이 작품은 국립 보건원 (NIH R01 AI46435)와 RMRCE (NIH AI065357)에 의해 지원됩니다.

다음 프로토콜은 Sindbis 바이러스 MRE16에 따라 ATS의 생산과 사용을위한 기록됩니다. ATS는 모기 Aedes aegypti 벡터에 GFP를 표현하기 위해 설계되었습니다. alphaviruses의 번호 (Sindbis 바이러스, Chikungunya 바이러스, O&#39;nyong - nyong 바이러스, 서부 에콰인 뇌염 바이러스)의 cDNA 전염성 클론 ATS의 (표 1)로 설계되었는지 현재 사용할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 플라스미드 DNA가 같은 불필요한 재조합 및 바이러스 cDNA의 손실을 방지해야 관할 세균 (Stratagene / 애질런트 테크놀)로 박테리아에서 증폭됩니다. 모든 전염성 클론 plasmids은 결선의 해독에 대한 최종 &#39;전체 길이의 게놈 RNA의 전사와 3 독특한 제한 endonuclease에 대한 바이러스 cDNA의 끝에&#39;이 바로 5 박테리오 파지 T7 또는 SP6 발기인 있습니다. 각 ATS 들어, 사용자는 적절한 박테리오 파지 DNA 의존 RNA 효소와 바이러스 RNA의 게놈의 체외의 해독에 대해 고유한 제한 endonuclease를 사용해야합니다. 1. cDNA 클론에서 감염성 RNA의 생성. <ol><li> 100 μL 반응에서 XhoI 제한 효소 20 단위 (p5&#39;dsMRE16 / GFP) 플라스미드 전염성 클론의 5μg을 Linearize. 37 2 3H에 대해 품어 ° C </li><li> 50 μL RNase가없는 물을 사용하여 스핀 칼럼에서 DNA를 eluting Qiagen QIAprep 스핀 Miniprep 키트 대체 정화 프로토콜을 사용하여 선형 DNA를 정화. 플라스미드 농도는 약 1.0 μg / μL해야합니다. </li><li> RNase가없는 0.2 ML PCR 튜브에 설정 절차에 따라 앰비온 MAXIscript 키트를 사용하여 50 μL 전사 반응은 다음과 같습니다. <ul><li> 22.5 μL RNase 무료 DH 2 O <ul><li> 5.0 μL 선형 DNA 템플릿 (1.0 μg / μL) </li><li> 2.5 μL 10mM ATP </li><li> 2.5 μL 10mM CTP </li><li> 2.5 μL 10mM UTP </li><li> 2.5 μL 1mM GTP </li><li> 2.5 μL 10mM 모자 아날로그 (M 7 G (5 &#39;) PPP (5&#39;) G) </li><li> 5.0 μL 10X 전송 버퍼 </li><li> 5.0 μL T7 또는 SP6 효소 믹스 </li></ul></li><li> 50.0 μL 총 </li></ul></li><li> 37 1 시간에 대한 전사 반응을 품어 ° C. 부화 후, 반응은 BHK - 21 세포의 electroporation을 위해 즉시 사용해야합니다. electroporation에 대한 BHK - 21 세포의 준비 배양 전사 반응 동안에 시작한다. </li></ol> 2. 감염성 RNA의 바이러스의 생성 <ol><li> 합류 150cm 2 (T - 150) ATS 당 플라스크 BHK - 21 세포이 70-80%을 Trypsinize. </li><li> 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 모든 세포를 전송합니다. </li><li> 2,000 rpm으로 원심 분리하여 펠렛은 전지, 10 분, 기존의 탁상 원심 분리기에서 4 ° C. </li><li> 없이 멸균 PBS에 Resuspend 세포 MG + + 및 CA + +. 세포는 PBS로 세 번 씻어 때까지 단계 2.3 및 2.4를 반복합니다. </li><li> 10% FBS를 포함하는 pelleted 전지 0.5 ML의 멤를 Resuspend. </li><li> 10% FBS와 90 μL 멤 10 μL 세포를 희석하고 hemacytometer 기대. 경우 멤 10 % FBS를 포함하는과 2.5-12.5 X 10 7 셀 / ML 필요, 희석 세포. </li><li> 얼음 차가운 0.2 cm의 electroporation의 쿠베트하기 위해, 400 μL 세포 현탁액 20 μL 전사 반응을 추가합니다. 쿠베트에서 결로를 닦아주십시오. </li><li> 450V, 1200Ω, 150 μF : 두 번 쿠베트을 펄스. 우리는 전기 세포 조작하는 사람, 하버드 장치 모델 ECM630을 사용합니다. </li><li> 10% FBS 5 ML의 멤을 포함 25cm 두 조직 문화 플라스크에 쿠베트의 전체 내용을 넣으십시오. </li><li> 5% CO 2와 37C에 품어 플라스크 (S). </li><li> 여기 파장 = 460-490 nm의, 발광 파장 = 510-550 nm의, 또는 필터를 dsRed : 적절한 필터 설정 (예 : GFP 필터를 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 일상적인 감염을 모니터링 여기 파장은 460-560 nm의 =, 발광 파장 =&gt; 590 NM). </li><li> 형광은 감염이 합류 및 / 또는 CPE는 술병을 통해 볼 수 있습니다 제시하면, -80에서 필요하고, 매장으로 나누어지는를 술병의 내용을 수집 30% FBS를 추가 ° C. 원하는 경우, 세포 lysates은 (2000 RPM, 10 분, 4 ° C) FBS를 추가하기 전에. 원심 분리에 의해 삭제 될 수 있습니다 </li><li> 이후 혈액 먹이 assays에 대한 바이러스 titer를 증가 세포의 새 술병을 통해 적어도 한 번 통과 바이러스. </li></ol> 모기 3. 당 OS 감염 <ol><li> 혈액 (보통 드 fibrinated 양의 혈액을 구입) 및 단계를 2.13에서 셀 - 문화 파생 바이러스 서스펜션을 함께 섞는다. 혈액 식사 최종 바이러스 titer는 일반적으로 ~ 1x10 7 플라크 형성 단위 (pfu) / 모기 midgut의 효율적인 감염에 대해 ML해야합니다. , 충혈시키다 5&#39; - 삼인산 (ATP)를 아데노신에 모기를 자극하는 0.02M의 최종 농도에 추가할 수 있습니다. </li><li> 모기 수 있습니다인공 피더에서 효율적으로 혈액 공급하도록 자극하는 감염 전에 물과 설탕을 박탈해야합니다. 빈곤 기간는 이전에 다음 ID로 사망률을 최소화하기 위해 설립해야합니다. 타임즈는, 모기 종, 기점으로 insectary 등 습도에 따라 이전에 피드에 설탕 24, 물 12h 제거됩니다. 이 프로토콜은 순환 37 ° C의 물로 물 외피 유리 feeders17를 사용합니다. 돼지의 창자 막 (즉, 철저하게 대부분의 식료품 가게에서 구할 수 케이싱 소시지 씻은)은 피더와 식사가 의회에 pipetted이다의 입을 통해 배치됩니다. 다양한 디자인, 세포막 및 프로토콜은 다른 벡터 유형에 사용할 수 있습니다. </li><li> 모기는 피가 부풀어 오른만이 모기를 선택 정렬됩니다. 부풀어 오른 모기가 상단에 organdy와 판지 상자로 전송하고 모기가 28 incubated 아르 ° C, GFP 발현에 대한 처리까지 75-80% 상대 습도. </li></ol> 4. 모기 Intrathoracic 접종 Intrathoracic 접종은 arthropod들을 감염에 대한 대안 방법입니다. midgut을 통해 보급이 필요하지 않을 때이 방법을 사용합니다. (방법은 아래 설명하지만 기술이 영상 실험에서 표시되지 않습니다.) <ol><li> 모기 (5-10)의 소수가 플라스틱 개최 튜브로 잡고 케이지에서 aspirated입니다. 15 분 모기를 진정 ° C가 밀봉 보관 튜브는 4 배치됩니다. </li><li> 2 5 모기는 얼음에서 휴식을 유리 페트리 접시에 관에서 흘렸어 것입니다. 사용하지 않거나 모기가 이동하기 시작하면 페트리 접시에 뚜껑을 놓으십시오. 모기의 취급 중에주의가 조작되는 모기의 수를 추적하는 계산 유지로 이동해야합니다. 모기가 진정 테이블에 쏟았 있기 때문에, 총수은 실험실 카운터에 기록됩니다. </li><li> 바늘은 Nanoject 특정 유리와 바늘 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 용해하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 69 NL inoculum의 제공을위한 제조 업체의 지침에 따라 Nanoject II microinjector를 설치합니다. 바늘이 손상되지 않도록 바늘에 inoculum를 그릴 때주의가 행사해야합니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여 모기의 흉부에 바늘을 삽입하고 접종에 대한 Nanoject을 활성화해야합니다. 바늘 완전히 모기를 침투하고 모기의 후속 죽음에 결과 반대편을 종료하지 않도록 모기 inoculating 때주의가 행사해야합니다. inoculum가 바늘에서 제거하기 전에 입력 있는지 확인하기 위해 각 모기를 확인합니다. </li><li> 모기가 여전히 바늘에 찔려 죽은 상태에서 접종 후, 다른 모든 시간에 커튼이나 코르크 스토퍼로 연결되는 측면에 작은 구멍을 통해 종이를 들고 카톤에 놓으십시오. </li><li> 모기는 신중하게 카톤 (최대 약 50 카톤 당), 테이프 모기의 실수로 공개를 방지하기 위해 자리에 코르크로 주사하고 배치했으면. 28 ° C 80 % 상대 습도에서 insectary에서 추가 부화하기 전에 보안 지주 빈의 종이팩를 놓습니다. </li></ol> 5. 모기 감시 감염 <ol><li> ° C 약 15 분 동안 모기를 무력화하기 위해 4 종이 들고 카톤를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경에 사용에 맞게 감기 테이블에 모기의 작은 숫자 (한 번에 50-10) 전송합니다. </li><li> 형광의 유무에 따라 모기를 검사하고 정렬합니다. 또한, 형광 강도는 감염의 프록시 양적 측정으로 사용할 수 있습니다. 이러한 midguts, 침샘 등 모기 조직은 지방 시체는 형광에 대한 해부하고 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 적절한 경우, 감염된 모기의 부화를 계속 종이 판지 상자로 선정 모기를 반환합니다. </li></ol> 6. 전송 어세이 (바이러스 전송을 시연하기 위해 강제 타액의 분비) <ol><li> 피드 이전 24 H 설탕 소스의 모기를 박탈. </li><li> 다리와 날개를 제거 </li><li> , 온수 뽑아 한 끝에 냈다되었습니다 50 μL 모세관하려면 Cargille B 타입의 집중 오일이나 10% 혈청 - 자당 솔루션의 3-5 μL를 추가합니다. </li><li> 튜브에 코를 넣습니다. 기름을 사용하는 경우, 타액의 방울은 코에서 스며 나오다을 볼 수 있습니다. 1 % pilocarbine의 PBS에서 솔루션과 0.1 % 트윈 80 μL 하나는 자극에 대한 흉부에 적용할 수 있습니다. </li><li> 60~90분 후, 모기를 제거하고 필요한 경우 바이러스 격리를 위해 저장합니다. </li><li> 100 μL 20% FBS - PBS를 포함하는 튜브에 원심 분리하여 관에서 솔루션을 제거합니다. </li><li> 다음 무균 필터 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 inoculum 및 교양 세포를 감염하는 필터링된 inoculum을 사용합니다. </li></ol> BIOSAFETY 참고 :이 프로토콜 설명, 생성 파악하고, 감염된 모기를 모니터링하는 방법. 귀하의 시설 (감기 테이블, 억제 시설 등 IE)와 IBC 승인에 따라, 당신은 탈출을 방지하기 위해 날개와 다리를 제거 후 그들을 조사하기 위해 제한될 수 있습니다. SINV 기반 ATS의 생성 및 BSL2 환경에서 사용할 수 있습니다. ATS의 사용은 이러한 Chikungunya 바이러 스나 서부 에콰인 뇌염 바이러스와 같은 다른 alphaviruses에 기초가 BSL3 시설을 필요합니다. 7. 대표 결과 ATS 5&#39;dsMRE16 / GFP를 사용하여 마커 유전자 (GFP)의 표현의 개요는 그림 1에 표시됩니다. BHK - 21 C6/36 (Aedes albopictus) 세포에 GFP 표현은 감염의 0.01 다중성에서 5&#39;dsMRE16 / GFP 바이러스와 세포의 감염 후 특정 시간에 그림 2에 표시됩니다. 그림 3은 바이러스가 infective 혈액 식사를 통해 제공되는 모기에 alphavirus 및 ATS 바이러스 감염의 개요입니다. 그림 4는 Aedes aegypti의 경구 감염 다음 ATS 바이러스 ~ 10 7 pfu / ML과 혈액 식사의 준비를 보여줍니다. epifluorescence 현미경 (그림 5)을 사용하여 감염된 모기와 10 일 게시물 감염에서 선택된 신체 부위의 전신보기. GFP의 감지 및 각 형광 마커 유전자 (그림 6)을 표현 ATS 5&#39;dsMRE16 바이러스 감염에 따라 감염된 모기 midguts에 dsRED. 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS 바이러스 (그림 7)에 감염된 모기를 사용하여 전송 분석. 표 1. ATS는 현재 모기의 유전자 표현을위한 공학의. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alphavirus </td><td> ATS </td><td> 모기 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> Sindbis 바이러스 </td><td> TE / 3&#39;2J 및 TE / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16과 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. AEG ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chikungunya 바이러스 </td><td> 3&#39;dsCHIKV과 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong nyong 바이러스 </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> 아노 펠 레스 gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 웨스턴 에콰인 뇌염 바이러스 </td><td> 5&#39;dsWEEV. 맥밀런 </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft 외., 발표되지 않은 </td></tr></tbody></table> 표 2. 모기의 유전자 표현을위한 ATS의를 사용하는 장점 / 단점. <table border="1"><tbody><tr><td> 장점 : </td></tr><tr><td> 높은 titer 바이러스의 급속한 생산 </td></tr><tr><td> 광범위한 호스트 범위 (SINV) </td></tr><tr><td> 높은 RNA 복제 속도 </td></tr><tr><td> 하이 transgene 발현 수준 </td></tr><tr><td> 조작 유전자의 상대 용이성 </td></tr><tr><td> 곤충의 안정적이고 지속적인 유전자 발현 </td></tr><tr><td> 곤충의 최소 병리학 </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 단점 : </td></tr><tr><td> 척추 세포의 단기 표현 모드 </td></tr><tr><td> 척추 세포에 강한 cytopathic 효과 </td></tr><tr><td> 유전자 크기 제한 (&lt;1Kb, 이상) </td></tr><tr><td> 일부 alphaviruses는 BSL3 봉쇄를 필요로 </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : p5&#39;dsMRE / GFP GFP SINV 표현을 사용하여 BHK - 21 세포에서 ATS 바이러스 생산의 개요. 시험 관내 전사에 따라 게놈 RNA ATS는 바이러스가 구출됩니다 BHK - 21 세포에 electroporated입니다. ATS 바이러스 그러면 모기를 감염하는 데 사용할 수 있습니다. SGP는 = subgenomic 발기인. 세 ATS RNA 종은 셀에 베꼈는데 아르혹시, 게놈, subgenomic 1 subgenomic이 RNAS. C (capsid)는, E2와 E1 glycoproteins은 전염성 바이러스를 생성하는 ATS 게놈과 함께 조립하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP 바이러스에 감염 모기에 다음과 같은 GFP (C6/36)의 표현이 세포. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 바이러스 전송로 이어지는 모기에 ATS 바이러스 감염의 개요. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 : ATS SINV infective 혈액 식사하는 모기를 노출하여 5&#39;dsMRE16 감염. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5 : 10 일 게시물 감염에서 ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP 감염. GFP의 몸 전체 검색은 바이러스가 midgut 탈출 및 보조 조직에 전파했다 보여줍니다. 그림은 또한 전파 감염을 나타내는 것입니다 선택된 신체 부위에서 GFP 발현을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6 : ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP 및 5&#39;dsMRE16 / 특정 시간 이후의 감염에 midguts의 dsRED 감염. Midguts은 일반적으로 나중에 시간 후 감염의 사후 midgut에 걸쳐 펼쳐지는 혈액 식사가 포함된 바이러스를 섭취 후 초기 감염의 뚜렷한 foci 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7 : 8 일 게시 감염 빠르면 ATS 5&#39;dsMRE16 / 모기 타액에서 GFP의 탐지. 분석은 ATS 바이러스 및 5&#39;dsMRE16 / GFP 바이러스가 안정적으로 모기에 외부 잠복기에 걸쳐 GFP를 표현할 수있는 것을 보여줍니다의 전송을 표시하도록 설계되었습니다. 왼쪽 패널은 모세관에 침 모기를 보여줍니다, 중앙 패널은 일일 오른쪽 패널 3 일간 게시 감염에서 타액 감염 C6/36 세포를 보여줍니다.

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti.">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li><li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis.">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li><li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법은 연구자 모기 세포 배양 및 성인 여성 모기에 alphavirus의 감염을 따라 수 있도록 여기를 발표했다. ATS 바이러스를 사용하는 장점과 단점은 표 2에 요약됩니다. ATS 전염성 복제는 유전자에 고이을 표현하는 조작 수 있으며, 단일 사슬 항체, RNAi의 진압, 내생 유전자를 대상으로 안티 센스 RNAS, 그리고 프로 apoptotic 단백질을 표현하는 데 사용되었습니다. 기자가 사용하지 않을 경우,이 방법의 영상 부분은 관련이 없습니다. 그러나, 같은 프로토콜 많은 ATS 바이러스 구조, 전파하고, 모기가 감염 필요합니다. alphavirus의 transducing 시스템에 삽입하면 제한 transgene의 최대한의 크기가 있습니다. 크기 제약은 ATS를 생성하는 데 사용되는 부모의 변형에 따라 다르지만 같은 반딧불 루시페라제 같은 큰 기자 유전자가 모기에 사용하기 위해 ATS 건설에 사용되고 있지만 1킬로바이트에 대해 보통입니다. 바이러스학 배경의 겸손한 양의 연구소는 이러한 프로토콜을 다음과 ATS의를 사용할 수 있어야합니다. 연구 실험실의 숫자가 이미 SINV 기반 ATS의를 사용하여 서명한.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alphavirus transducing 시스템 (ATSs)는 감염 동안 유전자의 관심 (고이)를 표현하는 중요한 도구입니다. ATSs은 모기가 전파되는 RNA 바이러스의 cDNA 클론 (; 가족 Togaviridae 속의 Alphavirus)에서 파생됩니다. Alphavirus의 속은 약 30 다른 모기 매개 바이러스 종류가 포함되어 있습니다. Alphaviruses은 싸여 바이러스이며 단일 좌초 RNA의 genomes을 (~ 11.7 KB)이 포함되어 있습니다. Alphaviruses은 바이러스의 게놈과 성숙의 encapsidation에 필요한 바이러스의 구조 단백질을 인코딩 subgenomic mRNA를 고쳐 쓰다. Alphaviruses은 척추 세포에서 일반적으로 높은 lytic 있지만, 지속적으로 최소한의 cytopathology로 민감한 모기의 세포를 감염. 이러한 특성은 그들에게 모기 벡터의 유전자 표현을위한 훌륭한 도구를합니다. 사용중인 가장 일반적인 ATSs는 Sindbis 바이러스 (SINV)에서 파생됩니다. SINV의 광범위한 종류의 tropism는 곤충 조류, 그리고 포유류의 cells8의 감염 수 있습니다. 그러나, ATSs 잘 9,10,20 다른 alphaviruses에서 파생되었습니다. 외국 유전자 발현은 추가 바이러스성 subgenomic RNA의 개시 사이트 또는 발기인의 삽입에 의해 가능하게됩니다. 외인성 유전자 순서는 바이러스 유전자 구조 5 &#39;위치에있는 ATSs는 곤충의 안정적인 단백질 발현을 위해 사용됩니다. 유전자 시퀀스 구조 유전자 3 &#39;위치에있는 ATSs는, 곤충에 유전자의 RNAi과 침묵 표현을 트리거하는 데 사용됩니다. ATSs는 벡터 병원체 상호 작용, 바이러스 복제의 분자 세부 사항 및 유지 보수 전염성 사이클 3,4,11,19,21을 이해하기위한 귀중한 도구가 될 입증합니다. 특히, 형광 및 발광 생물 기자의 표현은 벡터 및 바이러스 전송 5,14-16,18의 바이러스 감염을 추적 수단되었습니다. 또한, 벡터 면역 반응은 GFP 2,9을 표현하는 설계 SINV의 두 변종을 사용하여 설명하고 있습니다. 여기, 우리는 cDNA 클론 감염에서 형광 기자 (GFP)이있는 SINV의 생산을위한 방법을 제시한다. 전염성, 전체 길이 RNA는 선형 cDNA 클론으로부터 베꼈는데 있습니다. 감염성 RNA는 electroporation에 의해 허용 대상 세포에 도입입니다. Transfected 세포는 고이을 표현하는 전염성 바이러스 입자를 생성합니다. 수확 바이러스는 여기에 설명된 모기, 또는 다른 호스트 종 (이하 표시되지 않음) 감염하는 데 사용됩니다. 벡터 능력은 midgut 외부 형광을 감지하거나 모니터링 바이러스 전송 7 평가입니다. 고이가 세포 배양에 걸쳐, 모기에서 노출 모기, 바이러스 전송에 감염, 전파의 속도의 결정에 대한 바이러스 확산의 편리 추정 가능하며 벡터 능력의 급속한 게이지를 제공하는 등 형광등 기자 중 하나를 사용하십시오.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K 조회수.  Colorado State University. 체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.

비디오: Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

CRISPR/Cas9와 재조합 조류 Herpesvirus 벡터 생성 편집 진

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...