מחקר זה נתמך על ידי GM055360 NIH מענקים לSLB וU54HD068157 לRGM. JMB נתמכה על ידי T32 הגנטיקה הדרכה גרנט באוניברסיטת פנסילבניה (GM008216).

פרוטוקול STA-PUT כרוך בשלושה שלבים: 1) הגדרה של המנגנון וחומרים כימיים, 2) הכנה של השעיה תא מכל אשכים, ו3) טעינה סלולרי, שקיעה, ואיסוף שברים. כאשר היא מבוצעת על ידי צוות של שני חוקרים, הפרוטוקול לוקח שמונה שעות בממוצע. 1. הקמת מנגנון STA-PUT (איור 1) *** מנגנון STA-PUT צריך להיות ממוקם במקרר גדול 4 ° C או חדר קר שיכול גם להכיל אספן שבריר, אם שיטה זו של אוסף היא מועדפת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלילה שלפני (או לפחות כמה שעות לפני) שתבצע את השיטה, לשטוף את כל הציוד (בעיקר כלי הזכוכית וצינורות) ולחטא עם 70% אתנול. בואו יבש ציוד לחלוטין לפני הרכבת המנגנון כפי שמודגם באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure שני צילינדרי 2 ליטר (איורים 1B ו-C) ותא העמסת תא ( <strאונג&gt; איור 1 א) לפלטפורמה העליונה ולחבר את כל עם שתי חתיכות קטנות של צינורות עם מהדק צינור. הצמידו כל הצינורות סגורים. חותם את הזרבובית על גליל L ​​ימני ביותר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בר קטן ומערבבים בתא טעינת תא (איור 1 א), ובר גדול ומערבבים בצילינדר L 2 השמאלי ביותר (איור 1) שיכיל BSA 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא שקיעת 2 L על הפלטפורמה (1D איור). הנח לבלבל המתכת (איור 1F) ישירות על גבי הפתח בחלק התחתון של חדר השיקוע (1D איור). זה הוא קריטי, שכן לבלבל מונע vortexing של הנוזל ושיבוש של שיפוע התא במהלך איסוף שברים. מניחים את המכסה על החלק העליון של חדר שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום למפרק זכוכית קרקע של הסתום המשולש (איור 1G), מהדק את ברזלים לעומקו של seקאמרי dimentation, המחבר את מפרקי זכוכית קרקע של ברזלים וחדר שקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התא לתא טעינה (איור 1 א) אל השקע הימני של ברזלים עם צינורות. סגור את ברזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את צינורות חלוקה התא לשקע שמאל של ברזלים. צינורות חלוקה כוללים חתיכת הצינור עם זכוכית פיפטה פסטר מחוברת לסוף הפתוח. חתיכת צינור שעמם קטן יותר מחוברת לקצה הצר של פיפטה מזכוכית. פיפטה הצרה מגבילה את הזרימה של ההשעיה התא באיסוף שברים. הצמד הצינור הקטן הזה בתחתית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 L קרבס (1x) חיץ היום של הניסוי (טבלת 1). לאחר מכן, להכין 550 BSA מיליליטר 2% ב1x קרבס, 550 מיליליטר BSA 4% ב1x קרבס, וארגון ה-BSA 50 מיליליטר 0.5% ב1x קרבס. לסנן ולצנן את הפתרונים הללו ל4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון 4% BSA בצילינדר תקין 2 L (איור 1 ג) וBSA 2%פתרון בצילינדר L 2 שמאלה (איור 1). ודא שאין בועות גדולות בצינור שמחבר את הגלילים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חיץ קרבס לתוך תא טעינת תא ולמלא את צינורות המחברים חדר זה עם חדר שקיעה, כדי לוודא שאין בועות גדולות, כמו אלה יכולים להפריע לשיפוע. לוחץ או מצליף את הצינור בעדינות מסייע להסיר את הבועות. ודא שכל של חיץ קרבס הוא בצינור ולא בתא התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר כמות קטנה של חיץ קרבס לזרום לתוך תא השיקוע ולאחר מכן לנקז כמעט את כל החיץ לתוך צינורות חלוקה תא כדי למלא את הצינור ולהסיר את כל בועות גדולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אספן שבריר ישירות תחת קאמרי שקיעה. ודא שכל צינורות שבריר נמצאים במקום ומכוסה בניילון הנצמד, כדי למנוע זיהום. </li></ol> 2. בידוד תאי Spermatogenic מאשכים שלמים <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אשכים מca 12 עכברים בוגרים (רצוי לפחות שמונה שבועות) ומקום בחיץ קרבס בטמפרטורת חדר כדי לשטוף את כל חומר מזהם. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה והוצא להורג בעמידה בקווים המנחים של אוניברסיטת הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש בפנסילבניה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 45 collagenase מ&quot;ג למיליליטר 50 חיץ קרבס בצינור חרוטי ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapsulate האשכים בצלחת נפרדת המכילה 8 מיליליטר חיץ קרבס, השלכת albuginea Tunica ושחרור tubules seminiferous. Albuginea Tunica הוא הקרום הדק המקיף את tubules seminiferous. Tubules צריך בקלות להתנתק מalbuginea Tunica. כדי לעשות זאת, עושה חתך בalbuginea Tunica, החזק הקרום הזה עם פאיr של מלקחיים, ולדחוף את tubules מתוך ומחוץ לקרום עם זוג נוסף של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מיליליטר חיץ קרבס מכיל את הצינוריות לכל צינור חרוטי המכיל 25 מיליליטר של תמיסת collagenase ודגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסוף, צריך להיות לי tubules מראה &quot;דמוי ספגטי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר tubules להסתפק ~ 5 דקות לחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernatant ולשטוף 2x ב25 מיליליטר חיץ קרבס (בטמפרטורת חדר), המאפשר tubules להתיישב לחלק התחתון של הצינור בכל פעם. השאר ~ 5 מיליליטר חיץ קרבס בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד כביסה, להוסיף 30 טריפסין מ&quot;ג למ&quot;ל 50 חיץ קרבס בצינור בז ממש לפני שאתה מתכוון להוסיף tubules seminiferous. פתרון זה יאפשר לחום עד 33 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. לפצל באופן שווה לשני צינורות 50 חרוטי מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיליליטר פתרון טריפסין לכל אחד משני הצינורות המכילים את הצינוריות. הוסף 3 DNAse מיקרוגרם (μg/10ml 1) על צינור אחד כדי למנוע תאים מהתקבצות. דגירה, טלטולים, ב-C ° 33 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה שעם רחבה כדי להתסיס את התמיסה המכילה צינוריות, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 10x. הפתרון צריך להתחיל להיראות יותר כמו השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה, רועד, ב33 מעלות צלזיוס במשך נוספת 10 דקות. השתמש פיפטה שעם רחבה לפזר את הצינוריות לתוך השעיה תא בודדת, pipetting אותם פנימה והחוצה כ 25x. אם אתה עדיין רואה הרבה צינוריות או גושי תא, לפזר יותר עם פיפטה ו / או להוסיף עוד DNAse 3 מיקרוגרם לצינור אחד (ריכוז כפול ראשוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר (אחד לכל שפופרת של 30 השעיה תא מיליליטר). מערבבים את השעיות התא ולספור את המספר הכולל של תאים (צריך להיות בין 7-8 x 10 8 תאים). *** אין לטעון יותר מ 800,000,000 תאים על גבי השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על ספירת התאים שהושגה בשלב 2.10, גלולה approprנפח iate של תאים מסוננים ב450 RCF למשך 5 דקות ולשטוף עם 30 מיליליטר חיץ קרבס. חזור על פעולה. בדרך כלל *** 22 אשכים יניבו יותר מ 800,000,000 תאים, אבל לא להעמיס יותר ממספר זה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend תאים בזהירות ב25 BSA 0.5% מיליליטר מכיל בין 2.5 ו5 מיקרוגרם DNAse (תלוי במידת התקבצות תא) מבלי ליצור בועות. ודא שתאים לא גוש. סנן את ההשעיה התא בודדת דרך מסננת תא רשת 100 מיקרומטר. התאים מוכנים לטעון עכשיו. מערבבים היטב לפני הטעינה על ידי צינור היפוך כמה פעמים. </li></ol> 3. טוען תא ושקיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי ברזלים סגור, אבל במצב שיאפשר לי נוזל לזרום מהתא לתא (איור 1 א) לתוך תא השיקוע (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שני צלחות בר ומערבב להגדרה נמוכה (כ 70 סל&quot;ד) על מנת לאפשר לברים ומערבבים לנוע ברציפות, אבל לאט לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה התא לתוך תא התא (איור 1 א) ולפתוח את ברזלים כך שהתאים לזרום באיטיות אל תוך חדר שקיעה בשיעור של 10 מיליליטר / דקה (1D איור). סגור את ברזלים. שיעור זרימה ניתן לקבוע על ידי סימון מרווחי נפח בתא השיקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 5 מיליליטר של .0.5% פתרון BSA לתוך תא התא ולנקז לתוך תא השיקוע בשיעור של 10 מיליליטר / דקה. סגור את ברזלים. צעד זה לשטוף את התאים מהתא לתא. חזור על 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השיפוע: פתח את מהדק בין התא לתא (איור 1 א) ושני צילינדרי 2 ליטר (איור 1B ו-C), ולהתחיל לרוקן את הנוזל לתוך תא השיקוע בשיעור של 40 מיליליטר / דקה (איור 1D) באופן מיידי. התאם את קצב הזרימה ולכן זה לוקח בערך 20-30 דקות כדי לטעון את שיפוע BSA לתוך תא השיקוע. שכבה דקה, ללא הפרעה של תאים מונחת על גבישיפוע BSA צריך להיות גלוי. ברגע שרוב BSA נטען, סגור את הברז ופונה לעמדה שתאפשר לניקוז נוזלים מתא שקיעה לתוך צינור חלוקתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את הצלחות ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים למשקעים לשעה אחת ו45 דקות. לא להפריע למכשיר בתקופה זו. כל תסיסה מכאנית יכולה להפריע את השיפוע. </li></ol> 4. חלוקה וניתוח של שברים *** כפי שאתה לבצע את השלבים הבאים, יש להיזהר שלא להפריע את השיפוע. אם שיפוע BSA מופרע, ההליך לא יעבוד! <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי משקעים, לנקז לאט 50 מיליליטר מתא שקיעה לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ומניח בצד. חלק זה מכיל בדרך כלל גושים לא רצויים של תאים ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את צינור החלק לאספן שבריר. *** אפשר גם לאסוף את השברים ביד אם Colle שברירctor אינו זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שברים: התאם את קצב הזרימה עם ברזלים כך ש10 מיליליטר (מילוי צינור איסוף אחד) נאסף כל שניות 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צינורות איסוף שבריר ספין 5 דקות ב450 RCF ב 4 ° C. יוצקים את supernatant בעדינות, resuspend תאים בנוזל שנותר, ולשמור את התאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל השברים נאספים, מיקרוסקופי לנתח את השברים לאוכלוסיות תאים שונים. ניתן להבחין בין סוגי תאים שונים המבוססים על גודל תא ומורפולוגיה גרעינית 8,15. איור 2 מדגים &quot;תוצאות נציג&quot; לשלושת שברים ונקוו שמועשרים לתאים וspermatogonia () גופניים וmeiotic, (ב) spermatids העגול, ו (ג) מתארך ועיבוי spermatids. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד spermatogonia הם ca 12 14μm. קוטרו ויש לי גרעינים עגולים שהם הומוגני בהרכב הכרומטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג B spermatogonia הוא ca 8-9μm. קוטרו ויש לי לפהגרעיני ד המראים heterochromatin צפוף יותר לאורך הפריפריה הגרעינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes טרום leptotene הוא ca 7.5-8.2μm. קוטרו, יש להם פחות מ ציטופלסמה סוג B spermatogonia, ויש להם גרעינים שנראים דומה לאלה בB spermatogonia סוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes העיקרי Leptotene הוא 8-10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes מראש leptotene, אבל נראה שכדי לזכות בהכרומטין צפוף יותר בקרום הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zygotene spermatocytes העיקרי הוא 10-12 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעינים שנראים דומה לאלה של spermatocytes העיקרי leptotene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatocytes Pachytene הם בכל מקום בין 12-18 ca מיקרומטר. קוטר ומורכב של שפה דקה של ציטופלסמה סביב גרעין גדול. יותר גושים של הכרומטין צפוף ניתן לראות בגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatids העגול 10 ca מיקרומטר. בקוטר יש גרעין עגול עם chromocenter צפוף מכתים באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרידיםגופים הם ~ 6.5 מיקרומטר בקוטר, הם עגולים, וחסרי גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> spermatids מתארך והעיבוי דומה בגודלן לעגל spermatids, אבל יש גרעין ייחודי, בצורת מגל. </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם חלק 15 ולנתח כל חמישה שברים עד 85. בדרך כלל, שברים מתחת 15 יהיו מעורבים וגבשושיים מדי, ושברים מעל 85 יכילו כמה לתאים לא שמישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח כל חלק, לקחת 5ul של נוזל מצינור איסוף שבריר (פעם תאים כבר resuspended לאחר צנטריפוגה) ולהוסיף ל5ul של פורמלדהיד 8% בחיץ קרבס. אפשר התאים הקבועים לשבת בטמפרטורת חדר למשך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 5ul של .0.1% טריטון וDAPI (5 μ / מיליליטר חיץ קרבס) לתאים הקבועים. אפשר התאים לשבת בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10 μl של הפתרון שהתקבל לשקופית, מכסה בלהחליק את מכסה, ולנתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את טוהר של כל חלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את השברים הדומים בגודלם ומורפולוגיה גרעינית (ראו &quot;נציג תוצאות&quot;) כדי ליצור האוכלוסיות של תאים הבאים: תאי דיפלואידי meiotic וסומטיים, spermatids העגול, וspermatids עיבוי / מתארך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+Spermatogenesis.">Mammalian Spermatogenesis.</a> Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).</li><li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche.">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006).</li><li>Dores, C., Alpaugh, W., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+in+vitro+culture+to+in+vivo+models+to+study+testis+development+and+spermatogenesis.">From in vitro culture to in vivo models to study testis development and spermatogenesis.</a> Cell Tissue Res. 349, 691-702 (2012).</li><li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells.">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146, 519-532 (2011).</li><li>Easley, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+haploid+spermatogenic+cells.">Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells.</a> Cell Rep. 2, 440-446 (2012).</li><li>Bellve, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation.">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li><li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization.">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li><li>Miller, R. G., Phillips, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+cells+by+velocity+sedimentation.">Separation of cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 73, 191-201 (1969).</li><li>Bastos, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis.">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li><li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells.">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).</li><li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugal+elutriation:+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity.">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell Physiol. 86, 177-189 (1975).</li><li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients.">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li><li>Gassei, K., Ehmcke, J., Schlatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enrichment+of+undifferentiated+GFR+alpha+1++spermatogonia+from+immature+rat+testis+by+magnetic+activated+cell+sorting.">Efficient enrichment of undifferentiated GFR alpha 1+ spermatogonia from immature rat testis by magnetic activated cell sorting.</a> Cell Tissue Res. 337, 177-183 (2009).</li><li>Bellve, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenic+cells+of+the+prepuberal+mouse.+Isolation+and+morphological+characterization.">Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization.</a> J. Cell Biol. 74, 68-85 (1977).</li><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Zhao, M., Shirley, C. R., Mounsey, S., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro,+short-term+culture+method+for+mammalian+haploid+round+spermatids+amenable+for+molecular+manipulation.">An in vitro, short-term culture method for mammalian haploid round spermatids amenable for molecular manipulation.</a> Mol. Reprod. Dev. 79, 19-30 (1002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. פרוטוקול זה שמפגינים כרוך בשימוש בעכברי מעבדה ובוצע בהתאם לכל הנחיות הרלוונטיות, תקנות ורשויות רגולטוריות. בעלי חיים המשמשים בפרוטוקול זה נשמרים תחת הדרכתו ואישור מאוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדי פנסילבניה (פרוטוקול # IACUC 804,284).

אלה שלומדים spermatogenesis להסתמך על מודלים של בעלי חיים לדגימות תאי spermatogenic, כמערכת תרבית תאים אמינה עדיין לא קיימת ליצירה כל סוגי תאי spermatogenic 3. למרות שתאי spermatogenic נאספים בקלות מכל אשכים, רק אוכלוסיית תוצאות מעורבת. זה מהווה בעיה למי שרוצה ללמוד תתי סוגים מסוימים של ת?...

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים 1. בקצרה, הגזע דמוי spermatogonia שמתגורר בסמוך לאפיתל של מתרס אבובית seminiferous ולהתמיין לspermatocytes, אשר לאחר מכן יעבור חטיבות meiotic. לאחר מיוזה היא מוחלטת, וכתוצאה מכך התאים הפלואידים, או spermatids העגול, עוברים spermiogenesis, תהליך בידול המערב את שפיכת הציטופלסמה והדחיסה של הגרעין. Spermatids לפתח בהדרגה השוטון ועובר התארכות והתעבות של הגרעין, הפקת spermatids מתארך ולאחר מכן עיבוי, בהתאמה. מוצרי הקצה הם תאי זרע, המשתחררים ללומן של אבובית seminiferous וסופו של דבר ליותרת האשך שבו הם בוגרים יותר. בגלל התהליך של spermatogenesis מסתמך על תנאים הורמונליים ומולקולריים מיוחדים בהאשכים, מערכת תרבות אמינה במבחנה לכל התהליך של תאי זרע עדיין לא פותחו 2,3. שיטות תרבות פותחו ליצירה &quot;תאי נבט קדמוני דמוי תא&quot; ו &quot;תאים עגולים כמו spermatid-&quot; הפלואידים, מתאי גזע, אך שיטות אלה עדיין לא מסוגלים לייצר כמויות גדולות של תאים אלה ולא מצליחים לייצר תא spermatogenic מאוחר יותר סוגי 4,5. למרבה המזל, סוגי spermatogenic התא שונים באופן משמעותי בגודלם, המאפשר להשעית תא בודד המתקבלת מכל אשכים להיות מופרדים עם שיפוע נוזלי. שיטת STA-PUT, הפגין כאן, משתמשת בשיפוע BSA ליניארי ושקיעה פשוט להפריד תאי spermatogenic מבוסס על גודל והמסה 6-9. יש שיטת STA-PUT מספר יתרונות על פני שתי שיטות נפוצות ביותר האחרות כדי להפריד בין סוגי spermatogenic תא: FACS וelutriation 10-13. מנגנון STA-PUT דורש onlכמה חתיכות y של כלי זכוכית מתמחה התאספו בחדר קר או מקרר גדול. לכן, זה פחות יקר מאשר באמצעות סדרן תא או elutriator. שיטת STA-PUT מניבה כמויות גדולות יותר של תאים לכל סוג תא ואשך מאשר ניתן למיין על ידי FACS במסגרת זמן דומה, אם כי טוהר של כל אוכלוסיית תא הוא לא גבוה כמו אלו שהושגו עם 11 FACS. מיון תא ניצול חרוזים מגנטיים (מיון מגנטי מופעל סלולרי, מחשבי מקינטוש) לאחרונה מועסק בהצלחה להעשרת spermatogonia מאוכלוסיית תאי אשכים מעורבת, אבל זה כרגע לא מתאים להפרדת spermatocytes או spermatids בשל חוסר ידע של שטח מתאים סמני 14. יתרון נוסף של שיטת STA-PUT על FACS או MACS הוא היכולת לבודד תאי קיימא מתאימים לתרבות שלאחר מכן, כי, בניגוד לרוב פרוטוקולי FACS, היא אינה דורשת כל ה-DNA או סוגים אחרים של מכתים. למחקרים שדורשים lתשואות arge של סוגי תאי spermatogenic ב ~ טוהר 90%, STA-PUT היא שיטה אידיאלית.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td><td>Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Autoclave/filter and store at 4 &amp;deg;C for several months.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolve 4.24 g NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (~37%)</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLE 2: EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete STA-PUT apparatus</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td><td>Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m mesh filter</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Mouse dissection tools</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Need approximately 100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>Microscope slides, cover glass</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Fluorescent Microscope</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים. נכון לעכשיו, אין מערכת תרבית תאים אמינה המאפשרת בידול spermatogenic במבחנה, ורוב המחקרים ביולוגיים של תאי spermatogenic דורשים קציר רקמות ממודלים של בעלי חיים כמו העכבר והחולדה. בגלל האשך מכיל סוגים רבים של תאים - גם הלא spermatogenic (יידיג, Sertoli, מיאלואידית, ותאי אפיתל) וspermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, spermatids העגול, עיבוי spermatids ותאי זרע) - מחקרים של המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתאי זרע דורש הבידוד והעשרה של תאים מסוגים שונים. שיטת STA-PUT מאפשרת להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים - במקרה זה, מהאשכים - דרך שיפוע BSA ליניארי. סוגי תאים בודדים משקעים עם מהירות שקיעה שונה בהתאם לספירהגודל ll, והשברים מועשרים לתאים מסוגים שונים יכולים להיות שנאספו ומנוצלים בניתוחים נוספים. בעוד שיטת STA-PUT לא לגרום לשברים טהורים מאוד של סוגי תאים, למשל כמו ניתן להשיג עם שיטות מיון תא מסוימות, הוא מספק תשואה גבוהה בהרבה של תאים הכולל בכל שבריר (~ 1 x 10 8 תאים / סוג spermatogenic תא מאוכלוסייה התחלתי של 7-8 x 10 8 תאים). שיטת תשואה גבוהה זה דורשת רק כלי זכוכית מתמחה ויכולה להתבצע בכל חדר קר או מקרר גדול, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות שיש להם גישה מוגבלת לציוד מיוחד כמו סדרן הקרינה הופעלה תאים (FACS) או elutriator.

התוצאה האידיאלית מהליך STA-PUT היא הפרדה די בולטת של תאים מהאשכים המבוססים על גודל תא וצפיפות. בעוד התאים מבודדים מאשכי סדימנטציה דרך שיפוע BSA, כמה להקות שונות של תאים יכולות להיות שנצפו. כל גושים של תאים נוטים לשקוע בתחתית של השיפוע ולא לזהם את השברים האחרים. עוד קצת במע?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation at JoVE.com

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K Views.  University of Pennsylvania.  שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Developmental Biology

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>הליך הזרקת זרע עגול Murine לחקר התפתחות עוברית

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקת זרע עגולה לעכבר

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה לעכבר

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים