Esta investigación fue apoyada por el NIH subvenciones GM055360 a SLB y U54HD068157 de RGM. JMB fue apoyado por la Subvención de Entrenamiento T32 Genética de la Universidad de Pennsylvania (GM008216).

El protocolo de STA-PUT implica tres etapas: 1) Puesta en marcha de los aparatos y reactivos, 2) Preparación de la suspensión de células de testículos enteros, y 3) la carga de la célula, la sedimentación y la recogida de fracciones. Cuando es realizada por un equipo de dos investigadores, el protocolo de toma ocho horas en promedio. 1. Configuración del Aparato STA-PUT (Figura 1) *** Aparato de STA-PUT debe ser colocado en un refrigerador grande 4 ° C o una habitación fría que también puede acomodar un colector de fracciones, si se prefiere que el método de colección. <ol><li> La noche antes (o al menos unas horas antes) de llevar a cabo el método, lavar todo el equipo (sobre todo el material de vidrio y tubos) y esterilizar con etanol al 70%. Deje equipo seco completamente antes de montar el aparato como se ilustra en la Figura 1. </li><li> Asegure los dos cilindros de 2 L (Figuras 1B y C) y la cámara de carga de células ( <strong&gt; Figura 1A) a la plataforma superior y conectar todo con dos pequeñas piezas de tubo con abrazaderas de tubo. Fijar todos los tubos cerrados. Selle el surtidor en la L cilindro más a la derecha 2. </li><li> Coloque una pequeña barra de agitación en la cámara de carga de células (Figura 1A) y una barra de agitación más grande en el 2 L cilindro más a la izquierda (Figura 1B) que contendrá la BSA 2%. </li><li> Coloque la cámara de sedimentación 2 L en la plataforma (Figura 1D). Coloque el deflector de metal (Figura 1F) directamente en la parte superior de la abertura en la parte inferior de la cámara de sedimentación (Figura 1D). Esto es crítico, ya que el deflector impide agitación con vórtex del líquido y la interrupción del gradiente de células durante la recogida de la fracción. Coloque la tapa en la parte superior de la cámara de sedimentación. </li><li> Después de la aplicación de una muy pequeña cantidad de grasa de vacío a la junta de vidrio esmerilado de la llave de tres vías (Figura 1G), sujetar la llave de paso a la parte inferior de la SEcámara dimentation, conectando las juntas de vidrio esmerilado de la llave de paso y la cámara de sedimentación. </li><li> Conectar la cámara de la celda de carga (Figura 1A) a la salida derecha de la llave de paso con un tubo. Cierre la llave de paso. </li><li> Conecte el tubo de fraccionamiento de la célula a la salida izquierda de la llave de paso. El tubo de fraccionamiento comprende un trozo de tubo con una pipeta Pasteur de vidrio conectado al extremo abierto. Un trozo de tubo de diámetro más pequeño se une al extremo estrecho de la pipeta de vidrio. La pipeta estrecha restringe el flujo de la suspensión de células durante la recolección de fracciones. Fije este pequeño tubo en la parte inferior. </li><li> Preparar 2 L de Krebs (1x) tamponar el día del experimento (Tabla 1). Entonces, preparar 550 ml de 2% de BSA en 1x de Krebs, 550 ml de 4% de BSA en 1x de Krebs, y 50 ml de 0,5% de BSA en 1x de Krebs. Filtrar y dejar enfriar estas soluciones a 4 ° C. </li><li> Verter la solución de BSA al 4% en el cilindro derecho L 2 (Figura 1C) y la BSA 2%solución en la izquierda 2 L de cilindro (Figura 1B). Asegúrese de que no hay grandes burbujas en el tubo que conecta estos cilindros. </li><li> Vierta tampón Krebs en la cámara de carga celular y llenar el tubo que conecta la cámara con la cámara de sedimentación, asegurándome de que no hay burbujas grandes, ya que podrían alterar el gradiente. Exprimir o chasquear la tubería ayuda suavemente para eliminar las burbujas. Asegúrese de que todo el tampón de Krebs es en el tubo y no en la cámara de la celda. </li><li> Permitir que una pequeña cantidad de tampón de Krebs fluya dentro de la cámara de sedimentación y luego drenar casi todo el tampón en el tubo de fraccionamiento de la célula con el fin de llenar el tubo y eliminar cualquier burbuja grande. </li><li> Coloque el colector de fracciones directamente debajo de la cámara de sedimentación. Asegúrese de que todos los tubos de fracción están en su lugar y se cubren con una envoltura de plástico para evitar la contaminación. </li></ol> 2. Aislar las células de espermatogénesis de testículos enteros <ol&gt; <li> Diseccionar testículos de ca 12 ratones adultos (de preferencia por lo menos ocho semanas de edad) y el lugar en tampón Krebs a ​​temperatura ambiente para lavar cualquier material contaminante. Este protocolo está demostrado implica el uso de ratones de laboratorio y fue ejecutado en cumplimiento de los lineamientos de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso Pennsylvania. </li><li> Añadir 45 mg de colagenasa a 50 ml de tampón de Krebs en un tubo cónico de la derecha antes de que la intención de añadir los túbulos seminíferos. Permitir que esta solución se caliente a 33 ° C durante unos pocos minutos. Dividir equitativamente en dos tubos de 50 ml cónicos. </li><li> Decapsulate los testículos en una placa separada que contiene 8 ml de tampón de Krebs, descartando la túnica albugínea y la liberación de los túbulos seminíferos. La túnica albugínea es la membrana delgada que rodea los túbulos seminíferos. Los túbulos deben separarse fácilmente de la túnica albugínea. Para ello, realizará una incisión en la túnica albugínea, mantenga esta membrana con un pair de fórceps, y empujar los túbulos fuera y lejos de la membrana con otro par de pinzas. </li><li> Añadir 4 ml de tampón de Krebs que contiene los túbulos a cada tubo cónico que contenía 25 ml de solución de colagenasa y se incuba, sacudimiento, a 33 ° C durante 10 min. Al final, los túbulos deben tener una apariencia &quot;spaghetti-como&quot;. </li><li> Permitir que los túbulos se asienten durante ~ 5 min a la parte inferior del tubo. Verter el sobrenadante y lavar 2x en 25 ml de tampón de Krebs (a temperatura ambiente), lo que permite a los túbulos se depositan en el fondo del tubo cada vez. Deja ~ 5 ml de tampón de Krebs en cada tubo. </li><li> Mientras que el lavado, agregar 30 mg de tripsina a 50 ml de tampón de Krebs en un tubo Falcon de la derecha antes de que la intención de añadir los túbulos seminíferos. Permitir que esta solución se caliente a 33 ° C durante unos pocos minutos. Dividir equitativamente en dos tubos de 50 ml cónicos. </li><li> Añadir 25 ml de solución de tripsina a cada uno de los dos tubos que contienen los túbulos. Añadir 3 g de DNasa (1 μg/10ml) a cada tubo para prevenir la células se apelmace. Incubar, temblando, a 33 º C durante 10 min. </li><li> Utilice una amplia pipeta de orificio para agitar la solución que contiene los túbulos, el pipeteado de ellos dentro y fuera de aproximadamente 10x. La solución debe comenzar a parecerse más a una suspensión de células individuales. </li><li> Incubar, temblando, a 33 º C durante otros 10 min. Utilice una amplia pipeta de orificio para dispersar los túbulos en una única suspensión de células, el pipeteado de ellos dentro y fuera de aproximadamente 25x. Si se sigue mostrando una gran cantidad de túbulos o grupos de células, se dispersan más con la pipeta y / o añadir otro 3 mg DNAsa a cada tubo (concentración inicial doble). </li><li> Se filtra la suspensión de células individuales a través de un filtro de células de malla de 100 micras (una para cada tubo de 30 ml de suspensión de células). Combine las suspensiones celulares y contar el número total de células (debe ser entre 7-8 x 10 8 células). EL *** NO coloque más de 800 millones de células en el gradiente. </li><li> Basándose en el recuento de células obtenida en la etapa 2.10, sedimentar el parámetro adecuadoIATE volumen de las células filtradas a 450 rcf durante 5 min y se lava con 30 ml de tampón de Krebs. Repita. *** Por lo general, 22 testículos producirán más de 800 millones de células, pero no cargue más de este número de células. </li><li> Resuspender cuidadosamente las células en 25 ml de 0,5% de BSA que contiene entre 2,5 y 5 mg de ADNasa (dependiendo del grado de aglutinación de células) sin crear burbujas. Asegúrese de que las células no se agrupan. Se filtra la suspensión de células individuales a través de un filtro de células de malla de 100 micras. Las células están ahora listos para cargar. Mezclar bien antes de la carga invirtiendo el tubo varias veces. </li></ol> 3. Móvil Carga y Sedimentación <ol><li> Asegúrese de que la llave de paso está cerrado, pero en la posición que permita que el líquido fluya desde la cámara de la celda (Figura 1A) en la cámara de sedimentación (Figura 1D). </li><li> Gire ambas placas barra de agitación a una temperatura baja (aproximadamente 70 rpm) para permitir que las barras de agitación se mueven sin cesar, pero lentamente. </li><li> Se vierte la suspensión de células en la cámara celular (Figura 1A) y abrir la llave de paso de modo que las células fluyen lentamente en la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 ml / min (Figura 1D). Cierre la llave de paso. Tasa de flujo puede determinarse mediante el marcado de intervalos de volumen en la cámara de sedimentación. </li><li> Vierta 5 ml de solución de BSA al 0,5% en la cámara celular y drenar en la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 ml / min. Cierre la llave de paso. Este paso se lavan las células fuera de la cámara de la celda. Repetir 4x. </li><li> Preparar el gradiente: Abra las abrazaderas entre la cámara de la celda (Figura 1A) y los dos cilindros 2 L (Figura 1B y C), y comenzar a drenar el líquido en la cámara de sedimentación a una velocidad de 40 ml / min (Figura 1D) inmediatamente. Ajuste la velocidad de flujo por lo que toma aproximadamente 20 a 30 min para cargar el gradiente de BSA en la cámara de sedimentación. Una capa delgada, sin molestias de las células que está encima de laBSA gradiente debe ser visible. Una vez que la mayor parte de la BSA se carga, cierre la llave de paso y girar a la posición que va a permitir que el líquido salga de la cámara de sedimentación en el tubo de fraccionamiento. </li><li> Apague las placas revuelo. </li><li> Permitir que las células se separen por sedimentación durante una hora y 45 minutos. NO MOLESTAR EL APARATO DURANTE ESTE TIEMPO. Cualquier agitación mecánica podría perturbar el gradiente. </li></ol> 4. Fraccionamiento y Análisis de las fracciones *** A medida que realiza los pasos siguientes, tenga cuidado de no alterar el gradiente. Si se altera el gradiente de BSA, el procedimiento no va a funcionar! <ol><li> Una vez que las células hayan sedimentado, escurrir lentamente 50 ml de la cámara de sedimentación en un tubo cónico de 50 ml y reservar. Esta fracción contiene generalmente grupos no deseados de células y los desechos. </li><li> Fije el tubo de la fracción con el colector de fracciones. *** También es posible recoger las fracciones a mano si un Colle fracciónHéctor no está disponible. </li><li> Reunir las fracciones: Ajuste el caudal con la llave de paso de modo que 10 ml (llenado un tubo de recogida) se recogieron cada 45 seg. </li><li> Tape los tubos de recogida de fracción y girar durante 5 minutos a 450 RCF a 4 ° C. Verter el sobrenadante con cuidado, volver a suspender las células en el líquido restante y mantener las células en hielo. </li><li> Una vez recogidas todas las fracciones, analizar microscópicamente las fracciones de diferentes poblaciones de células. Diferentes tipos de células se pueden distinguir basándose en el tamaño celular y la morfología nuclear 8,15. La Figura 2 ilustra los resultados representativos &quot;&quot; para las tres fracciones reunidas que están enriquecidas en células y espermatogonias (a) somáticas y meióticas, (B), y espermátidas redondas (c) el alargamiento y la condensación espermátidas. <ul><li> Tipo A espermatogonias son 12-14μm ca. de diámetro y tienen núcleos redondos que son homogéneos en la composición de la cromatina. </li><li> Tipo B espermatogonias, que 8-9μm ca. de diámetro y han round núcleos que muestran la heterocromatina más densa a lo largo de la periferia nuclear. </li><li> Espermatocitos Pre-leptotene son 7.5-8.2μm ca. de diámetro, tienen menos citoplasma de espermatogonias tipo B, y tienen núcleos que se parecen a los de tipo B espermatogonias. </li><li> Espermatocitos primarios Leptoteno son 8-10 micras aprox. de diámetro y tienen núcleos que parecen similares a los de espermatocitos de pre-leptotene, pero parecen aumentar de peso cromatina más densa en la membrana nuclear. </li><li> Zygotene espermatocitos primarios son 10-12 micras aprox. de diámetro y tienen núcleos que parecen similares a los de los espermatocitos primarios leptotene. </li><li> Pachytene son en cualquier lugar 12 a 18 micras aprox. de diámetro y consisten en un borde delgado de citoplasma que rodea a un núcleo grande. Más grumos de cromatina densa se pueden ver en el núcleo. </li><li> Espermátidas redondas son 10 m aprox. de diámetro y tienen un núcleo redondo con un chromocenter densamente-tinción en el medio. </li><li> Residualcuerpos son ~ 6,5 m de diámetro, son redondos, y carecen de un núcleo. </li><li> Alargándose espermátidas y condensación son similares en tamaño a redondear espermátidas, pero tienen un núcleo en forma de hoz único. </li></ul><ol><li> Comience con la fracción 15 y analizar cada cinco fracciones de hasta 85. Por lo general, las fracciones inferiores a 15 serán demasiado mezclados y grumoso, y las fracciones superiores a 85 contienen pocos o ningún células utilizables. </li><li> Para analizar una fracción, tomar 5UL de líquido desde el tubo de recogida de la fracción (una vez que las células se han resuspendido después de la centrifugación) y añadir a 5UL de 8% de formaldehído en tampón de Krebs. Permita que las células fijadas para sentarse a temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Añadir 5 ul de 0,1% de Triton y DAPI (5 μ / ml de tampón de Krebs) a las células fijas. Permita que las células en reposo a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Ponga 10 l de la solución resultante en un portaobjetos, cubra con un cubreobjetos, y analizar con un microscopio de fluorescencia para determinar la pureza de cada fracción. </li><li> Se combinan las fracciones que son similares en tamaño y morfología nuclear (véase &quot;Los resultados representativos&quot;) para crear las siguientes poblaciones de células: células diploides meióticos y somáticos, espermátidas redondas y condensación / alargándose espermátidas. </li></ol></li></ol>

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	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este protocolo está demostrado implica el uso de ratones de laboratorio y fue ejecutado en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y organismos reguladores. Los animales utilizados en este protocolo se mantienen bajo la guía y la aprobación de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Pennsylvania (protocolo de IACUC # 804284).

Los que estudian la espermatogénesis se basan en modelos animales para muestras de células de espermatogénesis, como sistema fiable de cultivo celular todavía no existe para generar todos los tipos celulares de espermatogénesis 3. Aunque las células de espermatogénesis se recogen fácilmente de testículos enteros, sólo una población mixta resultante. Esto plantea un problema para aquellos que desean estudiar los subtipos específicos de estas células, como las células meióticas, espermátidas red...

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos 1. Brevemente, el vástago-como espermatogonias que residen cerca del epitelio de la brecha de los túbulos seminíferos y diferenciarse en espermatocitos, que luego se someten a divisiones meióticas. Después de la meiosis es completa, las células haploides resultantes, o espermátidas redondas, se someten a la espermiogénesis, un proceso de diferenciación que implica el derramamiento de citoplasma y compactación del núcleo. Espermátidas desarrollan gradualmente un flagelo y se someten a la elongación y la condensación del núcleo, produciendo alargándose y luego condensación espermátidas, respectivamente. Los productos finales son los espermatozoides, que son liberados en el lumen del túbulo seminífero y en última instancia en el epidídimo donde maduran más. Debido a que el proceso de la espermatogénesis depende de las condiciones hormonales y moleculares especiales enlos testículos, un sistema fiable de cultivo in vitro para todo el proceso de la espermatogénesis todavía no se ha desarrollado 2,3. Los métodos de cultivo se han desarrollado para la creación de &quot;células similares a las células germinales primordiales&quot; y &quot;células-spermatid como redondas&quot; haploides a partir de células madre, pero estos métodos no son capaces de generar un gran número de estas células y dejar de producir células espermatogénica más tarde tipos 4,5. Afortunadamente, los tipos de células de espermatogénesis difieren significativamente en tamaño, lo que permite una suspensión de una sola célula obtenida de testículos enteros para ser separadas con un gradiente líquido. El método STA-PUT, se ha demostrado aquí, utiliza un gradiente lineal BSA y simple de sedimentación para separar las células de espermatogénesis en función del tamaño y la masa de 6-9. El método STA-PUT tiene varias ventajas con respecto a los otros dos métodos más utilizados para separar los tipos de células de espermatogénesis: FACS y decantación 10-13. El aparato STA-PUT requiere onlY varias piezas de cristalería especializada reunieron en una habitación fría o un refrigerador grande. Por lo tanto, es menos caro que el uso de un clasificador de células o un elutriador. El método STA-PUT produce mayores cantidades de células por tipo de célula y los testículos que puede ser ordenada por FACS en un plazo de tiempo similar, aunque la pureza de cada población celular no es tan alta como los obtenidos con FACS 11. Clasificación de células utilizando perlas magnéticas (magnética clasificación de células activadas, MACS) se ha empleado recientemente con éxito para el enriquecimiento de las espermatogonias de una población de células testiculares mixto, pero en este momento no aptos para separar espermatocitos o espermátidas debido a la falta de conocimiento de la superficie apropiada marcadores 14. Una ventaja adicional del método STA-PUT sobre FACS o MACS es la capacidad de aislar las células viables adecuadas para cultivo posterior, ya que, en contraste con la mayoría de los protocolos de FACS, que no requiere ningún ADN o otros tipos de tinción. Para los estudios que requieren lrendimientos arge de tipos de células de espermatogénesis en el ~ 90% de pureza, el STA-PUT es un método ideal.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td><td>Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Autoclave/filter and store at 4 &amp;deg;C for several months.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolve 4.24 g NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (~37%)</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLE 2: EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete STA-PUT apparatus</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td><td>Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m mesh filter</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Mouse dissection tools</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Need approximately 100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>Microscope slides, cover glass</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Fluorescent Microscope</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos. Actualmente, no existe un sistema de cultivo celular fiable que permite la diferenciación espermatogénica in vitro, y la mayoría de los estudios biológicos de las células de espermatogénesis requiere la cosecha de tejidos de los modelos animales como el ratón y la rata. Debido a que el testículo contiene numerosos tipos de células - a la vez no espermatogénesis (de Leydig, de Sertoli, mieloides y células epiteliales) y de espermatogénesis (espermatogonias, espermatocitos, espermátidas redondas, condensación espermátidas y espermatozoides) - estudios de los mecanismos biológicos que intervienen en la espermatogénesis requerir el aislamiento y el enriquecimiento de estos diferentes tipos de células. El método STA-PUT permite la separación de una población heterogénea de células - en este caso, de los testículos - a través de un gradiente de BSA lineal. Tipos de células individuales sedimentan con diferente velocidad de sedimentación según la cetamaño LL, y fracciones enriquecidas para diferentes tipos de células pueden ser recogidos y utilizados en otros análisis. Mientras que el método STA-PUT no da lugar a fracciones altamente puras de tipos de células, por ejemplo, como se puede obtener con ciertos métodos de clasificación de células, proporciona un rendimiento mucho más alto del total de células en cada fracción (~ 1 x 10 8 células / tipo de células espermatogénica de una población a partir de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimiento requiere sólo la cristalería especializada y se puede realizar en cualquier habitación fría o un refrigerador grande, por lo que es un método ideal para los laboratorios que tienen acceso limitado a los equipos especializados como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) o elutriador.

El resultado ideal el procedimiento STA-PUT es una separación bastante notable de las células de los testículos basado en el tamaño celular y la densidad. Mientras que las células aisladas de los testículos se sedimentan a través de la gradiente de BSA, varias bandas distintas de células pueden ser observados. Cualquier grupos de células tienden a hundirse hasta el fondo del gradiente y no contaminar las otras fracciones. Un poco más arriba el gradiente será el gran somáticas y células meióticas. Más arri...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K vistas.  University of Pennsylvania.  El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad. 

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimiento de inyección de espermatida redonda murina para estudiar el desarrollo embrionario

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Inyección de espermatida redonda de ratón

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Resumen

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-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

Inyección de espermatida redonda de ratón

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares