Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH R01 AI46435) y el RMRCE (NIH AI065357).

El protocolo siguiente se escribe para la producción y el uso de un ATS basado en el virus Sindbis MRE16. El ATS ha sido diseñado para expresar las buenas prácticas agrarias en el mosquito vector Aedes aegypti. cDNA clones infecciosos de una serie de alfavirus (virus Sindbis, virus Chikungunya, O&#39;nyong-nyong virus, el virus de la encefalitis equina del oeste) se encuentran actualmente disponibles que han sido diseñados como ATS (Tabla 1). Para obtener los mejores resultados de ADN plásmido se amplifica en las bacterias tales como bacterias QUE competentes (Stratagene / Agilent Technologies) para evitar la recombinación no deseados y la pérdida del ADNc viral. Todos los plásmidos clon infeccioso tienen un bacteriófago T7 o SP6 promotor en la inmediata extremo 5 &#39;del ADNc viral para la transcripción de ARN genómico de longitud completa y una endonucleasa de restricción única en el extremo 3&#39; de la transcripción de la escorrentía. Para cada ATS, los usuarios deben utilizar la polimerasa del bacteriófago ADN dependiente de ARN apropiada y endonucleasa de restricción única para la transcripción in vitro del genoma viral ARN. 1. Generación de ARN Infecciosas del clon de cDNA. <ol><li> Linealizar la 5μg del clon infeccioso plásmido (p5&#39;dsMRE16 / GFP) con 20 unidades de enzima de restricción XhoI en una reacción de 100 mL. Incubar durante 2-3h a 37 ° C </li><li> Purificar el ADN lineal utilizando Qiagen QIAprep Spin Miniprep protocolo del kit de purificación alternativo, liberador de ADN de la columna de giro con 50 l de RNasa libre de agua. Concentración de plásmido debe ser de aproximadamente 1,0 mg / mL. </li><li> En una RNasa libre de tubo de PCR de 0,2 ml, puesta en marcha una reacción de 50 l de transcripción utilizando Ambion Kit MAXIscript según el protocolo de la siguiente manera. <ul><li> 22,5 l RNasa libre de dH 2 O <ul><li> 5,0 l plantilla de ADN linealizado (1,0 mg / l) </li><li> 2,5 l ATP 10 mM </li><li> 2.5 l 10 mM CTP </li><li> 2,5 l UTP 10 mM </li><li> 2,5 l GTP 1 mM </li><li> 2.5 l 10 mM tapa analógica (m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G) </li><li> 5,0 l de transcripción buffer 10X </li><li> 5,0 l T7 o SP6 mezcla polimerasa </li></ul></li><li> 50,0 Total l </li></ul></li><li> Incubar la reacción de transcripción durante 1 hora a 37 ° C. Después de la incubación, la reacción debe ser utilizado inmediatamente para la electroporación de células BHK-21. Preparación de las células BHK-21 para la electroporación debe comenzar durante la reacción de incubación de la transcripción. </li></ol> 2. Generación de virus de RNA infeccioso <ol><li> Trypsinize dos 70-80% confluentes 150 cm 2 (T-150) frasco de células BHK-21 por ATS. </li><li> La transferencia de todas las células a un tubo de 15 ml de centrífuga cónico. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C en una centrífuga de mesa convencional. </li><li> Resuspender las células en PBS estéril sin Mg + + y Ca + +. Repita los pasos 2.3 y 2.4 hasta que las células se han lavado tres veces con PBS. </li><li> Resuspender las células sedimentadas MEM 0,5 ml que contiene 10% de SFB. </li><li> Diluir 10 ml con 90 células MEM l con 10% de SFB y contar con un hemocitómetro. Si las células es necesario, diluir a 2.5 a 12.5 x 10 7 células / ml con MEM con 10% de SFB. </li><li> A una helada 0,2 cm cubeta de electroporación, añadir 400 l de suspensión celular y 20 l reacción de transcripción. Limpie la condensación de la cubeta. </li><li> El pulso de la cubeta en dos ocasiones: 450V, 1200Ω, 150 mF. Nosotros usamos un manipulador célula electroquímica, Harvard Apparatus modelo ECM630. </li><li> Coloque todo el contenido de la cubeta en una de 25 cm 2 frasco de cultivo de tejido que contiene 5 ml de MEM con 10% de SFB. </li><li> Frasco se incuba (s) a 37 º C con CO2 al 5%. </li><li> Monitor de la infección a diario usando un microscopio de fluorescencia invertido con el conjunto de filtro adecuado (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias filtro: longitud de onda de excitación de 460-490 nm =, la emisión de longitud de onda de 510-550 nm =, o dsRed filtro: longitud de onda de excitación de 460-560 nm =, la emisión de longitud de onda =&gt; 590 nm). </li><li> Cuando fluorescencia sugiere la infección es confluente y / o CPE es visible en todo el frasco, recoger el contenido del frasco, añadir 30% de SFB, alícuota que sea necesario, y guardar a -80 ° C. Si lo desea, lisados ​​de células pueden ser aprobados por centrifugación (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) antes de la adición de FBS. </li><li> El paso del virus al menos una vez a través de un nuevo frasco de las células para aumentar el título del virus para su posterior ensayos se alimentan de sangre. </li></ol> 3. La infección por vía oral de los mosquitos <ol><li> Mezcle la sangre (por lo general compra de fibrinated-sangre de oveja) y el cultivo de células de suspensión derivado del virus desde el paso 2.13. Título del virus en la final de la harina de sangre debe ser normalmente ~ 1x10 7 unidades formadoras de placas (UFP) / ml para la infección del intestino medio eficiente de los mosquitos. Para estimular los mosquitos se llenen, la adenosina 5&#39;-trifosfato (ATP) se pueden agregar a una concentración final de 0,02 M. </li><li> Los mosquitos puedentienen que ser privados de agua y azúcar antes de la infección para estimularlos para alimentar eficientemente la sangre de un alimentador artificial. Duración de la privación deben estar establecidas previamente para minimizar la mortalidad. Veces depende de las especies de mosquitos, la humedad del insectario, etc Como punto de partida, retire las 24 horas de azúcar y agua antes de las 12h a la alimentación. Este protocolo utiliza con camisa de agua de vidrio con feeders17 circulando agua a 37 ° C. Una membrana intestinal porcina (es decir, lavar muy bien embutido disponible en las tiendas de comestibles) se coloca sobre la boca de la alimentación y la comida está contaminada en la cámara. Varios diseños, las membranas y los protocolos están disponibles para los tipos de vectores diferentes. </li><li> Los mosquitos son ordenados para seleccionar sólo a los mosquitos llena de sangre. Mosquitos congestionados son transferidos a una caja de cartón con el organdí en la parte superior y los mosquitos se incuban a 28 ° C, 75-80% de humedad relativa hasta su transformación para la expresión de GFP. </li></ol> 4. La inoculación intratorácica de mosquitos Inoculación intratorácica es un método alternativo para infectar a los artrópodos. Este método se utiliza cuando la difusión a través del intestino medio no es necesario. (Método descrito a continuación, pero la técnica no se muestra en este experimento visual). <ol><li> Un pequeño número de mosquitos (5-10) se aspira a partir de la explotación en jaulas de plástico tubos de mantenimiento. Los tubos sellados explotación se coloca a 4 ° C durante 15 minutos para enfriar los mosquitos. </li><li> 2 5 mosquitos se derrama desde el tubo en una placa de Petri de vidrio que descansa sobre el hielo. Coloque la tapa en la caja de Petri, cuando no esté en uso o si los mosquitos empiezan a moverse. Durante la manipulación de los mosquitos, se debe tener cuidado para contar y realizar un seguimiento de la cantidad de mosquitos manipulados. Ya que los mosquitos se derrama sobre la mesa fría, el número total se registran en las necesidades del laboratorio. </li><li> La aguja se prepara por fusión de los tubos capilares de vidrio con Nanoject específico y un extractor de aguja. </li><li> Configuración de la II Nanoject microinyector según las instrucciones del fabricante para la entrega de 69 nL inóculo. Se debe tener cuidado en la elaboración del inóculo en la aguja de modo que la aguja no esté dañado. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, insertar la aguja en el tórax del mosquito y activar el Nanoject para la inoculación. Se debe tener cuidado cuando la inoculación de mosquitos, para que la aguja no penetre por completo el mosquito y salir del otro lado, lo que resulta en la posterior muerte del mosquito. Compruebe cada mosquito para estar seguro de que el inóculo entró antes de sacarlo de la aguja. </li><li> Después de la inoculación, mientras que el mosquito sigue siendo atravesado por la aguja, colóquelo en una caja de cartón de papel a través de la celebración de un pequeño agujero en el lado que se conecta con un algodón o un tapón de corcho en cualquier otro momento. </li><li> Cuando los mosquitos se han inoculado y se coloca en la caja (hasta aproximadamente el 50 por caja), la cinta con cuidado el tapón en su lugar para evitar la liberación accidental de los mosquitos. Coloque las cajas en un contenedor seguro antes de la celebración de incubación en el insectario a 28 ° C y% de humedad relativa del 80. </li></ol> 5. Seguimiento de la infección de los mosquitos <ol><li> Coloque la caja de cartón de papel mantenimiento a 4 ° C durante unos 15 minutos para inmovilizar a los mosquitos. </li><li> La transferencia de un pequeño número de mosquitos (5-10 a la vez) en una tabla de frío adaptado para su uso en un microscopio de fluorescencia. </li><li> Examinar y clasificar los mosquitos basada en la presencia o ausencia de fluorescencia. Además, la intensidad de fluorescencia se puede utilizar como una medida representativa cuantitativa de la infección. Tejidos de mosquitos, tales como intestino medio, las glándulas salivales, la grasa corporal pueden ser analizados y monitoreados por fluorescencia. </li><li> En su caso, devolver los mosquitos seleccionados para cartón de papel para continuar la incubación de mosquitos infectados. </li></ol> 6. Ensayo de transmisión (salivación obligada a demostrar la transmisión del virus) <ol><li> Privar a los mosquitos de la fuente de azúcar durante 24 horas antes de la alimentación. </li><li> Quitar las patas y las alas </li><li> A un tubo de 50 l capilar que se ha calentado, se retiró y cortó en un extremo, agregar 5.3 L de aceite de inmersión Cargille Tipo B o el 10% de suero sacarosa solución. </li><li> Inserte la trompa en el tubo. Si se utiliza el aceite, las gotitas de saliva se verá que emanan de la trompa. Una L de una solución pilocarbine 1% en PBS y 0,1% Tween 80 se puede aplicar en el tórax para estimular. </li><li> Después de 60-90 minutos, eliminar los mosquitos y el almacén para el aislamiento del virus, si es necesario. </li><li> Retire la solución desde el tubo de centrifugación en un tubo que contiene 100 l 20% de SFB-PBS. </li><li> Filtro estéril el inóculo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y luego usar el filtrado del inóculo para infectar las células cultivadas. </li></ol> NOTA DE BIOSEGURIDAD: Este protocolo describeun método de generación, identificación y control de mosquitos infectados. Con base en sus instalaciones (es decir, una mesa de enfriamiento, instalación de contención, etc) y la aprobación del CIB, que puede estar limitado a examinarlas sólo después de la eliminación de las alas y las piernas para evitar fugas. SINV basado ATS se puede generar y utilizar en un entorno BSL2. El uso de estimulantes de tipo anfetamínico, basada en alfavirus tales como virus Chikungunya o la encefalitis equina del oeste virus requerirá BSL3 instalaciones. 7. Resultados representante Una visión general de la expresión de un gen marcador (GFP), utilizando el 5&#39;dsMRE16 ATS / GFP se muestra en la Figura 1. Expresión de GFP en células BHK-21 y C6/36 (Aedes albopictus), las células se muestra en la Figura 2 en determinados momentos después de la infección de células con 5&#39;dsMRE16 / GFP virus en 0,01 multiplicidad de infección. La figura 3 es una visión general de infección por el virus alfavirus y ATS en el mosquito cuando el virus llega a través de una ingestión de sangre infectante. La Figura 4 muestra la preparación de una comida de sangre con ~ 10 7 ufp / mL del virus de la ATS seguida de la infección oral de Aedes aegypti. Ver todo el cuerpo de los mosquitos infectados y las partes seleccionadas del cuerpo a los 10 días después de la infección usando un microscopio de epifluorescencia (Figura 5). Detección de buenas prácticas agrarias y DsRed en midguts de mosquitos infectados después de la infección con el virus de la ATS 5&#39;dsMRE16 expresando cada gen marcador fluorescente (Figura 6). Ensayo de transmisión con los mosquitos infectados con 5&#39;dsMRE16 / GFP ATS virus (Figura 7). Tabla 1. ATS actualmente diseñados para la expresión del gen en los mosquitos. <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; Alfavirus </td><td> ATS </td><td> Mosquito </td><td> De referencia </td></tr><tr><td> Sindbis virus </td><td> TE / TE 3&#39;2J y / 5&#39;2J </td><td> Aedes aegypti </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16 y 5&#39;dsMRE16 </td><td> A. aegypti </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Culex tritaeniorhynchus </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. aeg ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Virus chikungunya </td><td> 3&#39;dsCHIKV y 5&#39;dsCHIKV </td><td> A. aegypti / A. albopictus </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong nyong virus </td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> Anopheles gambiae </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oeste de virus de la encefalitis equina </td><td> 5&#39;dsWEEV. McMillan </td><td> Culex tarsalis </td><td> Stauft et al., Sin publicar </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Ventajas / desventajas del uso de estimulantes de tipo anfetamínico para la expresión del gen en los mosquitos. <table border="1"><tbody><tr><td> Ventajas: </td></tr><tr><td> Rápida producción de alto título de virus </td></tr><tr><td> Amplia gama de huéspedes (SINV) </td></tr><tr><td> Alta tasa de replicación del ARN </td></tr><tr><td> Los altos niveles de expresión del transgen </td></tr><tr><td> La relativa facilidad de manipulación de genes </td></tr><tr><td> La expresión estable, persistente gen en los insectos </td></tr><tr><td> Mínima patología de los insectos </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Desventajas: </td></tr><tr><td> A corto plazo en el modo de expresión de células de vertebrados </td></tr><tr><td> Fuertes efectos citopáticos en las células de vertebrados </td></tr><tr><td> Restricciones gen tamaño (&lt;1Kb, idealmente) </td></tr><tr><td> Algunos requieren alfavirus BSL3 contención </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Resumen de la producción de virus de ETA en células BHK-21 con p5&#39;dsMRE / GFP GFP SINV expresa. Después de la transcripción in vitro, ARN genómico ATS es electroporación en células BHK-21, donde el virus es rescatado. El virus de la ATS puede entonces ser utilizada para infectar a los mosquitos. PEC = promotor subgenómico. Tres ATS especies de ARN se transcriben en el cells, la genómica, subgenómico 1 y 2 ARN subgenómico. C (cápside), glicoproteínas E2 y E1 se ensamblan con ATS genoma para generar virus infecciosos. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: La expresión de GFP en el mosquito (C6/36), las células después de la infección con SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Vista de una infección por el virus de ETA en los mosquitos que conducen a la transmisión del virus. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 la infección mediante la exposición de mosquitos a una ingestión de sangre infectante. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP infección a los 10 días post infección. Detección de cuerpo entero de las buenas prácticas agrarias muestra que el virus ha escapado del intestino medio y difundido a los tejidos secundarios. Figura también muestra la expresión de GFP en partes del cuerpo seleccionado que también es indicativo de una infección diseminada. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP y 5&#39;dsMRE16 / DsRed infección de intestino medio en determinados momentos de la infección. Midguts por lo general tienen distintos focos de infección poco después de ingerir una comida de sangre que contiene el virus que se propaga a través del intestino posterior, a veces más tarde después de la infección. <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7: La detección de estimulantes de tipo anfetamínico 5&#39;dsMRE16 / GFP en la saliva de los mosquitos a los 8 días post infección. Ensayo está diseñado para demostrar la transmisión del virus de la ATS y demuestra que el virus 5&#39;dsMRE16 / GFP estable puede expresar GFP en todo el período de incubación extrínseco en el mosquito. El panel izquierdo muestra un mosquito agua la boca en un tubo capilar, el panel central muestra las células C6/36 infectadas con la saliva en un día y panel de la derecha tres días post infección.

<ol>
	<li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+patterns+of+o'nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae.">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li><li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection.">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li><li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li><li>Capurro, d. e. L. a. r. a., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-expressed,+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti.">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li><li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species.">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li><li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus+transducing+systems.">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li><li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti.">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li><li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation.">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li><li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O'nyong-nyong+virus+(Alphavirus;+Togaviridae)+infection+of+Anopheles+gambiae.">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors.">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li><li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes.">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes.">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+(C6/36)+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus.">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li><li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection.">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li><li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus.">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li><li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti.">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li><li>Rutledge, L. C. W. a. r. d., A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder.">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li><li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti.">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li><li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis.">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li><li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells.">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li></ol>

Los métodos presentados aquí permiten a los investigadores a seguir en la infección de un alfavirus en cultivos de células de mosquito y la hembra del mosquito adulto. Las ventajas y desventajas del uso de estimulantes de tipo anfetamínico virus se resumen en la Tabla 2. Un clon de ATS infecciosas pueden ser manipulados genéticamente para expresar cualquier Gobierno de la India y se han utilizado para expresar anticuerpos de cadena simple, supresores del ARNi, ARN antisentido dirigidos genes endógenos y proteínas pro-apoptóticas. Si un periodista no se usa, entonces la porción de imagen de este método no es relevante. Sin embargo, muchos de los mismos protocolos que son necesarios para el rescate de virus ATS, propagación e infección de los mosquitos. Hay limitaciones en el tamaño máximo de los transgenes cuando se inserta en un sistema de transducción de alfavirus. Las restricciones de tamaño varían dependiendo de la cepa parental utilizada para generar el ATS, pero suelen ser de 1 kb, aunque más genes reporteros como luciferasa de luciérnaga se han utilizado en la construcción de ATS para su uso en los mosquitos. Laboratorios de investigación con una pequeña cantidad de fondo virología debe ser capaz de utilizar ATS tras estos protocolos. Un número de laboratorios de investigación lo ha hecho con SINV basado en ATS.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAXIscript Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AB1312</td>
<td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cap Analogue (m7G(5')ppp(5')G)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM8050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanoject II nanoliter injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electro Cell Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>ECM 630</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

Alfavirus sistemas de transducción (ATS) son herramientas importantes para la expresión de genes de interés (GOI) durante la infección. Los ATS se derivan de los clones de cDNA de virus transmitidos por mosquitos del ARN (Alphavirus género, familia Togaviridae). El género alfavirus contiene alrededor de 30 diferentes especies de mosquitos del virus. Alfavirus son virus envueltos y contienen una sola cadena genomas de ARN (~ 11,7 Kb). Alfavirus transcribe un mRNA subgenómico que codifica las proteínas estructurales del virus necesarias para la encapsidación del genoma y la maduración del virus. Alfavirus suelen ser muy lítico en las células de vertebrados, pero persistentemente infectar a las células susceptibles de mosquitos con un mínimo de citopatología. Estos atributos los hacen excelentes herramientas para la expresión del gen en los mosquitos vectores. El ATS más común en uso se derivan de virus Sindbis (SINV). El tropismo gama de especies SINV permite la infección de insectos, aves, mamíferos y cells8. Sin embargo, los ATS se han derivado de alfavirus otras 9,10,20. Expresión de genes foráneos es posible gracias a la inserción de un nuevo sitio de iniciación viral ARN subgenómico o promotor. ATS en el cual se coloca una secuencia de genes exógenos 5 &#39;de los genes estructurales viral se utiliza para la expresión de la proteína estable en los insectos. ATS, en el que se coloca a una secuencia de genes 3 &#39;de los genes estructurales, se utiliza para desencadenar la expresión RNAi y el silencio de ese gen en los insectos. ATS han demostrado ser herramientas valiosas para la comprensión de las interacciones patógeno-vector, los detalles moleculares de la replicación viral y los ciclos de mantenimiento infecciosas 3,4,11,19,21. En particular, la expresión de los periodistas fluorescentes y bioluminiscentes ha sido fundamental para el seguimiento de la infección viral en la transmisión del vector y el virus de 5,14-16,18. Además, la respuesta inmune del vector que se ha descrito el uso de dos cepas de SINV para expresar GFP 2,9. A continuación, presentamos un método para la producción de SINV contiene un reportero fluorescente (GFP) de la clon infeccioso de cDNA. Infecciosa, de larga duración en el ARN se transcribe a partir del clon de ADNc linealizado. RNA infeccioso se introduce en las células diana permisiva de la electroporación. Células transfectadas generar partículas infecciosas del virus que expresan el Gobierno de la India. Virus de la cosecha se usa para infectar a los mosquitos, como se describe aquí, o de otras especies de acogida (no mostrado aquí). Competencia del vector se determina mediante la detección de la fluorescencia fuera del intestino medio o por la transmisión de seguimiento del virus 7. El uso de un fluorescente reportero como el Gobierno de la India permite una estimación conveniente de propagación del virus a través de un cultivo celular, para la determinación de la tasa de infección, la difusión de los mosquitos expuestos, la transmisión del virus del mosquito y es un indicador rápido de la competencia vectorial.

Watch this Scientific Journal Video about Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors at JoVE.com

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Métodos para utilizar los sistemas de transducción de alfavirus para expresar a los periodistas fluorescente in vitro y en los mosquitos adultos se describen. Esta técnica puede ser adaptada a expresar la proteína de interés en lugar de o además de un periodista.

Sistema de alfavirus Transducción: Herramientas para la Visualización de la infección en los mosquitos vectores

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K vistas.  Colorado State University. Métodos para utilizar los sistemas de transducción de alfavirus para expresar a los periodistas fluorescente in vitro y en los mosquitos adultos se describen. Esta técnica puede ser adaptada a expresar la proteína de interés en lugar de o además de un periodista.

Video: Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Investigación

Inmunología e Infección

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Un enfoque simple y eficiente de construcción de mutantes de virus vaccinia Vectores

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generación de vectores recombinantes Herpesvirus aviar con CRISPR/Cas9 Gene edición

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...