Bu araştırma NIH hibe SLB için GM055360 ve RGM için U54HD068157 tarafından desteklenmiştir. JMB Pennsylvania Üniversitesi (GM008216) de T32 Genetik Eğitim Grant tarafından desteklenmiştir.

STA-PUT protokol üç aşamadan oluşur: 1) cihaz ve reaktiflerin Set up, bütün testis hücre süspansiyonu 2) hazırlanması, ve 3) Hücre yükleme, sedimantasyon ve fraksiyon toplama. İki araştırmacı bir ekip tarafından gerçekleştirildiğinde, protokol ortalama sekiz saat sürer. 1.. STA-PUT Aparatı ayarlama (Şekil 1) Toplama bu yöntem tercih edilir *** STA-PUT aygıtı olup, bir 4 ° C büyük buzdolabı ya da bir kısım toplayıcısı kalabileceği soğuk bir odaya yerleştirilir. <ol><li> Önce (ya da en azından bir kaç saat önce), yöntemini gerçekleştirmek gece, tüm ekipman (özellikle cam ve boru) yıkayın ve% 70 etanol ile sterilize. Tam olarak Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, düzenek monte edilmeden önce ekipman kuru olsun. </li><li> İki 2 L silindiri (Şekil 1 B ve C) ve hücre yükleme odasının (edin <strong&gt; Şekil 1A) üst platforma ve boru kelepçeleri ile boru iki küçük parçalar ile tüm bağlayın. Kelepçe bütün tüpler kapalı. En sağdaki 2 L silindir üzerinde ağzı kapatılmalıdır. </li><li> Hücre yükleme odası içinde küçük bir karıştırma çubuğu (Şekil 1A) ve% 2 BSA içerir sol-en 2 L silindir daha büyük bir karıştırma çubuğu (Şekil 1 B) yerleştirin. </li><li> Platformu (Şekil 1D) 2 L sedimantasyon odasına yerleştirin. Doğrudan sedimantasyon odasının (Şekil 1D) altındaki açıklığın üstündeki metal bölmesini (Şekil 1F) yerleştirin. Bölme fraksiyon toplama sırasında hücre degrade sıvı ve bozulma vorteks engeller gibi bu önemlidir. Sedimantasyon odasının üst kapağı yerleştirin. </li><li> Üç yollu vana (Şekil 1G) buzlu cam eklemli vakum yağ çok az miktarda uygulandıktan sonra, se dibine musluğunu kelepçedimentation odası, vana ve sedimantasyon odasının buzlu cam eklem bağlantı. </li><li> Boru takımı ile birlikte vana doğru çıkışına hücre yükleme odası (Şekil 1A) takın. Musluğu kapatın. </li><li> Musluğu sol çıkışına hücre parçalanması boru takın. Fraksiyonlama boru açık olan ucuna bağlı bir cam Pasteur pipeti ile bir boru parçasını içerir. Daha küçük delik boru parçası cam pipet dar ucuna takılır. Dar pipet fraksiyon toplama sırasında hücre süspansiyonu akışını kısıtlar. Çok altındaki bu küçük tüp kelepçe. </li><li> 2 L Krebs hazırlayın (1x) deneyi (Tablo 1) gün tampon. Daha sonra, 1 x 550 ml Krebs 2% BSA, 1 x 550 ml Krebs% 4 BSA ve 1x Krebs 50 mi% 0.5 BSA hazırlar. Filtre edin ve 4 ° C&#39;ye kadar, bu çözüm soğuk </li><li> Doğru 2 L silindir (Şekil 1C) &#39;de% 4 BSA çözeltisi ve% 2 BSA dökünSol 2 L silindir (Şekil 1 B) çözelti. Emin bu silindirler bağlayan boru içinde hiçbir büyük baloncuklar olmadığından emin olun. </li><li> Bu degrade rahatsız olabilir gibi, hücre yükleme odasına Krebs tampon dökün ve emin hiçbir büyük kabarcıklar vardır yapma, sedimantasyon odasının bu odayı birbirine bağlayan boru doldurun. Sıkma veya boru flicking yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için yardımcı olur. Krebs tampon her tüp içinde olup hücre odası içinde olduğundan emin olun. </li><li> Krebs tampon küçük bir miktar, sedimantasyon odasının içine akar ve daha sonra tüpün doldurulması ve herhangi bir büyük kabarcıklarını çıkarmak amacıyla hücre ayırma boru içine hemen hemen tüm tampon boşalmasına izin verin. </li><li> Doğrudan sedimantasyon odasının altında kısım toplayıcısı yerleştirin. Tüm fraksiyon tüpler yerdesiniz ve kirlenmesini önlemek için plastik örtü ile kaplı olduğundan emin olun. </li></ol> 2. Tüm Testislerin gelen spermatogenic Hücreleri Ayırma <ol&gt; <li> Ca 12 yetişkin farelerin (tercihen en az sekiz haftalık) ve oda sıcaklığında Krebs tampon yerinde herhangi bir kirlenmesine malzemeyi yıkayın Testisler ayır. Gösterilmediği Bu protokol laboratuvar farelerin kullanımını gerektirir ve Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi kurallarına uygun idam edildi. </li><li> Eğer seminifer tübüller eklemek niyetinde hemen önce konik bir tüp içinde 50 ml Krebs tampon 45 mg kollajenaz ekleyin. Bu çözelti bir kaç dakika boyunca 33 ° C&#39;ye kadar ısınmasına izin vermeyin. Iki adet 50 ml konik tüpler içine eşit olarak bölünür. </li><li> Tunika albuginea atarak ve seminifer tübüller bırakmadan, 8 ml Krebs tampon içeren ayrı bir tabak içinde testisler açarlar. Tunika albuginea seminifer tübüller çevreleyen ince bir zardır. Tübüller kolayca tunika albuginea ayırmak gerekir. Bunu yapmak için, tunika albuginea bir kesi yapmak, bir pai ile bu membran tutunforseps r ve uzak forseps başka bir çift ile zardan dışarı tübüllerini itin. </li><li> Kolajenaz çözeltisi 25 ml içeren, her konik tüp tübülleri içeren 4 ml Krebs tamponu ilave edin ve 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkalama, inkübe edilir. Sonunda, tübüllerin bir &quot;spagetti-benzeri&quot; bir görünüme sahip olmalıdır. </li><li> Tübüller tüpün altına ~ 5 dakika boyunca çökmesine izin verilmektedir. Süpernatantı dökerek tübüller tüpün dibine her oturuşmaya bırakılmış, (oda sıcaklığında) 25 ml Krebs tampon maddesi içinde 2 x yıkayın. Her bir tüp içinde ~ 5 ml Krebs tamponu bırakın. </li><li> Yıkama, sen seminifer tübüller eklemek niyetinde hemen önce bir şahin tüp 50 ml Krebs tampon 30 mg tripsin eklemek iken. Bu çözelti bir kaç dakika boyunca 33 ° C&#39;ye kadar ısınmasına izin vermeyin. Iki adet 50 ml konik tüpler içine eşit olarak bölünür. </li><li> 25 ml tübülleri içeren iki tüpün her birine tripsin solüsyonu ekleyin. Hücre önlemek için her bir tüpe 3 ug DNAz (1 μg/10ml) eklemetopaklanma s. 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkayalarak kuluçkalayın. </li><li> Yaklaşık 10x ve onları pipetleme, tübüllerini içeren çözümü kışkırtmak için geniş bir delik pipet kullanın. Çözüm daha tek bir hücre süspansiyonu gibi aramaya başlamalıdır. </li><li> Ilave bir 10 dakika boyunca 33 ° C &#39;de, çalkayalarak kuluçkalayın. Yaklaşık 25x ve onları pipetleme, tek bir hücre süspansiyonu içine tübülleri dağıtmak için, geniş bir delik pipet kullanın. Hala tübüller veya hücre kümeleri çok görürseniz, pipet ile daha dağıtmak ve / veya her bir tüpe başka 3 ug DNAz (çift başlangıç ​​konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Bir 100 um gözenekli bir hücre süzgecinden (30 mi hücre süspansiyonu her bir tüp için bir tane) ile tek bir hücre süspansiyonu filtre. Hücre süspansiyonları birleştirin ve hücrelerin toplam sayısı (8 ila 10 x 7-8 arası hücre olmalıdır) sayılır. *** Degrade üzerine FAZLA 800000000 hücreleri yüklemeyin. </li><li> Adım 2.10 &#39;de elde edilen hücre sayısı göre, appropr peletiate 5 dakika boyunca 450 RCF süzüldü hücre ve 30 ml Krebs tamponu ile yıkayın. Tekrarlayın. *** Genellikle 22 testisler daha 800.000.000 hücreleri verecektir, ancak bu hücre sayısından daha fazla yük yok. </li><li> Dikkatle kabarcıklar yaratmadan (hücre topaklanma derecesine bağlı olarak) DNAse ug 2.5 ile 5 içeren 25 mi% 0.5 BSA içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hücreler kümelenir yok emin olun. 100 mikron gözenekli hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu filtre. Hücreler artık yüklemeye hazırız. Tüpü birkaç kez ters yüz edilerek yüklemeden önce iyice karıştırın. </li></ol> 3. Hücre Yükleme ve sedimantasyon <ol><li> Emin musluk kapalıdır, ancak sıvı, sedimantasyon odasının (Şekil 1D) içine hücre bölmesi (Şekil 1A) akmasını sağlayacak konumda yapın. </li><li> Düşük ayarda karıştırma çubukları sürekli hareket sağlamak için (yaklaşık 70 rpm) hem karıştırma çubuğu tabak kapatın, ama yavaş yavaş. </li><li> Hücre odası (Şekil 1A) içine hücre süspansiyonu dökün ve hücreler, 10 ml / dk (Şekil 1D) &#39;lik bir oranda, sedimantasyon odasının içine yavaş yavaş akması, böylece musluğunu açın. Musluğu kapatın. Akış hızı, sedimantasyon odasının üzerinde hacim aralıkları işaretleyerek belirlenebilir. </li><li> Hücre odasına% 0.5 BSA çözeltisi 5 ml dökün ve 10 ml / dak &#39;lık bir hızda, sedimantasyon odasının içine boşaltın. Musluğu kapatın. Bu adım, hücre odasından dışarı hücrelerini yıkar. 4x tekrarlayın. </li><li> Gradyan hazırlayın: hücre bölmesi (Şekil 1A) ve iki 2 L silindir (Şekil 1B, C) ​​arasındaki kelepçeler açın ve 40 ml / dk &#39;lık bir oranda (Şekil 1D) de sedimantasyon odasının içine sıvı drenaj başlar hemen. Bu sedimantasyon odasına BSA gradyanı yüklemek için yaklaşık 20-30 dakika sürer, böylece akış hızını ayarlayın. Üstüne yalan hücrelerin ince, rahatsız tabakaBSA degrade görünür olmalıdır. BSA en yüklendikten sonra, musluğunu kapatın ve sıvı ayırma tüpüne sedimantasyon odasından akmasını sağlayacak konuma çevirin. </li><li> Heyecan tabak kapatın. </li><li> Hücrelerin bir saat ve 45 dakika süre ile çöktürmek için izin verin. BU DÖNEMDE CİHAZI RAHATSIZ ETMEYİN. Herhangi bir mekanik ajitasyon degrade rahatsız olabilir. </li></ol> 4. Kesirler Fraksiyonu ve Analizi Eğer aşağıdaki adımları gerçekleştirmek gibi ***, degrade rahatsız etmemek için dikkatli olun. BSA degrade rahatsız edilirse, yordam çalışmaz! <ol><li> Hücreler çökeltilir sonra, yavaş yavaş 50 ml konik tüp içine sedimantasyon odasından 50 ml drenaj ve kenara. Bu fraksiyon genellikle hücreleri ve enkaz istenmeyen kümeleri içerir. </li><li> Fraksiyon toplayıcı için kesir tüp takın. *** Bu elle fraksiyonların toplanması da mümkündür, bir fraksiyon collector kullanılamaz. </li><li> Fraksiyonları toplamak: 10 ml (bir toplama tüpü doldurmak) her 45 san toplanır, böylece vana ile akış hızını ayarlayın. </li><li> Fraksiyon toplama tüpleri Cap ve 4 ° C&#39;de 450 RCF 5 dakika boyunca dönmeye , Yavaşça Süpernatantı dökün kalan sıvı süspansiyon hücrelerin, ve buz üzerinde hücre tutmak. </li><li> Tüm fraksiyonlar toplanır sonra, mikroskobik olarak farklı hücre popülasyonları için fraksiyonlar analiz. Farklı hücre tipleri, hücre boyutu ve nükleer morfolojisi 8,15 göre ayırt edilebilir. 2 (a) ve öz değişmesine ait somatik hücreleri ve spermatogonia için zenginleştirilmiş üç birleştirilmiş fraksiyonlardan için &quot;temsili sonuçlar&quot;, (b) yuvarlak spermatidler ve göstermektedir Şekil (c) uzatılması ve spermatidlerin yoğuşmalı. <ul><li> Bir spermatogonium Tip 12-14μm ca vardır. çapında ve kromatin kompozisyonunda homojen yuvarlak çekirdekleri var. </li><li> B Tipi spermatogonium 8-9μm ca vardır. çapı olan ve RounNükleer çevresi boyunca daha yoğun heterokromatine göstermek d çekirdekler. </li><li> Pre-leptoten spermatosit 7,5-8.2μm ca. çapı, B Tipi spermatogonia az sitoplazma ve B Tipi spermatogonyumlarda olanlara benzer çekirdekleri var. </li><li> Leptoten birincil spermatosit 8-10 mikron ca vardır. çapında ve ön leptoten spermatositlerin olanlara benzer, ancak nükleer membran daha yoğun kromatin kazanmak gibi çekirdekleri var. </li><li> Zigoten birincil spermatosit 10-12 mikron ca vardır. çaplı ve leptoten primer spermatositlerde kişilerce benzer çekirdeği vardır. </li><li> Pachytene spermatosit yerde 12-18 mikron ca vardır. çapı ve büyük bir çekirdeği çevreleyen sitoplazma ince bir kenar oluşur. Daha yoğun kromatin kümeleri çekirdeğinde görülebilir. </li><li> Yuvarlak Spermatidler 10 mikron ca vardır. çaplı ve ortasında bir yoğun-boyama chromocenter yuvarlak bir çekirdeği vardır. </li><li> Artıkorganları çapı 6.5 mikron, yuvarlak ve çekirdeği eksikliği ~ vardır. </li><li> Uzatma ve yoğuşmalı Spermatidler spermatidlerin yuvarlak boyutu benzer, ancak benzersiz, orak şeklinde çekirdek var. </li></ul><ol><li> Fraksiyonu 15 ile başlayın ve 85 kadar her beş kesirler analiz. Genellikle, altı 15 fraksiyonlar çok karışık ve clumpy olacak ve 85 yukarıda parçacıklar herhangi bir kullanılabilir hücrelere az içerir. </li><li> Fraksiyon toplama tüpü (hücreler, santrifüj işleminden sonra yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş bir defa) sıvının 5ul almak ve Krebs tamponu içinde% 8 formaldehit 5ul eklemek, bir fraksiyon analiz etmek. Sabit Hücreler, beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Sabit hücreleri% 0.1 Triton ve DAPI (5 μ / ml Krebs tampon) 5ul ekleyin. Hücreler, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> , Bir slayt üzerine elde edilen solüsyon 10 ul koyun örtücü bir kılıfla kapak ve her bir fraksiyonun saflığı belirlemek için flöresanlı bir mikroskop ile analiz edin. </li><li> Mayotik ve somatik hücreler diploid, yuvarlak spermatidlerin ve uzatma / yoğuşmalı spermatidlerin: boyutu ve nükleer morfoloji benzer hücrelerin aşağıdaki popülasyonları oluşturmak için (&quot;Temsilci Sonuçları&quot; bakın) kesirler birleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim. Gösterilmediği Bu protokol laboratuvar farelerin kullanımını içerir ve tüm ilgili kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. Bu protokolde kullanılan Hayvanlar Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC protokolü # 804284) rehberliği ve onayı altında tutulur.

Güvenilir bir hücre kültür sistemi henüz tüm spermatogenik hücre tiplerini 3 üretmek için yok gibi spermetogenez çalışma yapanlar, spermatojenik hücre örnekleri için hayvan modellerinde güveniyor. Spermatojenik hücreleri kolayca bütün testis toplanan rağmen, sadece karışık bir nüfus sonuçlanır. Bu tür mayotik hücreleri, yuvarlak spermatidler ve yoğuşmalı spermatidler gibi bu hücrelerin belirli alt tipleri, incelemek isteyenler için bir sorun teşkil etmektedir. Üç farklı y?...

Memeli spermatogenezis testislerin 1 seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Kısaca, seminifer tübül bölünmenin epiteli yakınında ikamet spermatogonium gibi-kök ve daha sonra mayozdaki bölünmeler geçmesi spermatositlerin, içine ayırt. Mayoz tamamlandıktan sonra, elde edilen haploid hücreleri ya da yuvarlak spermatid, Spermiyogenez, sitoplazma ile çekirdek kompaksiyon saçılmasını içeren bir farklılaşma sürecine tabi tutulur. Spermatidlere yavaş yavaş, sırasıyla, bir kamçılı geliştirmek ve çekirdeğin uzamasını ve yoğunlaşmasını geçmesi, uzatma ve ardından yoğuşmalı spermatidlerin üreten. Son ürünler seminiferous tübül ve sonuçta daha olgun epididimis lümeni içine salınır spermatozoa vardır. Spermatogenez süreci içinde özel hormonal ve moleküler koşullarına dayandığındantestisler, spermatogenez tüm süreç için güvenilir bir in vitro kültür sistemi henüz 2,3 geliştirilmiş değil. Kültür yöntemleri kök hücrelerden &quot;primordial germ hücresi benzeri hücreler&quot; ve haploid, &quot;yuvarlak spermatid-benzeri hücreler&quot; oluşturmak için geliştirilmiştir, ancak bu yöntemler henüz bu hücrelerin çok sayıda oluşturmak ve daha sonra spermatogenetik hücre üretmek için başarısız mümkün değildir türleri 4,5. Neyse ki, spermatojenik hücre tipleri, bir sıvı gradyanı ile ayrılması için bütün testisler elde edilen tek bir hücre süspansiyonu için izin veren, boyut olarak önemli ölçüde farklıdır. STA-PUT yöntemi, burada gösterdiği, büyüklüğü ve kitle 6-9 dayalı spermatojenik hücreleri ayırmak için bir doğrusal BSA degrade ve basit sedimantasyon kullanır. FACS ve sivili ayrıştırma 10-13: STA-PUT yöntem spermatojenik hücre tipleri ayırmak için diğer iki en yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre bazı avantajları vardır. STA-PUT aparatı onl gerektirirözel cam y birkaç adet soğuk oda veya büyük buzdolabı monte. Bu nedenle, bir hücre ayırıcıyla ya da elutriatörü kullanarak daha az pahalıdır. Her bir hücre popülasyonunun saflığı FACS 11 ile elde edilen kadar yüksek olmasa da STA-PUT yöntem olup, hücre tipi ve karşılaştırılabilir bir zaman dilimi içinde FACS ile sıralanabilir daha testis başına hücre yüksek miktarda elde edilir. Hücre (manyetik aktif hücre sıralama, MACS) son zamanlarda başarılı bir karma testiküler hücre nüfus spermatogonyumlarda zenginleştirilmesi için istihdam edildiğini, ancak 14 işaretleyicileri uygun yüzeyinin bilgi eksikliği nedeniyle spermatositlerin veya spermatidlerin ayırmak için şu anda uygun olan manyetik boncuklar kullanarak sıralama. FACS ya da MACS fazla STA-PUT yönteminin ilave bir avantajı, FACS protokolleri aksine, herhangi bir DNA ya da boyama diğer türleri gerektirmez, çünkü daha sonra kültür için uygun olan canlı hücreleri izole etmek için yeteneğidir. L gerekli çalışmalar içinSpermatogenik hücreleri türleri arge verimleri ~% 90 saflıkta, STA-PUT ideal bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td><td>Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Autoclave/filter and store at 4 &amp;deg;C for several months.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolve 4.24 g NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (~37%)</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLE 2: EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete STA-PUT apparatus</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td><td>Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m mesh filter</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Mouse dissection tools</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Need approximately 100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>Microscope slides, cover glass</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Fluorescent Microscope</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Memeli spermatogenezis testislerin seminifer tübüllerde çeşitli aşamalardan oluşan karmaşık bir farklılaşma süreçtir. Şu anda, in vitro spermatojenik farklılaşması için izin veren güvenilir bir hücre kültür sistemi olup, spermatojenik hücrelerin çoğunun biyolojik çalışmalar, fare ve sıçan gibi hayvan modellerinde doku hasat gerektirir. Non-spermatojenik (Leydig, sertoli, miyeloid ve epitel hücreleri) ve spermatogenetik hem (spermatogonium spermatositler, yuvarlak spermatidlerin, spermatidlerin ve sperm yoğuşmalı) - - testis sayıda hücre tiplerini içerir çünkü spermatogenezde katılan biyolojik mekanizmaların çalışmalar izolasyonu gerektiren ve bu farklı hücre tiplerinin zenginleştirme. Bu durumda, testis - - lineer gradyan BSA ile STA-PUT yöntem hücre heterojen bir popülasyonunun ayrılması sağlar. Bireysel hücre tipleri ce göre farklı çökelme hızı ile tortull büyüklüğü ve farklı hücre tipleri için zenginleştirilmiş fraksiyonlar toplanmış ve daha fazla analizlerde kullanılabilir. STA-PUT yöntem, belirli hücre ayırma yöntemleri ile elde edilebilir, örneğin hücre tipleri son derece saf fraksiyonları, neden etmese de, bu, her bir parça halinde toplam hücrelerin çok daha yüksek bir verim sağlamaktadır (7-8 x 10 8, bir başlangıç ​​hücre popülasyonundan ~ 1 x 10 8 hücre / spermatojenik hücre tipi). Bu yüksek verim yöntem yalnızca uzman cam gerektirir ve bir floresan aktif hücre ayırıcı (FACS) veya elutriatörü gibi özel ekipmana sınırlı erişimi laboratuarları için ideal bir yöntem yapma, herhangi bir soğuk oda veya büyük buzdolabı yapılabilir.

STA-PUT prosedür ideal bir sonuç hücre boyutu ve yoğunluğuna bağlı olarak testis hücrelerinin oldukça fark ayrılıktır. Testis izole hücreler BSA gradyanı ile çöktürülmesi olsa da, hücrelerin birkaç farklı bantları gözlenebilir. Hücrelerin herhangi kümeleri degrade dibine çöker ve diğer fraksiyonların kontamine olmaz eğilimindedir. Biraz daha degrade kadar büyük somatik ve mayozdaki hücreler olacaktır. Uzak degrade kadar hala küçük yuvarlak Spermatidler olacaktır. Degrade üst sperma...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation at JoVE.com

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar.

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K Görüntüleme.  University of Pennsylvania.  STA-PUT yöntem büyüklüğü ve yoğunluğuna bağlı olarak spermatojenik farklı hücre popülasyonlarının ayrılması sağlar. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama&#39;yı Akışı Sitometrinin tarafından

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Gelişim Biyolojisi

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Embriyonik Gelişimi İncelemek için Murin Round Spermatid Enjeksiyon Prosedürü

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Adım özgü Fare spermatidlerin Sıralama'yı Akışı Sitometrinin tarafından

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği