この作品は、国立衛生研究所（NIH R01 AI46435）とRMRCE（NIH AI065357）によってサポートされています。

次のプロトコルは、シンドビスウイルスMRE16に基づいてATSの生産と使用のために書かれています。 ATSは蚊ベクトルネッタイシマカでGFPを発現するように設計されています。アルファウイルスの数のcDNA感染クローン（シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、O&#39;nyong -寧ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）は、ATSの（表1）として設計されている現在利用可能です。最良の結果を得るにはプラスミドDNAは、ウイルスcDNAの不要な再結合と損失を回避するために、そのようなSURE有能な細菌などのバクテリア（Stratagene社/アジレントテクノロジー）で増幅される。すべての感染性クローンのプラスミドは、流出の転写のために最後の即時の5&#39;3の全長ゲノムRNAとユニークな制限エンドヌクレアーゼの転写のためのウイルスcDNAの終わり&quot;で、バクテリオファージT7またはSP6プロモーターを持っている。それぞれのATSの場合、ユーザーは適切なバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼとウイルスRNAゲノムのin vitro転写のためのユニークな制限エンドヌクレアーゼを使用する必要があります。 1。 cDNAクローンから感染性RNAの生成。 <ol><li> 100μL反応におけるXhoI制限酵素20単位の（p5&#39;dsMRE16 / GFP）プラスミド感染性クローンの5μgを線形化する。 37 2 - 3時間インキュベート° C </li><li> 50μLのRNaseフリー水を用いてスピンカラムからDNAを溶出する、キアゲンQIAprep Spin Miniprepキット代替精製プロトコールを用いて線状化DNAを精製する。プラスミドの濃度は約1.0μg/μLのはずです。 </li><li> RNaseフリーの0.2 mLをPCRチューブに、プロトコルごとにアンビオンMAXIscriptキットを用いて50μLの転写反応は以下のようなセットアップ。 <ul><li> 22.5μLRNaseフリーのdH 2 O <ul><li> 5.0μL線形DNAのテンプレート（1.0μg/μLの） </li><li> 2.5μL10mMのATP </li><li> 2.5μL10mMのCTP </li><li> 2.5μL10mMのUTP </li><li> 2.5μL1mMのGTP </li><li> 2.5μL10mMのキャップアナログ（M 7 G（5&#39;）pppは（5&#39;）G） </li><li> 5.0μL10X転写バッファー</li><li> 5.0μLT7またはSP6ポリメラーゼミックス</li></ul></li><li> 50.0μL合計</li></ul></li><li> 37℃で1時間転写反応をインキュベート℃にインキュベーション後、反応はBHK - 21細胞のエレクトロポレーションのために直ちに使用する必要があります。エレクトロポレーションのためのBHK - 21細胞の調製は、インキュベーションの転写反応の間に開始する必要があります。 </li></ol> 2。感染性RNAからウイルスの世代<ol><li>コンフルエント150センチメートル2（T - 150）ATSあたりフラスコBHK - 21細胞two 70〜80％をトリプシン処理。 </li><li> 15 mLのコニカル遠心チューブにすべてのセルを転送します。 </li><li> 2000rpmで遠心分離によってペレットは、細胞、10分、一般的な卓上遠心機で4℃。 </li><li>滅菌PBSで再懸濁し、細胞マグネシウムなし+ +とCa + +。細胞をPBSで3回洗浄されるまで、手順2.3と2.4を繰り返します。 </li><li> 10％FBSを含むペレット化した細胞を0.5mLのMEMを再懸濁します。 </li><li> 10％FBSを90μLMEMで10μLの細胞を希釈し、血球計でカウント。もしMEM、10％FBSを含むと2.5〜12.5 × 10 7細胞/ mLのに必要な、希薄な細胞。 </li><li>氷冷0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに、400μLの細胞懸濁液および20μLの転写反応を追加。キュベットから結露を拭いてください。 </li><li>二回キュベットをパルス：450V、1200Ω、150μFを。我々は、電気セルのマニピュレータ、ハーバード装置モデルECM630を使用してください。 </li><li> 10％FBSを5mLのMEMを含む25cm 2の組織培養フラスコにキュベットの内容全体を配置。 </li><li> 5％CO 2で37℃でインキュベートフラスコ（秒）。 </li><li>日常の感染症を監視する適切なフィルターセット（例えば、GFPフィルター付倒立蛍光顕微鏡を使用して：励起波長= 460〜490 nmの発光波長= 510〜550 nmの、またはDsRedフィルター：励起波長= 460〜560 nmの発光波長=&gt; 590nmで）。 </li><li>蛍光は、感染がコンフルエントと/またはCPEはフラスコ全体で表示されているであることを示唆する場合は、-80必要な、そしてストアとして、アリコートを、フラスコの内容を収集する30パーセントFBSを追加℃に必要に応じて、細胞溶解物を遠心分離（2000 rpm、10分、4℃）により、FBSを添加する前にクリアすることができます。 </li><li>少なくとも一回の細胞の新しいフラスコを通過するには、ウイルス、後続の吸血アッセイのためのウイルスの力価を増加させる。 </li></ol> （3）蚊のOS感染あたり <ol><li>血液（通常はデfibrinated羊の血を購入）し、ステップ2.13からの細胞培養由来のウイルス懸濁液を一緒に混ぜる。血液の食事の最後のウイルス力価は、一般的に蚊の効率的な腸の感染症のために〜1 × 10 7プラーク形成単位（PFU）/ mLのはずです。 、満腹にさせる5&#39; -三リン酸（ATP）をアデノシンに蚊を刺激する0.02Mの最終濃度まで添加することができます。 </li><li>蚊年5月人工フィーダから効率的に血液の供給にそれらを刺激するために感染する前に水と砂糖を奪われなければならない。剥奪の期間は、以前は死亡率を最小限にするために確立されるべきである。タイムズ紙は、蚊の種、出発点として、昆虫館等の湿度に依存する前のフィードへの砂糖の24時間と水の12Hを削除します。このプロトコルは、循環37℃の水で水ジャケット付きガラスfeeders17を使用しています。ブタ腸管膜は（つまり、徹底的にほとんどの食料品店で入手可能なケーシングソーセージを洗浄）フィーダーの口の上に配置されており、食事は、チャンバー内にピペットで入れる。様々なデザイン、膜およびプロトコルは、さまざまなベクトル型に対して利用可能です。 </li><li>蚊が血で充血だけ蚊を選択するためにソートされます。充血した蚊は、上にオーガンジーで箱に転送され、蚊は28℃でインキュベートされる° C、75〜80パーセントの相対湿度GFPの発現のために処理されるまで。 </li></ol> 4。蚊の胸腔内接種胸腔内接種は節足動物に感染するための代替方法です。腸を介して普及が必要とされていないときに、このメソッドが使用されます。 （方法は以下に説明するが、技術はこの視覚実験で示されていません）。 <ol><li>蚊（5-10）の少数は、プラスチック製の保持チューブに保持するケージから吸引される。 15分は蚊を冷却する為、℃でのために密封された保持管を4に配置されます。 </li><li> 2 5蚊は、氷の上で休んでガラスのペトリ皿の上にチューブから流出される。使用していない場合や、蚊が移動し始める時にペトリ皿にふたをし。蚊の取り扱い時には、注意が操作されている蚊の数のトラックをカウントし、維持するために注意しなければなりません。蚊が寒さのテーブルの上にこぼしたされているように、合計数は、実験室のカウンターに記録されます。 </li><li>針はNanoject特定のガラスと針のプラーを使用してキャピラリーチューブを融解することによって調製される。 </li><li> 69 NL接種の配信については、製造元の指示に従ってNanoject IIマイクロインジェクターを設定します。針が破損していないように針に接種を描画するときに注意が必要です。 </li><li>解剖顕微鏡を使って、蚊の胸部に針を挿入して、接種のためのNanojectをアクティブにします。針が完全に蚊に浸透し、蚊のそれに続く死に至る、反対側を終了しないように蚊を接種するときは注意が必要。接種材料は、針から取り外す前に入ったことを確認するために、各蚊を確認してください。 </li><li>蚊がまだ針にimpaledている間に接種した後、、他のすべての時間で、綿やコルク栓で接続されている側の小さな穴を通して紙持株カートンに入れてください。 </li><li>蚊は、蚊の偶発的な放出を防止するために設けられている、テープコルクを慎重に、（最大約50カートンごとに）カートンに接種し、配置しているときに。 28 ° Cおよび80％相対湿度での昆虫館でさらにインキュベーションの前に安全な保持ビンでカートンを置きます。 </li></ol> 5。蚊のモニタリング感染<ol><li> ° Cで約15分間蚊を固定するために4で紙保持カートンを置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡での使用に適合チルのテーブルに蚊の数が少ない（一度に5-10）転送する。 </li><li>蛍光の有無に基づいて、蚊を調べて、並べ替える。さらに、蛍光強度は、感染のプロキシ定量的な測定として使用することができる。このようなmidguts、唾液腺などの蚊の組織、脂肪体は、蛍光のために切開し、監視することができます。 </li><li>適切な場合、感染した蚊のインキュベーションを継続する紙のカートンに選択された蚊を返します。 </li></ol> 6。伝送アッセイ（ウイルス伝播のデモを強制唾液分泌） <ol><li>供給する前に24時間糖源の蚊を奪う。 </li><li>脚と翼を削除する</li><li>一方の端で、加熱引っ張らとsnippedされて50μLキャピラリーチューブに、CargilleタイプBのイマージョンオイルまたは10％血清糖溶液の3〜5μLを加える。 </li><li>チューブに口吻を挿入します。オイルを使用している場合は、唾液の滴が口吻からしみ出さに見られます。 1％のpilocarbineのPBS中の溶液および0.1％ツイーン80の一つμLを刺激するために胸部に適用することができます。 </li><li> 60〜90分後、蚊を削除し、必要に応じてウイルス分離のための店。 </li><li> 100μLの20％FBS - PBSを含むチューブで遠心してチューブから溶液を除去。 </li><li>その後、滅菌フィルター0.2μmのシリンジフィルターを介して接種し、培養細胞に感染するフィルタリング接種を使用してください。 </li></ol> 生物学的安全性の注意：このプロトコルは、説明します、生成、識別、および感染した蚊を監視するための方法。あなたの施設（チルのテーブル、すなわち、封じ込め施設、等）とIBCの承認に基づいて、あなたはたったの脱出を防ぐために、翼と脚を除去した後、それらを検査するために制限されることがあります。 SINVベースのATSのが生成され、BSL2環境で使用することができます。このようなチクングンヤ熱ウイルスや西部ウマ脳炎ウイルスのような他のアルファウイルスに基づいて、ATSのの使用は、BSL3施設が必要になります。 7。代表的な結果 ATS 5&#39;dsMRE16 / GFPを用いてマーカー遺伝子（GFP）の発現の概要を図1に示されています。 BHK - 21およびC6/36（ ヒトスジシマカ ）の細胞でGFPの発現は、感染の0.01多重度で5&#39;dsMRE16 / GFPウイルスによる細胞の感染後に特定のタイミングで、図2に示されています。図3は、ウイルスが感染血液の食事を介して配信されている蚊のアルファウイルスとATSウイルス感染の概要です。図4は、 ネッタイシマカの経口感染が続くATSのウイルスの〜10 7 PFU / mLの血液の食事の準備を示しています。感染した蚊と落射蛍光顕微鏡（図5）を使用して10日後に感染症で、選択された身体部分の全身のビュー。 GFPの検出および各蛍光マーカー遺伝子（図6）を発現するATS 5&#39;dsMRE16ウイルス感染後、感染した蚊のmidgutsにDsRedタンパク質。 5&#39;dsMRE16 / GFP ATSウイルス（図7）に感染した蚊を使って送信アッセイ。 表1。ATSは現在、蚊の遺伝子発現のために設計されている。 <table border="1"><tbody><tr><td>&nbsp; アルファウイルス </td><td> ATS </td><td> 蚊 </td><td> リファレンス </td></tr><tr><td>シンドビスウイルス</td><td> TE / 3&#39;2JとTE / 5&#39;2J </td><td> ネッタイシマカ </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ochlerotatus triseriatus </td><td> 13 </td></tr><tr><td></td><td> 3&#39;dsMRE16と 5&#39;dsMRE16 </td><td> A.ネッタイシマカ </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> コガタアカイエカ </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 5&#39;dsTR339 </td><td> A. AEG ypti </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チクングンヤ熱ウイルス</td><td> 3&#39;dsCHIKVと 5&#39;dsCHIKV </td><td> A.ネッタイシマカ/ A.ヒトスジシマカ </td><td> 20 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> O&#39;nyong寧ウイルス</td><td> 5&#39;dsONNV </td><td> ハマダラカ </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>西部ウマ脳炎ウイルス</td><td> 5&#39;dsWEEV。マクミラン</td><td> アカイエカ瞼板 </td><td> Stauft ら 、未発表</td></tr></tbody></table> 表2。蚊の遺伝子発現のためにATSのを使用してのメリット/デメリット。 <table border="1"><tbody><tr><td> 利点： </td></tr><tr><td>高力価のウイルスの急速な生産</td></tr><tr><td>広い宿主範囲（SINV） </td></tr><tr><td>高いRNA複製率</td></tr><tr><td>高い導入遺伝子の発現レベル</td></tr><tr><td>操作する遺伝子の相対的な容易さ</td></tr><tr><td>昆虫の安定した、持続的な遺伝子発現</td></tr><tr><td>昆虫の最小限の病理学</td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 短所： </td></tr><tr><td>脊椎動物細胞における短期的な表現のモード</td></tr><tr><td>脊椎動物細胞に強い細胞変性効果</td></tr><tr><td>遺伝子の大きさの制限（&lt;1KB、理想的に） </td></tr><tr><td>いくつかのアルファウイルスはBSL3の封じ込めが必要です</td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：p5&#39;dsMRE / GFP SINV表現GFPを用いたBHK - 21細胞におけるATSのウイルスの生産の概要。 in vitro転写に続いて、ゲノムATS RNAは、ウイルスが救助されたBHK - 21細胞に電気穿孔されています。 ATSのウイルスは、蚊に感染するために使用することができます。 SGPは=サブゲノムプロモーター。三ATS RNA種がセルに転写さLS、ゲノム、サブゲノム1とサブゲノム2 RNAを。 C（カプシド）、E2とE1糖蛋白質が感染性ウイルスを生成するためにATSゲノムが組み込まれます。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：SINV 5&#39;dsMRE16 / GFPウイルス感染後蚊におけるGFPの発現（C6/36）細胞。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：ウイルス感染につながる蚊におけるATSのウイルス感染の概要。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：感染性の血液の食事に蚊を公開することによって、ATS SINV 5&#39;dsMRE16感染。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：10日後に感染症でATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFP感染。 GFPの全身の検出は、そのウイルスが中腸をエスケープして二次的組織に散在していることを示しています。図には、また播種性感染の指標となる選択された体の部分でGFPの発現を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig6.jpg" alt="図6" /> 図6：ATS SINV 5&#39;dsMRE16 / GFPと5&#39;dsMRE16 /特定の時間後感染でmidgutsのDsRedの感染。 Midgutsは通常、後の時代に、感染後に後部中腸全体に広がるウイルスを含む血液の食事を摂取後早期の感染症の明確な焦点を持っている。 <img src="/files/ftp_upload/2363/2363fig7.jpg" alt="図7" /> 図7：8日、感染後早ければATS 5&#39;dsMRE16 /蚊唾液中のGFPの検出。アッセイは、ATSのウイルスの感染と5&#39;dsMRE16 / GFPウイルスは安定的に蚊の外因性の潜伏期間を通じてGFPを発現できることを示して表示するように設計されています。左側のパネルには、キャピラリーチューブによだれ蚊を示し、中央のパネルは、1日と右側のパネル3日後の感染で唾液で感染C6/36細胞を示しています。

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利害の衝突は宣言されません。

メソッドは、研究者は蚊細胞培養と大人のメス蚊のアルファウイルスの感染に従うことを可能にするここで紹介。 ATSのウイルスを使用しての長所と短所を表2にまとめた。 ATS感染性クローンは、遺伝的にどんなGOIを表現するために操作することができますし、一本鎖抗体、RNAiの抑制、内因性遺伝子を標的とするアンチセンスRNA、およびアポトーシスタンパク質を発現するために使用されています。レポーターが使用されていない場合、このメソッドの撮像部は関係ありません。しかし、同じプロトコルの多くは、ATSのウイルスの救助、伝播、および蚊の感染に必要です。アルファウイルス形質導入システムに挿入する際の制限が導入遺伝子の最大サイズがあります。サイズの制約は、ATSを生成するために使用される親株によって異なりますが、そのようなホタルルシフェラーゼのような大規模なレポーター遺伝子は、蚊で使用するためにATSを構築するために使用されているものの、約1KB通常です。ウイルス学の背景の適度な量の研究室では、ATSのこれらのプロトコルに従って使用することができるはずです。研究室の数はすでにSINVベースのATSのを使用してのことです。

<table><tbody><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript Kit</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.</td></tr><tr><td>Cap Analogue (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G)</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II nanoliter injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Electro Cell Manipulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

alphavirus transducing system:  tools for visualizing infection in mosquito vectors

アルファウイルス形質導入システム（ATS）は、感染時に関心のある遺伝子（GOI）を発現するための重要なツールです。 ATSSは蚊媒介性RNAウイルスのcDNAクローン（;トガウイルス科属のアルファウイルス ）から導出されます。 アルファウイルス属には約30の異なる蚊が媒介するウイルス種が含まれています。アルファウイルスは、エンベロープウイルスであり、一本鎖RNAゲノムを（〜11.7 KB）が含まれています。アルファウイルスは、ウイルスのゲノムと成熟のキャプシド形成に必要なウイルスの構造タンパク質をコードサブゲノムmRNAを転写。アルファウイルスは脊椎動物細胞では通常非常に溶解性であるが、持続的に最小限の細胞病理学に影響を受けやすい蚊の細胞に感染。これらの属性は、それらの蚊の遺伝子発現のための優れたツールとして利用できます。使用中の最も一般的なATSSは、シンドビスウイルス（SINV）から導出されます。 SINVの広範な種指向性は、昆虫鳥類、および哺乳類cells8の感染が可能になります。しかし、ATSSはよく9,10,20のような他のアルファウイルスに由来している。外来遺伝子の発現は、追加のウイルスのサブゲノムRNAの開始部位やプロモーターの挿入によって実現されています。外来遺伝子の配列はウイルス構造遺伝子の5&#39;側に配置されているATSSは昆虫で安定したタンパク質発現のために使用されます。遺伝子配列が構造遺伝子の3&#39;側に配置されているATSSは、RNAiと沈黙昆虫におけるその遺伝子の発現をトリガするために使用されます。 ATSSはベクトル-病原体相互作用、ウイルス複製の分子の詳細とメンテナンス感染サイクル3,4,11,19,21を理解するための貴重なツールであることが証明されている。特に、蛍光と生物発光レポーターの発現は、ベクターとウイルス伝送5,14-16,18でウイルス感染を追跡尽力している。さらに、ベクトル免疫応答は、GFP 2,9を表現するために設計さSINVの二系統を用いて記述されています。 ここで、我々はcDNAの感染性クローンから蛍光レポーター（GFP）を含むSINVの製造方法を示す。伝染性、完全長のRNAは、線形化されたcDNAクローンから転写される。感染性RNAをエレクトロポレーションによって許容標的細胞に導入する。トランスフェクションされた細胞は、GOIを発現している感染性ウイルス粒子を生成する。収穫されたウイルスは、ここで説明する蚊、、または他のホストの種を（ここでは図示せず）に感染するために使用されます。ベクトルの能力は、中腸外蛍光を検出することにより、または監視のウイルスの伝達7によって評価される。 GOIは、感染率の決定のために、細胞培養全体に広がるウイルスの便利な推定、露出蚊の普及、蚊からのウイルスの伝達を可能にするとベクトルの能力の急速なゲージを提供するので、蛍光レポーターを使用してください。

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K ビュー.  Colorado State University. in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

免疫・感染学

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

生化学

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

発生生物学

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

生物学

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

要約

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Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

多重等温増幅ベースジカ、チクングニアウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

アルボウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニングツールとして

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

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Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

多重等温増幅ベースジカ、チクングニアウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

アルボウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニングツールとして

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析