Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

In Arabidopsis-Samen spielt das Endosperm , eine einzelne Schicht lebender Zellen, die sich zwischen dem Embryo und der Testa befindet, eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Samenreifung, der Ruhephase und der Keimung. Die mikroskopische Analyse intakter Endospermzellen ist unerlässlich, um die physiologischen Funktionen des Endosperms auf zellulärer und molekularer Ebene zu verstehen. Die Probenvorbereitung war jedoch aufgrund der geringen Größe der Arabidopsis-Samen und der Lage der Endosperm-Zellschicht unter dem Testa eine Herausforderung. In diesem Artikel wird die Aufbereitung von intakten Endosperm-Zellschichtproben beschrieben, die für die mikroskopische Beobachtung und Analyse sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen geeignet sind. Diese Methode ermöglicht die Betrachtung großer Areale und zahlreicher intakter Endospermzellen, ohne dass eine Fixierung oder Sektion erforderlich ist. Darüber hinaus werden für das Protokoll nur Standard-Laborgeräte wie Injektionsnadeln, Präzisionszangen und Stereomikroskope verwendet. Dieser Ansatz ermöglicht erfolgreich die hochauflösende Bildgebung von Fluoreszenzsignalen, wie z. B. grün fluoreszierendem Protein (GFP), in intakten Endospermzellen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der intrazellulären Lokalisation und Bewegung verschiedener Proteine sowie der Morphologie von Organellen in den Endospermzellen verschiedener Arabidopsis-Mutanten . Dieses Protokoll trägt zur Aufklärung neuer Endosperm-Funktionen bei und erweitert das Potenzial für zelluläre und molekulare Studien dieses essentiellen Gewebes.

Da Pflanzen sessile Organismen sind, ist die Keimung von Samen ein entscheidendes Ereignis, das über ihr Schicksal entscheidet. Die Entscheidung für die Keimung wird sowohl von internen als auch von Umweltfaktoren streng reguliert, wie z. B. der Ruhephase des primären Samens, der Temperatur, der Lichtintensität und -wellenlänge sowie der Stickstoffkonzentration 1,2,3,4,5,6. Samen haben komplexe Strukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen⁷. Bei den trockenen Samen von Arabidopsis ist der Embryo, der sich zu einem Keimling entwickelt, von einer einzigen Schicht Endosperm und der äußersten Schicht, der Testa, umgeben. Die Testa besteht aus mehreren Schichten abgestorbener Zellen, während der Embryo und das Endosperm auch in trockenen Samen am Leben bleiben. Das Endosperm wird allgemein als Speichergewebe angesehen, das Nährstoffe für das Wachstum des Embryos liefert und zusammen mit der Testa eine mechanische Beständigkeit gegen den Radialvorsprung verleiht 8,9,10,11,12,13.

Mehrere neuere Studien haben gezeigt, dass das Endosperm eine wesentliche Rolle bei der Regulierung einer optimalen Samenkeimung spielt 14,15,16,17. Zum Beispiel erkennt der Photorezeptor Phytochrom B (PHYB) in Endospermzellen entweder rotes (R) oder dunkelrotes (FR) Licht und reguliert so die Keimreaktionen¹⁵. Das Endosperm fungiert auch als temperaturempfindliches Gewebe und unterdrückt die Keimreaktion bei hohen Temperaturen¹⁶. Die Qualitätskontrolle des Endosperms ist entscheidend für eine optimale Keimung der Samen, insbesondere bei langfristig gelagerten Samen¹⁷.

Die Bildgebung lebender Zellen ist nun notwendig, um die physiologischen Funktionen des Endosperms weiter aufzuklären. Die mikroskopische Analyse intakter Endospermzellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen, durch die das Endosperm die Samenkeimung reguliert. Die Vorbereitung intakter Endospermzellen für die mikroskopische Betrachtung ist jedoch eine Herausforderung, insbesondere bei Arabidopsis-Samen . Die Samen haben einen Durchmesser von etwa 0,4 mm, und das Endosperm ist eine einzellige Schicht, die sich zwischen dem Embryo und der Testa befindet, was eine präzise Manipulation erschwert. Folglich wurde das Endosperm trotz seiner wichtigen physiologischen Rolle nur selten mit Hilfe von Lebendzell-Bildgebung beobachtet.

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die schnelle Präparation von intakten Endosperm-Zellschichtproben vorgestellt, die für die Bildgebung lebender Zellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen geeignet sind.

In dieser Studie wurden zwei verschiedene Verfahren für die Präparation von lebenden Endosperm-Zellschichtproben etabliert: eines für die Entwicklung von Seeds und eines für reife Samen. Je nach Festigkeit des Testas sind leicht unterschiedliche Ansätze erforderlich. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von intakten Endospermproben aus sich entwickelnden Samen

1. Sammlung von Siliques
   1. Ziehen Sie Arabidopsis-Pflanzen bis zur Blüte auf Erde oder Steinwolle an.
   2. Vollständig geöffnete Blüten mit farbigen Fäden markieren (0 Tage nach der Blüte, 0 DAF).
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von grünen, gelben oder braunen Fäden zum Markieren von Blumen, da diese Farben schwer von wachsenden oder reifen Pflanzen und Siliques zu unterscheiden sind.
   3. Schneiden Sie die markierten sich entwickelnden Siliquen am Stiel ab (siehe Abbildung 1(1)) und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Entwicklung von Siliques von 12-16 DAF ist für die Zubereitung mit diesem Protokoll geeignet.
2. Zerlegung von sich entwickelnden Samen
   HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen auf nassem Filterpapier durchgeführt werden, um die Proben vor dem Austrocknen zu schützen. Manipulationen sollten unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden.
   1. Trennen Sie ein Ventil (siehe Abbildung 1(2)) von der Feder (siehe Abbildung 1(1)) mit zwei Pinzetten: eine mit dicken Spitzen zum Halten und die andere mit scharfen Spitzen zum Reißen).
   2. Nehmen Sie die sich entwickelnden Samen vorsichtig mit einer Pinzette und geschlossenen Spitzen von den Siliquen auf, um eine Beschädigung der Samen zu vermeiden (Abbildung 1(2)).
   3. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette, ohne den Samen zu zerstoßen, und machen Sie mit einer Injektionsnadel eine etwa 0,2 mm große Narbe auf der Hode und dem Endosperm, die den Embryo umgibt (27 G, 0,40 mm × 19 mm) (Abbildung 1(3)).
      HINWEIS: Die optimale Stelle für die Narbe befindet sich an der Verbindungsstelle zwischen Keimblättern und Keimwurzel.
   4. Schieben Sie den Embryo heraus, indem Sie den Samen mit einer Zange einklemmen (Abbildung 1(4)). Zerdrücken Sie die leere Samenhülle, die aus Testa und Endosperm besteht, nicht und versuchen Sie, ihre runde Form beizubehalten.
   5. Führen Sie die Injektionsnadel in die leere Samenhülle an der Narbe ein und stechen Sie sie von innen nach außen ein (Abbildung 1(5)).
   6. Halten Sie die Nadel in Position, kratzen Sie mit geschlossenen Spitzen mit einer Pinzette auf die Oberfläche des Hodens und schneiden Sie eine Seite der leeren Samenhülle ab, damit sie sich öffnen kann (Abbildung 1(6)).
   7. Öffnen Sie die leere Samenhülle mit einer Pinzette mit scharfen Spitzen in ein Blatt (Abbildung 1(7)). Die Probe sollte nun als Doppelschicht, bestehend aus der Endosperm- und der Hodenschicht, isoliert werden (Abbildung 1(8)).
      HINWEIS: Wenn die Probe dazu neigt, sich zusammenzurollen, wenn Wasser als Einbettmedium in Schritt 3 verwendet wird, teilen Sie die blattförmige Probe in zwei Stücke. Samen, die von Siliken bei etwa 18 DAF geerntet wurden (zu diesem Zeitpunkt ist die Testa braun, aber noch nicht vollständig trocken), können ebenfalls nach diesem Protokoll verarbeitet werden, obwohl die Samen vor der Zubereitung einige Minuten lang getrunken werden müssen.

2. Aufbereitung von intakten Endospermproben aus reifen Samen

1. Imbibition von reifem Saatgut
   1. Geben Sie 1 ml doppelt destilliertes Wasser in ein 1,5-ml-Röhrchen mit trockenen Arabidopsis-Samen .
   2. Bewahren Sie die Samen mindestens 40 Minuten lang bei Raumtemperatur auf (Abbildung 2(1)).
      HINWEIS: Bei trockenen Samen und Samen, die innerhalb von 40 Minuten nach der Imbibition liegen, ist es schwierig, an der Testa und dem Endosperm zu vernarben und den Embryo aus dem Inneren des Samens zu entfernen, ohne die leere Samenhülle in den Schritten 2.2.1 und 2.2.2 zu beschädigen, während eine längere Imbibitionszeit die Manipulation erleichtert.
   3. Verwenden Sie eine 1000-μl-Mikropipette, um die aufgenommenen Samen auf nasses Filterpapier zu übertragen.
2. Zerlegung von reifem Saatgut
   HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen auf nassem Filterpapier durchgeführt werden, um die Proben vor dem Austrocknen zu schützen. Manipulationen sollten unter einem Stereomikroskop durchgeführt werden.
   1. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette, ohne den Samen zu zerstoßen, und machen Sie mit einer Injektionsnadel eine etwa 0,2 mm große Narbe auf der Hode und dem Endosperm, die den Embryo umgeben (Abbildung 2(2)).
   2. Schieben Sie den Embryo heraus, indem Sie den Samen mit einer Zange einklemmen (Abbildung 2(3)). Zerdrücken Sie nicht die leere Samenhülle, die die Testa und das Endosperm enthält. Versuchen Sie, die runde Form beizubehalten.
   3. Schneiden Sie die Ober- und Unterseite der leeren Saatguthülle mit einer Injektionsnadel zu einem Zylinder ab (Abbildung 2(4)).
   4. Schneiden Sie die zylindrische leere Saatguthülle entlang ihrer Mittelachse in zwei Stücke (Abbildung 2(5)). Die Proben sollten als Doppelschichten, bestehend aus der Endospermschicht und der Testaschicht, isoliert werden (Abbildung 2(6)).

3. Mikroskopische Betrachtung

1. Legen Sie die Endospermproben in Blattform auf einen Objektträger und montieren Sie sie in Wasser oder Perfluordecalin (PFD).
   HINWEIS: Wenn Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas verbleiben, wäre Perfluordecalin (PFD), das sich als besonders nützlich für die Abbildung von Proben mit Lufteinschlüssen wie Blättern^{18, 19} erwiesen hat, nützlich. PFD ist dafür bekannt, die niedrigste Oberflächenspannung zu haben, so dass es die Lufträume auf der Probenoberfläche leicht füllen kann. Für die Zeitraffer-Bildgebung wird jedoch die Verwendung von Wasser als Eindeckmedium empfohlen, da der Wassergehalt in reifen Samen reichlich vorhanden sein sollte, um die zelluläre Liquidität zu erhalten.
2. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über die Probe. Stellen Sie sicher, dass die Endospermschicht dem Deckglas zugewandt ist.
   HINWEIS: Nagellack oder Fett können verwendet werden, um die Ränder des Deckglases zu versiegeln, um ein Austrocknen der Probe und des Einbettmediums zu verhindern.

Unter Verwendung des in Abbildung 1 gezeigten Protokolls wurden Endospermproben aus sich entwickelnden Samen hergestellt, die bei 14 DAF aus Siliquen geerntet wurden (zu diesem Zeitpunkt ist die Testa noch grün). Es wurden zahlreiche großflächige Endospermzellen und ihre intrazellulären Strukturen beobachtet (Abbildung 3A). In diesem Experiment wurden Seeds verwendet, die PHYB exprimieren und mit GFP am C-Terminus (PHYB-GFP)...

Die Rolle des Endosperms bei der Samenkeimung wurde durch genetische und biochemische Analysen unter Verwendung von getrennten Samengeweben aufgedeckt, wie z. B. die Genexpressionsanalyse und die Quantifizierung von Lipiden und Phytohormonen 9,14,25,26,27. Ein in vitro Assay der Samenhülle, bei dem die leere Samenh?...

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir danken Dr. Matsushita und Dr. Oka von der Universität Kyoto für die Bereitstellung der phyB-Mutante , die PHYB-GFP exprimiert und vom 35S-Promotor angetrieben wird. Diese Studie wurde teilweise durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung in innovativen Bereichen, Forschung in einem vorgeschlagenen Forschungsbereich (19H05713 an K.Y.) unterstützt.