע גבוהה. ישנם מספר פתרונות לבעיות אלה, שנסקרו בהרחבה במקומות אחרים 6,9. בפרט, המשתמש חייב לשקול אם להשתמש בולצמן או מודלים נגזרים (למשל, איור 4), ובמקרה של שימוש בנגזרים, אם חייב להיות מודל נמס מרובה. שתי השיטות למידול תרמית התגלגלות שונות שבשיטה בולצמן מתאימה את נתוני ניסוי למשוואת בולצמן, בהנחת צורת sigmoidal רגילה לעקומת התגלגלות. בניגוד לכך, השיטה הנגזרת לוקחת הנגזרת הראשונה של נתוני ניסוי בכל נקודה (פנל תחתון באיור 1 א), ורואה את טמפרטורת ההתכה להיות הנקודה נגזרת הראשון הגבוה ביותר. השיטה הנגזרת, בדרך כלל, חוזרת טמפרטורת התכה גבוהה יותר בכ 2 - 3 מעלות צלזיוס. רוב החלבונים יחזרו עקביים יותרתוצאה (כלומר, סטיית ההתקן של טמפרטורת ההתכה לניסויים בשלושה עותקים הוא נמוכה יותר) לאחת משתי השיטות. זה בדרך כלל בצורה אינטימית הקשורים לצורה המדויקת של חלבון התגלגלות עקומה, ויש צורך לקבוע את השיטה הטובה ביותר בכל מקרה ומקרה באופן אמפירי. איפה המודל הנגזר משמש, חשוב גם לקחת בחשבון אירועי היתוך מרובים. חלק מהנתונים מראים בבירור ראיות למעברים מרובים, ובמקרים אלה התוצאות צפויות להיות קל יותר לפרש אם אירועי היתוך המרובים אלה הם מודל. בהקשר של פרוטוקול זה, הוא לעתים קרובות את המקרה כי התוספת של ליגנד יכולה לגרום לחלבון לעבור מיש מעברי היתוך מרובים למעבר בודד (למשל, על ידי ייצוב המשנה ביותר תרמית השבירה), או להיפך. היינו אפוא עו&quot;ד שהנתונים הגולמיים נבחנים יחד לפני שוקל גישה אשר יהיה הטוב ביותר לשימוש. בעקבות מ &#39;odelling של טמפרטורות התכה בודדות, נושאים נוספים יכולים להתעורר בהתאמה אלה לדגמים שהוצגו בסעיף בפרוטוקול. זה הכרחי כדי לבחון היטב את ההתאמה למשוואה הקבועה דיסוציאציה באמצעות סולם לוגריתמים, כמו ניתוח זה לעתים קרובות מדגיש פערים בין הנתונים שנצפו והמודל (ה .g., איור 3). בעוד התוצאות שהתקבלו הן בדרך כלל חזקות, טיפול בפרשנות מציע את ההזדמנות כדי לחלץ תוצאות טובות יותר, והמשמעות ביותר, מן הנתונים. נושא מסוים שהועלה על ידי נתונים אלה הוא הפרשנות שצריכה להיות ממוקם על חלבונים שמראים cooperativity, או אירועים המחייבים מרובים, בDSF. יש לנו, עד היום, רק בתופעה זו, בחלבונים שצפויים להיות להם אירועים המחייבים ספציפיים מרובים (למשל, WcbM, חלבון שטוב ביותר homologue הוא multimer 26, ואשר משמש כmultimer על כרומטוגרפיה הדרת גודל [נתונים לאמוצג]). זה בכלל לא ברור שcooperativity השלילי שנצפה בdenaturation DSF מצביע על כך שאנזים סופו של דבר להראות cooperativity השלילי: ולא, זה עשוי להיות סימן למחייב מורכבים שחייבים להיחקר באופן יסודי יותר באמצעות מגוון רחב יותר של שיטות. אין זה מרמז לנו, עם זאת, כי מחקרים מקיפים יותר של חלבונים כאלה עשויים לזהות תופעות מעניינות. ערכי הנתונים עבור קבוע דיסוציאציה שימוש בשיטה זו הם בדרך כלל באותו סדר כמו אלה המסופקים על ידי שיטות אחרות, כגון calorimetry טיטרציה הבידוד התרמי ותהודה plasmon פני השטח. עם זאת, הערכים מוחלטים שנצפו גבוהים יותר בתדירות גבוהה יותר מאשר נצפה באמצעות שיטות אלה. זה לפחות בחלקו מעובדה שקבוע דיסוציאציה הוא ציין בטמפרטורת ההתכה של החלבון עם ליגנד. ד K זה גבוה בדרך כלל מזו בטמפרטורות פיסיולוגיות. Dissociation קבוע קשור לטמפרטורה של התגובה על ידי המשוואות: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (שבו θ c הוא ריכוז ההתייחסות הסטנדרטי, Δ r G הוא השינוי באנרגיה החופשי של גיבס של התגובה, R הוא קבוע גזים הטוחנות, Δ H הוא השינוי באנתלפיה בתגובה, וΔ S הוא שינוי אנטרופיה בתגובה .) תגובות עם קבועי דיסוציאציה בטווח המדידה של שיטה זו, בדרך כלל, יש לי G r Δ שלילי, ולכן ההשפעה של עלייה בטמפרטורה במשוואה [1] תהיה להגדיל את הניתוק מתמיד. שני מונחי Δ H וΔ S המהווים את האנרגיה החופשית של גיבס (משוואה [2]) הם temperaturדואר 27 תלויים, וההשפעה על קבוע דיסוציאציה יהיו תלוי בגודל ובסימן של תלות הטמפרטורה אלה, ובהכרח יהיו אינטראקציה תלויה. כתוצאה מכך, זה לא בלתי צפוי שקבועי דיסוציאציה נקבעו על ידי שיטה זו הם לעתים גדולים יותר מאלה שנקבעו על ידי שיטות הפועלות על RT. תלות בטמפרטורה גם היא, כמובן, אזהרה של שיטות רבות אחרות, שנוטים לספק את קבוע דיסוציאציה בטמפרטורות נמוכות מהטמפרטורה הפיזיולוגית. אזהרה נוספת של שיטת DSF היא שזה שיטה שכותרתו, בניגוד לITC. תווית הניאון משמשת (SYPRO Orange) היא הידרופובי, ולכן במקרים מסוימים יכולה להתחרות עם הכריכה של ליגנד הידרופובי לחלבונים. כתוצאה מכך, סביר להניח כי במקרים מסוימים, קבוע דיסוציאציה הושג יועלו באופן מלאכותי בשל תחרות עם התווית. עם זאת, לשם ההשוואה של הליגנדים מגוונים, (השימוש העיקרי שלDSF), ההבדלים צפויים להיות משמעותי מספיק כדי להשפיע על הדירוג של תרכובות על ידי זיקה. חסרון פוטנציאלי של שיטה זו הוא המגבלה של זיהוי שניתן להשיג. בעיקרון, זה לא אמור להיות אפשרי באופן מדויק למדידת ערך עבור ד K שאינו עולה על 50% מריכוז החלבון, ואפילו ערכים בטווח זה עשויים להיות דיוק מפוקפק. בעוד המגבלה של זיהוי בקצה הזה של הטווח ניתן להאריך מעט על ידי הפחתת הריכוזים של חלבון וצבע, הרגישות של המכשיר תהיה למנוע ירידה נוספת בריכוז חלבון. בדומה לכך, הקצה העליון של הרגישות שייקבע על ידי המסיסות של ליגנד. לקבלת אומדן מתמטי חזק לד K, חשוב ביותר לקבל נתונים עם 90% מהחלבון הנוכחי בצורה הנכנס ליגנד, אשר דורש ריכוז ליגנד להיות מקורבly עשר פעמים ד K (בהנחה שאין cooperativity). המגבלה של זיהוי ולכן תהיה בהכרח להיות עשירית מהמסיסות של ליגנד במאגר הרלוונטי. משמעות דבר היא כי גבולות זיהוי של השיטה ינועו בדרך כלל בין 1 מיקרומטר ובין 1 ו100 מ&quot;מ, בהתאם לחלבון ויגנד. לסיכום, fluorimetry סריקת ההפרש הוא טכניקה תכליתית החלים על מגוון רחב של חלבונים. שימוש בשיטות שהוצגו כאן, זה אפשרי במהירות ובזול כדי לקבוע את הזיקה של חלבון לליגנד שונה. זה יש פוטנציאל גדול לשימוש בטיהור חלבונים וייצוב, הבהרת הפונקציה או ספציפי של אנזימים מmetagenomes, ובגילוי תרופות, במיוחד במעבדות קטנות.

כל החלבונים יהיו לאגד, עם זיקות שונות, למגוון רחב של מולקולות אחרות מיונים פשוטים למקרומולקולות הגדולה אחרת. במקרים רבים, חלבונים נקשרים לשותפי מולקולה קטנים, כחלק מהתפקוד התקין שלהם (למשל, קינאז מחייב ATP). אינטראקציות אחרות עשויות להיות קשורות לתפקוד, אך בניסוי שימושי כמו כלים (לדוגמא, מולקולות קטנות שמייצבות חלבונים כדי לשפר את הצלחת גיבוש, או לסייע בשמירה על חלבונים בפתרון); בעוד מולקולות קטנות אשר נקלטות על ידי אתרים פעילים ואתרי allosteric של חלבונים יכול לשמש כמעכבים, וכך לווסת את הפעילות של אנזימים. יש מגוון רחב של טכניקות שיכולים לשמש כדי לקבוע את הזיקה של חלבונים למולקולות שותף. calorimetry טיטרציה בידוד התרמי 1 נתפס נרחב כמו &quot;תקן זהב&quot;, כפי שהוא מספק מידע עשיר על תגובות, הוא תווית חופשית, והגביל הזדמנויות לrtifacts של הניסוי. עם זאת, למרות השיפורים אחרונים ברגישות של המכשור והאוטומציה של הגדרה ניסיונית, זה עדיין יקר יחסית במונחים של דרישות חלבון, יש במקרה הטוב תפוקה נמוכה עד בינוני, ומתאים ביותר לאינטראקציות עם בינוני עד זיקות גבוהות (10 ננומטר לד K 100 מיקרומטר) 2. שיטות תווית אחרות ללא תשלום, כגון תהודת plasmon פני השטח או הצעת אינטרפרומטריה 3 bilayer תפוקה גבוהה יותר, והשיג הרגישות לזיהוי מולקולות קטנות יותר נמוכות כמו 100 Da. עם זאת, מכשירי תפוקה גבוהים לשיטות אלה הם יחסית יקרים, מוצדקים רק בו יהיו תפוקה מתמשכת של פרויקטים רלוונטיים, ולכן הם עלולים להיות בלתי נגישים לרבים מעבדות אקדמיות. fluorimetry ההפרש הסריקה (DSF, או thermofluor) תואר לראשונה בשנת 2001 4 כשיטה לגילוי סמים. בmetho זהד, חלבונים מודגרת עם צבע פלואורסצנטי (צבעים תחילה נפטלין-sulfonic שמשו), המשנה הקרינה שלה על כריכה לאזורים הידרופובי של החלבונים. מדגם חלבון צבען הוא מחומם ואז, והקרינה במעקב כחום עולה. התגלגלות של החלבון, וחשיפה של חלקים ההידרופובי של החלבון, מולידה דפוס אופייני בקרינה כפונקציה של הטמפרטורה (איור 1 א). הניסוי יכול להתבצע בכמויות קטנות בכל מכשיר PCR כמו מסחרי, וכן בניסוי אחד, מספר גדול של דגימות ניתן לבדוק בו זמנית (בדרך כלל 48, 96 או 384 דגימות, בהתאם לדגם המכשיר). בדרך כלל ניתן לבצע ניסויים ברחבי שעה, מתן האפשרות לניתוח תפוקה הגבוה של הדגימות 5. שיפורים נוספים למתודולוגיה שראו אימוץ של צבעים עם תכונות ספקטרליות טובות יותר 6,7 </sup&gt;, כלים גנריים לניתוח נתונים, והציעו פרוטוקולים לסינון ראשוני 8,9. מגוון רחב של יישומים של השיטה הורחב, עם דגש מיוחד על קביעת תנאים אופטימליים לעריכה ולאחסון של חלבונים 10, ועל זיהוי שותפים המחייבים פוטנציאל לסייע התגבשות 11. התפוקה גבוהה יחסית של השיטה, עלות נמוכה יחסית בחלבון (~ 2 מיקרוגרם לתגובה), והתחולה ללימוד מולקולות מחייבות חלשות הפכה DSF כלי רב ערך עבור עיצוב סמים בר מבוסס, במיוחד בהקשר אקדמי 12-14. למרות היישום הרחב של DSF לחקר אינטראקציות חלבון ליגנד, כמה מחקרים שתיארו את נחישות של קבועי דיסוציאציה ממחקרים אלה. עם זאת, אלה נוטים לייצר משוואות מפורטות המתארות את התגלגלות של החלבון, עם פרמטרים רבים שצריכה להיות מצוידת לנתונים דלילים או בחלק דואר המקריםstimated 7,15-17. שיטות אלה הן רלוונטיים במיוחד במקרים מאתגרים, כגון תרכובות בחוזקה מחייבות, או חלבונים בו מוצגות מעברים יוצאות דופן. עם זאת, למעבדות רבות, ניתוחים מפורטים אלה הם מסורבלים מדי לשימוש שיגרתי. לפיכך, אנו מציעים טיפולים אלטרנטיביים לתרחישים שונים, ולהדגים כיצד אלה יכולים לשמש כדי להתאים נתונים כתוצאה מאינטראקציות חלבון ליגנד שונות. השיטה שלנו משתמשת במכשיר StepOne qPCR, שלתוכנת ניתוח הנתונים העידו זמינה; בעוד זו מאיצה את ניתוח הנתונים, תוצאות ממכשירים אחרים יכולות להיות מעובד בשיטות שפורסמו בעבר 9, ואת אותו הניתוח במורד הזרם יכול להתבצע.

<table><tbody><tr><td>StepOne real time PCR instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td></tr><tr><td>Protein thermal shift software v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast optical 48-well plates&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optical sealing tape&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td></tr><tr><td>U-bottomed 96-well plates</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td></tr><tr><td>SPSS statistics version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Other statistics packages will provide similar functionality</td></tr><tr><td>Hand applicator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

מגוון רחב של שיטות זמינים כעת לקביעת הניתוק המתמיד בין חלבון ואינטראקציה מולקולות קטנות. עם זאת, רוב אלה דורשים גישה לציוד מומחה, ולעתים קרובות דורש מידה מסוימת של מומחיות להקים ביעילות ניסויים אמינות ולנתח נתונים. fluorimetry סריקת ההפרש (DSF) נמצא בשימוש יותר ויותר כשיטת חזקה לסינון ראשוני של חלבונים לאינטראקצית מולקולות קטנות, או לזיהוי שותפים פיסיולוגיים או לגילוי להיט. טכניקה זו יש יתרון בכך שהיא דורשת רק מכונה PCR מתאימה לPCR כמותי, וכל כך מתאימה מכשור זמין ברוב המוסדות; מגוון מצוין של פרוטוקולים זמינים כבר; ויש תקדימים חזקים בספרות לשימושים מרובים של השיטה. העבודה האחרונה הציעה מספר דרכי חישוב קבועי דיסוציאציה מנתוני DSF, אבל אלה הם מבחינה מתמטית תובעניים. כאן, אנו DEMonstrate שיטה להערכת קבועי דיסוציאציה מכמות מתונה של נתונים ניסיוניים DSF. בדרך כלל יכולים להיות שנאספו נתונים אלה וניתחו בתוך יום אחד. אנו מדגימים כיצד שונים מודלים יכולים לשמש כדי להתאים את הנתונים שנאספו מאירועים המחייבים פשוטים, ובו אתרי קישור או עצמאיים מחייב שיתופיים נוכחים. לבסוף, אנו מציגים דוגמא לניתוח נתונים במקרה שבו מודלים סטנדרטיים אינם חלים. שיטות אלו מאוירות עם נתונים שנאספו על חלבוני שליטה זמינים מסחרי, ושני חלבונים מתכנית המחקר שלנו. בסך הכל, השיטה שלנו מספקת דרך פשוטה לחוקרים כדי לקבל תובנה נוספת לתוך אינטראקציות חלבון ליגנד באמצעות DSF במהירות.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

61.4K Views.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Biochemistry

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Bioengineering

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

זיהוי רגישות גבוהה של קשירת תרכובת-חלבון באמצעות פלואורסצנטיות

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. Umbelliferone, an active ingredient in Tibetan medicine Vicatia thibetica, exhibits an immunomodulatory effect with an unknown mechanism. The CD40 protein is a key target in the immune response. Therefore, this study employs the principle of differential scanning fluorescence technology to analyze the interactions between CD40 protein and umbelliferone using fluorescent enzyme markers. Initially, the stability of the protein fluorescent orange dye was experimentally verified, and the optimal dilution ratio of 1:500 was determined. Subsequently, it was observed that the temperature melting (Tm) value of CD40 protein tended to decrease with an increase in concentration. Interestingly, the interaction between CD40 protein and umbelliferone was found to enhance the thermal stability of CD40 protein. This study represents the first attempt to detect the binding potential of small molecule compounds and proteins using fluorescence microplates and fluorescent dyes. The technique is characterized by high sensitivity and accuracy, promising advancements in the fields of protein stability, protein structure, and protein-ligand interactions, thus facilitating further research and exploration.

מחבר זרקור: ייעול שיטות PCR לשיפור הנגישות והיעילות

This protocol describes a unique method for detecting the binding between compounds and protein molecules, offering the advantages of minimal protein sample loss and high data accuracy.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית