Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Arabidopsis tohumlarında, embriyo ile testa arasında bulunan tek bir canlı hücre tabakası olan endosperm, tohum olgunlaşması, uyku hali ve çimlenmenin düzenlenmesinde kritik bir rol oynar. Sağlam endosperm hücrelerinin mikroskobik analizi, endospermin hücresel ve moleküler düzeydeki fizyolojik fonksiyonlarını anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, Arabidopsis tohumlarının küçük boyutu ve endosperm hücre tabakasının testisin altındaki konumu nedeniyle numune hazırlama zor olmuştur. Bu makale, hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlarda mikroskobik gözlem ve analiz için uygun bozulmamış endosperm hücre tabakası örneklerinin hazırlanmasını detaylandırmaktadır. Bu yöntem, fiksasyon veya kesit alma gerektirmeden geniş alanların ve çok sayıda sağlam endosperm hücresinin gözlemlenmesini sağlar. Ek olarak, protokol yalnızca enjeksiyon iğneleri, hassas forsepsler ve stereo mikroskoplar gibi standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır. Bu yaklaşım, sağlam endosperm hücrelerinde yeşil floresan proteini (GFP) gibi floresan sinyallerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini başarıyla sağlar. Bu yöntem, farklı Arabidopsis mutantlarının endosperm hücrelerinde hücre içi lokalizasyonun ve çeşitli proteinlerin hareketinin yanı sıra organellerin morfolojisinin gözlemlenmesine izin verir. Bu protokol, yeni endosperm fonksiyonlarının aydınlatılmasına katkıda bulunur ve bu esansiyel dokunun hücresel ve moleküler çalışma potansiyelini genişletir.

Bitkiler sapsız organizmalar olduğundan, tohum çimlenmesi kaderlerini belirleyen çok önemli bir olaydır. Çimlenme kararı, birincil tohum uyku hali seviyeleri, sıcaklık, ışık yoğunluğu ve dalga boyu ve nitrojen konsantrasyonu 1,2,3,4,5,6 gibi hem iç hem de çevresel faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Tohumlar, birden fazla doku tipinden oluşan karmaşık yapılara sahiptir⁷. Arabidopsis kuru tohumlarında, bir fide haline gelen embriyo, tek bir endosperm tabakası ve en dış tabakalar olan testa ile çevrilidir. Testa, çok sayıda ölü hücre katmanından oluşurken, embriyo ve endosperm kuru tohumlarda bile canlı kalır. Endosperm genellikle embriyo büyümesi için besin sağlayan bir depolama dokusu olarak kabul edilir ve testa ile birlikte kök çıkıntısına karşı mekanik direnç sağlar 8,9,10,11,12,13.

Son zamanlarda yapılan birkaç çalışma, endospermin optimal tohum çimlenmesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir 14,15,16,17. Örneğin, endosperm hücrelerindeki fotoreseptör fitokrom B (PHYB), çimlenme tepkilerini düzenleyerek kırmızı ( R ) veya uzak kırmızı ( FR) ışığı algılar¹⁵ . Endosperm aynı zamanda sıcaklığı algılayan bir doku olarak da işlev görür ve yüksek sıcaklıklarda çimlenme tepkilerini baskılar¹⁶. Endospermin kalite kontrolü, özellikle uzun süreli depolanmış tohumlarda optimal tohum çimlenmesi için kritik öneme sahiptir¹⁷.

Endospermin fizyolojik fonksiyonlarını daha da aydınlatmak için canlı hücre görüntüleme artık gereklidir. Floresan etiketli proteinleri eksprese eden sağlam endosperm hücrelerinin mikroskobik analizi, endospermin tohum çimlenmesini düzenlediği moleküler mekanizmaların araştırılmasına olanak tanır. Bununla birlikte, sağlam endosperm hücrelerini mikroskobik gözlem için hazırlamak, özellikle Arabidopsis tohumlarında zordur. Tohumların çapı yaklaşık 0,4 mm'dir ve endosperm, embriyo ile testa arasında bulunan tek hücreli bir tabakadır ve hassas manipülasyonu zorlaştırır. Sonuç olarak, önemli fizyolojik rollerine rağmen, endosperm nadiren canlı hücre görüntüleme kullanılarak gözlenmiştir.

Bu makale, hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlarda canlı hücre görüntülemeye uygun sağlam endosperm hücre tabakası örneklerinin hızlı bir şekilde hazırlanması için bir protokol sunmaktadır.

Bu çalışmada, canlı endosperm hücre tabakası örneklerinin hazırlanması için biri gelişmekte olan tohumlar ve diğeri olgun tohumlar için olmak üzere iki farklı prosedür oluşturulmuştur. Testanın sağlamlığına bağlı olarak biraz farklı yaklaşımlar gereklidir. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Gelişmekte olan tohumlardan sağlam endosperm örneklerinin hazırlanması

1. Siliklerin toplanması
   1. Arabidopsis bitkilerini çiçek açana kadar toprakta veya taşyünü üzerinde büyütün.
   2. Tamamen açılmış çiçekleri renkli ipliklerle işaretleyin (çiçeklenmeden 0 gün sonra, 0 DAF).
      NOT: Çiçekleri işaretlemek için yeşil, sarı veya kahverengi iplikler kullanmaktan kaçının, çünkü bu renkleri büyüyen veya olgun bitkilerden ve siliklerden ayırt etmek zordur.
   3. Pedicelde ( Şekil 1(1)'de gösterilmiştir) işaretli gelişmekte olan silislikleri kesin ve bunları 1,5 mL'lik tüplerde toplayın.
      NOT: 12-16 DAF arası geliştirilen silisler, bu protokol kullanılarak hazırlanmak için uygundur.
2. Gelişmekte olan tohumların diseksiyonu
   NOT: Numunelerin kurumasını önlemek için ıslak filtre kağıdı üzerinde aşağıdaki adımlar gerçekleştirilmelidir. Manipülasyonlar stereo mikroskop altında yapılmalıdır.
   1. İki forseps kullanarak bir valfi ( Şekil 1(2)'de gösterilmiştir) replumdan ( Şekil 1(1)'de gösterilmiştir) ayırın: biri tutmak için kalın uçlara ve diğeri yırtmak için keskin uçlara sahip).
   2. Tohumlara zarar vermemek için uçları kapalıyken forseps kullanarak silislerden gelişmekte olan tohumları nazikçe toplayın (Şekil 1(2)).
   3. Tohumu çarpmadan forseps ile tutarak embriyoyu çevreleyen testa ve endosperm üzerinde enjeksiyon iğnesi (27 G, 0.40 mm × 19 mm) büyüklüğünde bir iz açın (Şekil 1(3)).
      NOT: Yara izi oluşturmak için en uygun yer, kotiledonların ve kökün birleştiği yerdir.
   4. Tohumu forseps ile sıkıştırarak embriyoyu dışarı itin (Şekil 1(4)). Testa ve endospermden oluşan boş tohum zarfını ezmeyin ve yuvarlak şeklini korumaya çalışın.
   5. Enjeksiyon iğnesini yara izindeki boş tohum zarfına içten dışa doğru delerek yerleştirin (Şekil 1(5)).
   6. İğneyi yerinde tutun, uçları kapalıyken forseps kullanarak testanın yüzeyini çizin ve boş tohum zarfının bir tarafını açılmasına izin verecek şekilde kesin (Şekil 1(6)).
   7. Boş tohum zarfını keskin uçlu forseps kullanarak bir tabaka halinde açın (Şekil 1(7)). Örnek şimdi endosperm ve testa katmanlarından oluşan iki katmanlı bir tabaka olarak izole edilmelidir (Şekil 1(8)).
      NOT: Aşağıdaki 3. adımda montaj ortamı olarak su kullanıldığında numune kıvrılma eğilimindeyse, tabaka biçimindeki numuneyi iki parçaya bölün. Yaklaşık 18 DAF'ta siliklerden hasat edilen tohumlar (bu aşamada, testa kahverengidir ancak henüz tamamen kuru değildir) bu protokol kullanılarak da işlenebilir, ancak tohumların hazırlanmadan önce birkaç dakika emilmesi gerekir.

2. Olgun tohumlardan sağlam endosperm örneklerinin hazırlanması

1. Olgun tohumların emilmesi
   1. Kuru Arabidopsis tohumları içeren 1,5 mL'lik bir tüpe 1 mL çift damıtılmış su ekleyin.
   2. Tohumları oda sıcaklığında en az 40 dakika emilmiş halde tutun (Şekil 2(1)).
      NOT: Kuru tohumların ve tohumların emiledikten sonraki 40 dakika içinde testa ve endospermde yara izi bırakması ve 2.2.1 ve 2.2.2 adımlarında boş tohum zarfına zarar vermeden embriyoyu tohumun içinden çıkarması zordur, oysa daha uzun bir emme süresi manipülasyonu kolaylaştırır.
   3. Emilmiş tohumları ıslak filtre kağıdına aktarmak için 1000 μL'lik bir mikropipet kullanın.
2. Olgun tohumların diseksiyonu
   NOT: Numunelerin kurumasını önlemek için ıslak filtre kağıdı üzerinde aşağıdaki adımlar gerçekleştirilmelidir. Manipülasyonlar stereo mikroskop altında yapılmalıdır.
   1. Tohumu çarpmadan forseps ile tutarak embriyoyu saran testa ve endosperm üzerinde yaklaşık 0.2 mm büyüklüğünde bir iz enjeksiyon iğnesi kullanarak açın (Şekil 2(2)).
   2. Tohumu forseps ile sıkıştırarak embriyoyu dışarı itin (Şekil 2(3)). Testa ve endospermi içeren boş tohum zarfını ezmeyin. Yuvarlak şeklini korumaya çalışın.
   3. Boş tohum zarfının üst ve alt taraflarını bir silindir haline getirmek için bir enjeksiyon iğnesi ile kesin (Şekil 2(4)).
   4. Silindirik şekilli boş tohum zarfını iki parçaya ayırmak için merkezi ekseni boyunca kesin (Şekil 2(5)). Örnekler, endosperm tabakası ve testa tabakasından oluşan iki tabakalı tabakalar halinde izole edilmelidir (Şekil 2(6)).

3. Mikroskobik gözlem

1. Endosperm örneklerini bir cam slayt üzerine tabaka halinde yerleştirin ve bunları su veya perflorodekalin (PFD) içine monte edin.
   NOT: Numune ile lamel arasında hava kabarcıkları kalırsa, yapraklar^18,19 gibi hava cepleri içeren numunelerin görüntülenmesi için özellikle yararlı olduğu bildirilen perflorodekalin (PFD) faydalı olacaktır. PFD'nin en düşük yüzey gerilimine sahip olduğu bilinmektedir ve bu da numune yüzeyindeki hava boşluklarını kolayca doldurmasına olanak tanır. Bununla birlikte, hızlandırılmış görüntüleme için, hücresel sıvılığı korumak için olgun tohumlardaki su içeriğinin bol olması gerektiğinden, montaj ortamı olarak suyun kullanılması önerilir.
2. Numunenin üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin. Endosperm tabakasının lamel ile baktığından emin olun.
   NOT: Numunenin ve montaj ortamının kurumasını önlemek için lamel kenarlarını kapatmak için oje veya gres kullanılabilir.

Şekil 1'de gösterilen protokol kullanılarak, endosperm örnekleri, 14 DAF'ta siliklerden hasat edilen gelişmekte olan tohumlardan hazırlandı (bu aşamada, testa hala yeşildir). Geniş bir alanda çok sayıda endosperm hücresi ve bunların hücre içi yapıları gözlendi (Şekil 3A). Bu deneyde, C-terminalinde (PHYB-GFP) GFP ile kaynaşmış PHYB eksprese eden tohumlar kullanılmıştır. PHYB'nin kırmızı ışıkla ak...

Endospermin tohum çimlenmesindeki rolleri, gen ekspresyon analizi ve lipitlerin ve fitohormonların miktar tayini^gibi ayrılmış tohum dokuları kullanılarak yapılan genetik ve biyokimyasal analizlerle ortaya çıkarılmıştır 9,14,25,26,27. Boş tohum zarfını (endosperm ve testa) farklı Arabidopsis mutantlar...

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kyoto Üniversitesi'nden Dr. Matsushita ve Oka'ya, 35S promotörü tarafından yönlendirilen phyB mutantını eksprese eden PHYB-GFP'yi sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Yenilikçi Alanlarda Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi, Önerilen Araştırma Alanında Araştırma (19H05713 - K.Y.) tarafından desteklenmiştir.