用于发育中和成熟 拟南芥 种子胚乳细胞层显微分析的完整组织的制备

该方案描述了拟南 芥 种子中胚乳细胞层完整样品的制备。该方法只需要常见的实验室设备，例如注射针和精密镊子，并能够对发育中和成熟种子中的胚乳细胞进行高分辨率荧光活细胞成像。

在 拟南芥 种子中，胚乳是位于胚胎和睾丸之间的单层活细胞，在调节种子成熟、休眠和发芽方面起着关键作用。完整胚乳细胞的显微分析对于在细胞和分子水平上了解胚乳的生理功能至关重要。然而，由于 拟南芥 种子的小尺寸和胚乳细胞层位于睾丸下方，样品制备一直具有挑战性。本文详细介绍了适用于发育中和成熟种子的显微镜观察和分析的完整胚乳细胞层样品的制备。这种方法能够观察大面积和大量完整的胚乳细胞，而无需固定或切片。此外，该方案仅使用标准实验室设备，例如注射针、精密镊子和体视显微镜。这种方法成功地实现了完整胚乳细胞中荧光信号的高分辨率活细胞成像，例如绿色荧光蛋白 （GFP）。该方法允许观察不同 拟南芥 突变体的胚乳细胞中各种蛋白质的细胞内定位和运动，以及细胞器的形态。该方案有助于阐明新的胚乳功能，并扩大了这种重要组织的细胞和分子研究的潜力。

因为植物是无柄生物，所以种子发芽是决定其命运的关键事件。发芽的决定受到内部和环境因素的严格控制，例如初级种子休眠水平、温度、光强度和波长以及氮浓度 1,2,3,4,5,6。种子具有由多种组织类型组成的复杂结构⁷。在拟南芥干种子中，发育成幼苗的胚胎被单层胚乳和最外层的睾丸包围。睾丸由多层死细胞组成，而胚胎和胚乳即使在干燥的种子中也保持活力。胚乳通常被认为是一种储存组织，为胚胎生长提供营养，并与睾丸一起赋予对胚根突出的机械抵抗力 8,9,10,11,12,13。

最近的几项研究表明，胚乳在调节种子最佳发芽中起着至关重要的作用 14,15,16,17。例如，胚乳细胞中的感光器植物色素 B （PHYB） 可检测红光 （R） 或远红光 （FR） 光，从而调节发芽反应¹⁵。胚乳还起到温度感应组织的作用，在高温下抑制发芽反应¹⁶。胚乳的质量控制对于种子的最佳发芽至关重要，尤其是在长期储存的种子中¹⁷。

现在需要活细胞成像来进一步阐明胚乳的生理功能。对表达荧光标记蛋白的完整胚乳细胞进行显微分析，可以研究胚乳调节种子发芽的分子机制。然而，准备用于显微镜观察的完整胚乳细胞是具有挑战性的，尤其是在拟 南芥 种子中。种子直径约为 0.4 毫米，胚乳是位于胚胎和睾丸之间的单细胞层，因此难以精确作。因此，尽管胚乳具有重要的生理作用，但很少使用活细胞成像观察到胚乳。

本文提出了一种用于快速制备完整胚乳细胞层样品的方案，适用于发育中和成熟种子中的活细胞成像。

在本研究中，建立了两种不同的程序来制备活的胚乳细胞层样品：一种用于发育种子，一种用于成熟种子。根据 Testa 的坚固性，需要略有不同的方法。所用试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 从发育中的种子中制备完整的胚乳样品

1. 角果收集
   1. 在土壤或岩棉上种植 拟南芥 植物直到开花。
   2. 用彩色线标记完全开放的花（开花后 0 天，0 DAF）。
      注意：避免使用绿色、黄色或棕色线来标记花朵，因为这些颜色很难与生长或成熟的植物和角果区分开来。
   3. 切掉花梗处标记的发育角果（如图 1（1） 所示）并将它们收集在 1.5 mL 管中。
      注意：从 12-16 DAF 开发角果适合使用此方案进行制备。
2. 解剖发育中的种子
   注：必须在湿滤纸上执行以下步骤，以防止样品干燥。作应在立体显微镜下进行。
   1. 使用两个镊子从 replum（如图 1（1） 中所示）中分离一个瓣膜（如图 1（2）所示）：一个带有用于固定的粗尖端，另一个带有用于撕裂的尖锐尖端）。
   2. 使用镊子轻轻地从角果中拾取发育中的种子，尖端关闭，以避免损坏种子（图 1（2））。
   3. 用镊子夹住种子而不撞击种子，使用注射针（27 G、0.40 mm × 19 mm）在胚胎周围的睾丸和胚乳上留下约 0.2 毫米大小的疤痕（图 1（3））。
      注意：形成疤痕的最佳位置是在子叶和胚根的交界处。
   4. 用镊子捏住种子，将胚胎推出（图 1（4））。不要压碎由睾丸和胚乳组成的空种子包，并尽量保持其圆形。
   5. 将注射针插入疤痕处的空种子信封中，从内到外刺穿（图 1（5））。
   6. 保持针头就位，用镊子在尖端闭合的情况下刮擦睾丸表面，然后切开空种子包膜的一侧以使其打开（图 1（6））。
   7. 使用带有锋利尖端的镊子将空种子信封打开到片材中（图 1（7））。现在应将样品分离为由胚乳和 testa 层组成的双层片状（图 1（8））。
      注：如果在下面的步骤 3 中使用水作为封固剂时样品容易卷曲，请将片状样品分成两部分。从大约 18 DAF 的角果中收获的种子（在这个阶段，睾丸是棕色的，但尚未完全干燥）也可以使用该方案进行加工，尽管种子必须在制备前吸收几分钟。

2. 从成熟种子中制备完整的胚乳样品

1. 成熟种子的吸收
   1. 将 1 mL 双蒸水加入含有干燥 拟南芥 种子的 1.5 mL 试管中。
   2. 将种子在室温下吸收至少 40 分钟（图 2（1））。
      注意：干燥的种子和吸收后 40 分钟内的种子很难在睾丸和胚乳处留下疤痕，并且很难在步骤 2.2.1 和 2.2.2 中从种子内部取出胚胎而不会损坏空种子包膜，而较长的吸收时间有利于作。
   3. 使用 1000 μL 微量移液器将吸收的种子转移到湿滤纸上。
2. 解剖成熟种子
   注：必须在湿滤纸上执行以下步骤，以防止样品干燥。作应在立体显微镜下进行。
   1. 用镊子夹住种子而不撞碎种子，使用注射针在胚胎周围的睾丸和胚乳上留下约 0.2 毫米大小的疤痕（图 2（2））。
   2. 用镊子捏住种子，将胚胎推出（图 2（3））。不要压碎空的种子包，其中包括睾丸和胚乳。尽量保持其圆形。
   3. 用注射针切割空种子包膜的上下侧，使其形成圆柱体（图 2（4））。
   4. 沿其中心轴切下圆柱形的空种子信封，将其分成两部分（图 2（5））。样品应分离为由胚乳层和 testa 层组成的双层片材 [图 2（6）]。

3. 显微镜观察

1. 将胚乳样品以片状形式放在载玻片上，并将它们安装在水或全氟十氢萘 （PFD） 中。
   注：如果样品和盖玻片之间仍有气泡，则全氟十氢萘 （PFD） 将很有用，据报道，全氟十氢萘 （PFD） 对于成像含有气穴的样品（如^18,19 叶）特别有用。众所周知，PFD 具有最低的表面张力，使其能够轻松填充样品表面的空气空间。然而，对于延时成像，建议使用水作为封固剂，因为成熟种子中的水分含量应该丰富以维持细胞流动性。
2. 将盖玻片轻轻地放在样品上。确保胚乳层面向盖玻片。
   注：可以使用指甲油或润滑脂密封盖玻片的边缘，以防止样品和封固剂干燥。

使用图 1 所示的方案，从从 14 DAF 的角果收获的发育种子中制备胚乳样品（在此阶段，睾丸仍然是绿色的）。观察到大面积上的大量胚乳细胞及其细胞内结构（图 3A）。在本实验中，使用了在 C 端表达 PHYB 与 GFP 融合的种子 （PHYB-GFP）。众所周知，PHYB 在被红光激活后易位到细胞核并形成 PHYB 阳性斑点，称为光体 （PB），参与种...

通过使用分离的种子组织的遗传和生化分析，例如基因表达分析以及脂质和植物激素的定量，已经揭示了胚乳在种子发芽中的作用 9,14,25,26,27。体外种皮垫料测定，将空种子包（胚乳和 testa）与从不同拟南芥突变体分离的胚胎相结合，?...

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

我们感谢京都大学的 Matsushita 和 Oka 博士提供由 35S 启动子驱动的表达 PHYB-GFP 的 phyB 突变体。这项研究部分得到了创新领域科学研究补助金、拟议研究领域研究（19H05713 至 KY）的支持。