Подготовка интактной ткани для микроскопического анализа клеточного слоя эндосперма в развивающихся и зрелых семенах арабидопсиса

Этот протокол описывает подготовку интактных образцов слоя клеток эндосперма в семенах Arabidopsis thaliana . Метод требует только обычного лабораторного оборудования, такого как инъекционная игла и прецизионные щипцы, и позволяет проводить флуоресцентную визуализацию живых клеток эндосперма с высоким разрешением как в развивающихся, так и в зрелых семенах.

В семенах арабидопсиса эндосперм, один слой живых клеток, расположенный между эмбрионом и семенником, играет решающую роль в регулировании созревания, покоя и прорастания семян. Микроскопический анализ интактных клеток эндосперма имеет важное значение для понимания физиологических функций эндосперма на клеточном и молекулярном уровнях. Тем не менее, подготовка образцов была сложной задачей из-за небольшого размера семян арабидопсиса и расположения слоя эндоспермовых клеток под яичком. В этой статье подробно описывается подготовка образцов слоя интактных эндоспермовых клеток, пригодных для микроскопического наблюдения и анализа как в развивающихся, так и в зрелых семенах. Этот метод позволяет наблюдать большие площади и многочисленные интактные клетки эндосперма без необходимости фиксации или разрезания. Кроме того, в протоколе используется только стандартное лабораторное оборудование, такое как инъекционные иглы, прецизионные щипцы и стереомикроскопы. Этот подход успешно позволяет получать изображения флуоресцентных сигналов с высоким разрешением в живых клетках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), в интактных клетках эндосперма. Этот метод позволяет наблюдать за внутриклеточной локализацией и перемещением различных белков, а также за морфологией органелл в клетках эндосперма различных мутантов Arabidopsis. Этот протокол способствует выяснению новых функций эндосперма и расширяет возможности для клеточных и молекулярных исследований этой важной ткани.

Поскольку растения являются сидячими организмами, прорастание семян является важнейшим событием, определяющим их судьбу. Решение о проращивании строго регулируется как внутренними, так и экологическими факторами, такими как уровень покоя первичного семени, температура, интенсивность света и длина волны, а также концентрация азота 1,2,3,4,5,6. Семена имеют сложную структуру, состоящую из нескольких типов тканей⁷. У Arabidopsis сухими семенами зародыш, который развивается в проросток, окружен одним слоем эндосперма и самым внешним слоем, семенником. Семенник состоит из нескольких слоев мертвых клеток, в то время как эмбрион и эндосперм остаются живыми даже в сухих семенах. Эндосперм обычно рассматривается как резервирующая ткань, которая обеспечивает питательные вещества для роста эмбриона и, вместе с семенником, придает механическую устойчивость к выступу корешка 8,9,10,11,12,13.

Несколько недавних исследований показали, что эндосперм играет важную роль в регулировании оптимального прорастания семян 14,15,16,17. Например, фоторецептор фитохрома B (PHYB) в клетках эндосперма обнаруживает либо красный (R), либо дальний красный (FR) свет, регулируя^{реакцию} прорастания. Эндосперм также функционирует как температурочувствительная ткань, подавляя реакцию прорастания при высоких^{температурах.} Контроль качества эндосперма имеет решающее значение для оптимального прорастания семян, особенно семян длительного хранения¹⁷.

В настоящее время необходима визуализация живых клеток для дальнейшего выяснения физиологических функций эндосперма. Микроскопический анализ интактных клеток эндосперма, экспрессирующих флуоресцентные белки, позволяет исследовать молекулярные механизмы, с помощью которых эндосперм регулирует прорастание семян. Тем не менее, подготовка интактных клеток эндосперма к микроскопическому наблюдению является сложной задачей, особенно в семенах арабидопсиса . Семена имеют диаметр около 0,4 мм, а эндосперм представляет собой одноклеточный слой, расположенный между эмбрионом и семенником, что затрудняет точную манипуляцию. Следовательно, несмотря на его важную физиологическую роль, эндосперм редко наблюдался с помощью визуализации живых клеток.

В данной статье представлен протокол быстрой подготовки образцов слоя интактных эндоспермовых клеток, пригодных для визуализации живых клеток как в развивающихся, так и в зрелых семенах.

В этом исследовании были установлены две различные процедуры для подготовки образцов слоя живых эндоспермовых клеток: одна для развивающихся семян, а другая для зрелых семян. Требуются несколько иные подходы в зависимости от прочности семенника. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов интактного эндосперма из развивающихся семян

1. Коллекция силиков
   1. Выращивайте растения арабидопсиса на почве или минеральной вате до цветения.
   2. Полностью раскрывшиеся цветы пометьте цветными нитками (0 дней после цветения, 0 DAF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования зеленых, желтых или коричневых нитей для обозначения цветов, так как эти цвета трудно отличить от растущих или зрелых растений и силикатов.
   3. Отрежьте отмеченные развивающиеся силики на ножке (показаны на рисунке 1(1)) и соберите их в пробирки объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления по этому протоколу подходят проявочные силики из 12-16 DAF.
2. Вскрытие развивающихся семян
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимо выполнить на влажной фильтровальной бумаге, чтобы защитить образцы от высыхания. Манипуляции следует проводить под стереомикроскопом.
   1. Отделите клапан (показан на рисунке 1(2)) от слива (показан на рисунке 1(1)) с помощью двух щипцов: один с толстыми наконечниками для удержания, а другой с острыми наконечниками для разрыва).
   2. Аккуратно соберите развивающиеся семена из силиков с помощью щипцов с закрытыми кончиками, чтобы не повредить семена (Рисунок 1 (2)).
   3. Удерживая семя щипцами, не раздавливая семя, сделайте рубец размером примерно 0,2 мм на семеннике и эндосперме, окружающем эмбрион, с помощью инъекционной иглы (27 G, 0,40 мм × 19 мм) (рис. 1(3)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное место для создания рубца – на стыке семядолей и корешка.
   4. Вытолкните зародыш, зажав семя щипцами (Рисунок 1(4)). Не раздавливайте пустую оболочку семени, которая состоит из семенника и эндосперма, и старайтесь сохранять ее круглую форму.
   5. Вставьте иглу для инъекций в пустую оболочку с семенами у рубца, прокалывая его изнутри наружу (Рисунок 1(5)).
   6. Удерживайте иглу на месте, поцарапывайте поверхность семенника щипцами с закрытыми кончиками и разрежьте одну сторону пустого конверта с семенами, чтобы он открылся (Рисунок 1 (6)).
   7. Откройте пустой конверт с семенами в лист с помощью щипцов с острыми кончиками (Рисунок 1(7)). Теперь образец должен быть выделен в виде двухслойного листа, состоящего из слоев эндосперма и теста (рис. 1(8)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец имеет тенденцию сворачиваться при использовании воды в качестве монтажной среды на шаге 3 ниже, разделите образец листовой формы на две части. Семена, собранные из силиков при температуре около 18 DAF (на этом этапе семенник коричневый, но еще не полностью высохший), также могут быть обработаны с использованием этого протокола, хотя семена должны быть пропитаны в течение нескольких минут перед подготовкой.

2. Подготовка образцов интактного эндосперма из зрелых семян

1. Пропитка зрелых семян
   1. Добавьте 1 мл дважды дистиллированной воды в 1,5 мл пробирки, содержащей сухие семена арабидопсиса .
   2. Держите семена впитанными не менее 40 минут при комнатной температуре (Рисунок 2 (1)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие семена и семена в течение 40 минут после пропитки трудно оставить в семенах и удалить зародыш изнутри семени, не повреждая пустую оболочку семян в соответствии с шагами 2.2.1 и 2.2.2, в то время как более длительное время пропитывания облегчает манипуляции.
   3. С помощью микропипетки объемом 1000 мкл переложите пропитанные семена на влажную фильтровальную бумагу.
2. Вскрытие зрелых семян
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги необходимо выполнить на влажной фильтровальной бумаге, чтобы защитить образцы от высыхания. Манипуляции следует проводить под стереомикроскопом.
   1. Удерживая семя щипцами, не раздавливая семя, сделайте рубец размером примерно 0,2 мм на семеннике и эндосперме, окружающем эмбрион, с помощью инъекционной иглы (рис. 2(2)).
   2. Вытолкните зародыш, зажав семя щипцами (Рисунок 2(3)). Не раздавливайте пустую оболочку с семенами, в которую входят семенники и эндосперм. Старайтесь сохранять его круглую форму.
   3. Разрежьте верхнюю и нижнюю стороны пустого конверта с семенами с помощью иглы для инъекций, чтобы придать ему форму цилиндра (Рисунок 2(4)).
   4. Разрежьте цилиндрическую пустую оболочку семян по центральной оси, чтобы разделить ее на две части (Рисунок 2(5)). Образцы должны быть выделены в виде двухслойных листов, состоящих из слоя эндосперма и слоя теста (рис. 2(6)).

3. Микроскопическое наблюдение

1. Поместите образцы эндосперма в виде листа на предметное стекло и поместите их в воду или перфтордекалин (PFD).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если между образцом и покровным стеклом остаются пузырьки воздуха, будет полезен перфтордекалин (PFD), который, как сообщается, особенно полезен для визуализации образцов, содержащих воздушные карманы, такие как листья^18,19. Известно, что PFD имеет самое низкое поверхностное натяжение, что позволяет ему легко заполнять воздушные пространства на поверхности образца. Однако для покадровой визуализации рекомендуется использовать воду в качестве монтажной среды, так как содержание воды в зрелых семенах должно быть обильным для поддержания клеточной ликвидности.
2. Аккуратно наденьте на образец покровную крышку. Убедитесь, что слой эндосперма обращен к покровному стеколу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для герметизации краев покровного стекла можно использовать лак для ногтей или смазку, чтобы предотвратить высыхание образца и монтажной среды.

Используя протокол, показанный на рисунке 1, образцы эндосперма готовили из развивающихся семян, собранных из силиков при 14 DAF (на этом этапе семенник еще зеленый). Наблюдались многочисленные клетки эндосперма на большой площади и их внутриклеточные ст...

Роль эндосперма в прорастании семян была выявлена с помощью генетического и биохимического анализа с использованием разделенных тканей семян, такого как анализ экспрессии генов и количественная оценка липидов и фитогормонов 9,14,25,26,27.<...

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Мы благодарим докторов Мацуситу и Оку из Киотского университета за предоставление мутанта phyB , экспрессирующего PHYB-GFP, управляемого промотором 35S. Данное исследование было частично поддержано грантом на научные исследования в инновационных областях, исследования в предлагаемой области исследований (19H05713 to K.Y.).