Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Bu protokol, steril koşulları korurken deneysel tek kafesli izolatörlere (izokafesler) mikropsuz fare transferi ve muhafazası için en iyi uygulamaları açıklar. Mikropsuz farelere dışkı nakli yöntemleri ve daha ileri uygulamalar için bu bağırsak "insanlaştırılmış" farelerden canlı bakterilerin toplanması tartışılmaktadır.

Mikropsuz fareler, mikroorganizmaların konak sağlığı ve hastalığına katkısını anlamak için önemli bir araştırma aracıdır ve bireylerin, tanımlanmış veya karmaşık mikroorganizma gruplarının konak yanıtındaki spesifik rolünün değerlendirilmesini sağlar. Geleneksel olarak esnek film veya yarı sert izolatörlerde yetiştirilen ve yetiştirilen mikropsuz fare yetiştiriciliği ve deneysel manipülasyon maliyetlidir ve hayvan barınma tesislerinde çok sayıda eğitimli personel ve geniş bir alan ayak izi gerektirir. IsoPositive kafesleme sistemi, mikropsuz farelerin bireysel, hava geçirmez şekilde kapatılmış, pozitif basınçlı izolatör kafeslerinde (izokafesler) deneysel manipülasyonuna izin vererek maliyeti düşürür ve deneysel manipülasyonlarda daha fazla esneklik sağlar.

Burada, gelecekteki çalışmalar için stabil uzun vadeli bağırsak "insanlaştırılmış" fareler oluşturmak için mikropsuz farelerin üreme izolatörlerinden izokafeslere aktarılması ve ardından insan donör dışkısından farelere dışkı transferi için bir protokol açıklanmaktadır. Kafesleri, malzemeleri, ekipmanı ve kişisel koruyucu ekipmanı temizlemek için klor dioksit sterilant kimyasal sterilantın kullanımı da dahil olmak üzere, izokafes sisteminin kullanımı için gerekli malzemeler ve hazırlıklar açıklanmaktadır. Transfer edilen farelerin mikropsuz durumunu doğrulama yöntemleri ve kafes sistemindeki kontaminasyonun nasıl belirleneceği tartışılmaktadır. Yatak takımları, yiyecek ve su temini dahil olmak üzere hayvancılık prosedürü daha fazla tartışılmaktadır. Bağırsak "insanlaştırılmış" fareler oluşturmak için insan dışkı bulamacı hazırlama ve mikropsuz farelere gavaj protokolü ve bu farelerin mikrobiyal topluluk bileşimini izlemek için dışkı toplama protokolü açıklanmaktadır. Bir deney, insan dışkı naklinden iki hafta sonra, murin konakçılarında donör mikrobiyotasının stabil kolonizasyonuna izin verdiğini ve daha sonraki deneysel kullanımı mümkün kıldığını göstermektedir. Ayrıca, insanlaştırılmış fare dışkısının canlılık koruma ortamında toplanması ve daha sonraki fonksiyonel deneylerde kullanılmasını sağlayan açıklanmaktadır. Genel olarak, bu yöntemler, daha fazla manipülasyon için deneysel gnotobiyotik kafeslerde insanlaştırılmış fare topluluklarının güvenli ve etkili bir şekilde kurulmasına izin verir.

Mikropsuz fareler, mikrobiyom araştırmacılarının repertuarında önemli bir araçtır ve mikrobiyotanın konakçı sağlığı ve hastalık durumlarındaki katkısını incelemeye izin verir. Mikropsuz fareler tamamen steril doğarlar ve tüm yaşamları boyunca aksenik kalırlar¹. Mikropsuz farelerin spesifik bakteri suşları ile kolonizasyonu, bu taksonlar ile metabolik, bağışıklık veya diğer konakçı fonksiyonları arasında nedensel çalışmalara olanak tanır 2,3,4,5. Özellikle avantajlı olan, insan donörlerinden elde edilen dışkıları naklederek mikropsuz fareleri mikrobiyota düzeyinde "insanlaştırma" ve bariyer koşullarında barındırıldığında murin kaynaklı mikroorganizmalardan kontaminasyonu önleme yeteneğidir¹. Bu yaklaşım, mikrobiyom alanında birçok önemli keşfi mümkün kılmıştır, örneğin, insan bağırsak mikrobiyomunun kanser immünoterapi yanıtı^{üzerindeki etkisi 6,7,8}.

Bununla birlikte, insanlaştırılmış mikropsuz fareler, mikrobiyom alanındaki araştırma çabaları için paha biçilmez olsa da, bu yaklaşımın daha geniş adaptasyonunu engelleyen birçok sınırlama vardır. Mikropsuz fareler, yarı sert veya esnek film büyük izolatörlerde yetiştirilir ve korunur, ancak işlevsel deneyler, birkaç kafesi barındıran ancak yalnızca bir deney koşulu altında olan bir mini izolatör ile ayrı mini izolatörlerin kurulmasını gerektirir. Bu mini izolatör yaklaşımı, bir deneyde araştırılabilecek deney koşullarının sayısını ve paralel olarak çalıştırılabilecek deney sayısını ciddi şekilde sınırlarken, alan ayak izini ve maliyetini artırır. Umut verici bir çözüm, ISOcage P Biyodışlama Sistemi (burada izokafes sistemi olarak anılacaktır) adı verilen bireysel, modüler bir kafes sistemi ^{kullanmaktır9,10}. İzokafes sistemi, mikropsuz farelerin bireysel, hava geçirmez şekilde kapatılmış, pozitif basınçlı izolatör kafeslerinde deneysel olarak manipüle edilmesine izin vererek, her bir mini izolatör yerine her kafes arasında ayrı deneysel koşullar sağlar. Uygun aseptik teknikle, hayvanlar mikropsuz koşullar altında 12 haftaya kadar izokafeslerde barındırılabilir veya herhangi bir uyumlu deneysel yaklaşımda kullanılmak üzere insan dışkı nakli ile insanlaştırılabilir (yani, aseptik koşullar altında gerçekleştirilebilir). İzokafes sistemi kullanılarak birden fazla bağımsız deney paralel olarak yürütülebilir ve alan ayak izi ve maliyeti, mini izolatörler arasında birden fazla deney yapmaktan önemli ölçüde daha düşüktür.

Mikropsuz farelerin esnek film ıslah izolatörlerinde yetiştirilmesinin amacı, aksenik durumu dikkatli bir şekilde korumaktır¹¹. Mikropsuz durumu izlemek için kullanılan teknikler arasında, fare vücut yüzeylerinin ve ağız boşluklarının rutin sürüntülerinin yanı sıra, PCR bazlı ticari tahlillerle hem kültürlenen hem de test edilen dışkı örneklerinin aseptik toplanması yer alır. Bu numunelerin bakteriyel, serolojik ve mantar testlerinin tümü, mikropsuz durumu belirlemek için gereklidir¹¹. Mikropsuz fareler, deneysel kullanım için üreme izolatörlerinden izokafeslere aktarıldığında, fareler sürüntü alınır ve transfer sırasında mikropsuz durumlarını doğrulamak için test edilir. İzokafes sterilite kontrolleri, daha sonra bakteriyel, viral ve fungal kontaminantların tespiti için kültürlenen dışkı örneklerinin aseptik olarak toplanması yoluyla gerçekleştirilir. Bu sterilite kontrollerinin sonuçlarının doğumdan deneysel bir protokolün sonuna kadar dikkatli bir şekilde toplanması ve kaydedilmesi, bu farelerin mikropsuz durumunu doğrulamak için gereklidir.

İzokafes sistemi, ayrı ayrı kafeslerden (Şekil 1), üreme izolatörlerinden taşınmak üzere transfer disklerinden (Şekil 1) ve kafesleri barındıran izokafes rafından (Şekil 2) oluşur. Her izokafes, besleme havası girişine monte edilmiş kafes düzeyinde yüksek verimli partikül hava (HEPA) filtresi ve kapatıldığında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlayan ve kafese hava yoluyla hiçbir kirletici maddenin girmemesini sağlayan bir silikon conta içerir (Şekil 1A). Bu kafes kapağı, sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabini içinde baş aşağı yerleştirildiğinde steril bir çalışma yüzeyi olarak kullanılabilir (Şekil 1A). Kafes içindeki bir tel ızgara yiyecek ve su şişesini tutar (Şekil 1B). Kafes içinde otoklavlanmış forsepsler, iç kafes yüzeyleri ile temas gerektiren tüm manipülasyonlar için kullanılır. Kafesin kendisinde, dışarıdaki hayvanları tanımlamak için çıkarılabilir bir kafes kartı tutucusu için çentikler ve izokafes rafına kenetlenen hava girişi ve dışa aktarma nozulları bulunur (Şekil 1C-E). Güvenli kapatma kelepçeleri ve kapaktaki bir tırnak kilidi, raf sistemine yeniden yerleştirilmeye hazır olduğunda kafesi kapatır (Şekil 1F). Önerilen yatak takımı Alpha-dri'dir ve otoklavlanabilir bir zenginleştirme kulübesi de önerilir (Şekil 1F). Transfer diskleri, mikropsuz fareleri üreme izolatörlerinden izokafeslere taşımak için kullanılır ve hayvanların manipülasyonuna izin vermek için üçgen bir açıklığa sahip dönebilen bir bölme kapağı içerir (Şekil 1G-H). Diskler, her ikisi de sekiz fare kapasitesine sahip küçük (21,6 cm çap) ve büyük (28 cm çap) boyutlarda gelir. Otoklavlanmış bant, sterilant ile ıslatılmadan ve sterilantla ıslatılmış bir torbada taşınmadan önce gerçekleştirilen diskin çevresi ve hava delikleri üzerinde hava geçirmez contalar oluşturmak için kullanılır (Şekil 1I). Raf sisteminin kendisi, sistemin dahil olan özellikleri olan hava üfleyicileri, raf düzeyinde HEPA filtre durumunu ve raf için acil durum pil gücünü izlemek için bir ekrana sahiptir (Şekil 2A). Kapalı bir Magnehelic göstergesi, kafes sistemi tarafından sağlanan pozitif basıncı gösterir ve otomatik bir görsel yanaşma göstergesi, kafeslerin kenetlenme durumunu gösterir (sarı sekme çıkışı, kafesin yerleştirilmediği veya yerleştirmenin başarısız olduğu anlamına gelir) (Şekil 2B-D). İzokafeslerin manipülasyonu için de gerekli olan standart sertifikalı bir biyogüvenlik kabinidir.

Burada sunulan protokol, mikropsuz farelerin aseptik koşullar altında üreme izolatörlerinden izokafeslere başarılı bir şekilde aktarılması için uygun yöntemleri açıklarken, mikropsuz durumu korurken, mikropsuz farelerin insan donörü dışkı bulamacı ile insanlaştırılması ve izokafeste barındırılan farelerden dışkı toplanması ya mikropsuz durumun doğrulanması ya da daha ileri fonksiyonel çalışmalar için canlılığın korunması için. Bu örnekte, mikropsuz fareler, akciğer kanseri için immünoterapi ile tedavi edilen insan deneklerden toplanan dışkı örnekleri ile insanlaştırılır ve tedaviye yanıt veren veya yanıt vermeyen olarak ikiye ayrılır. Bu durumda, immünoterapi yanıtına yanıt fenotipi, bağırsak mikrobiyotası hümanizasyonu ile alıcı farelere aktarıldı, bu fareler daha sonra tümör hücreleri ile daha fazla aşılanabilir ve immünoterapi ile tedavi edilebilir. İnsan dışkı bulamaç protokolü, herhangi bir insan donör dışkısına veya araştırmacının istediği herhangi bir hastalık preklinik modeline kolayca uyarlanabilir. Bu protokolü kullanarak, herhangi bir insan dışkı donör mikrobiyotasını mikropsuz konakçıya aktarmak mümkündür, bu da mikrobiyotanın sağlık ve hastalıktaki rolünün daha fazla araştırılmasını sağlar.

Şekil 1: İzokafes ve transfer disklerinin şematik diyagramı. (A) Kafes kapağının alt tarafının yukarıdan aşağıya görünümü, dahili kafes seviyesi HEPA filtresinin ve silikon conta contasının konumunu gösteren etiketlerle birlikte. (B) Kafesin iç kısmının yukarıdan aşağıya görünümü, tel çubuk kapağını, iç su şişesini ve musluğu ve otoklavlanabilir yemeği tutmak için tel raftaki konumu gösteren etiketlerle. (C) Kafes kartı sahibi için çentikler gösteren kafesin önden görünümü. (D) HEPA filtresinin hava giriş ağzına nasıl takıldığını gösteren, kapağı üstte olan dolu bir kafesin yukarıdan aşağıya görünümü. (E). İzokafes raf sistemine kenetlenen hava girişi ve dışa aktarma nozullarını gösteren kafesin arkadan görünümü. (F) Kapağı üstte olan dolu bir kafesin yandan görünümü, açık konumda güvenli kapatma kelepçelerini gösteren etiketler, her bir kelepçede onları yerine kilitleyen beyaz tırnaklar bulunur. Kafesin iç kısmı, altta katmanlı Alpha-dri yatak takımını ve yatak takımına yerleştirilmiş önerilen zenginleştirme kulübesini gösterir. (G) Üstte kapaklı transfer disklerinin yukarıdan aşağıya görünümü. (H) Hayvanların manipülasyonuna izin vermek için üçgen bir açıklığa sahip dönebilir bölme kapağını gösteren, transfer diskinin iç kısmının yukarıdan aşağıya görünümü. (I) Üreme izolatöründen izokafeye transfer sırasında hava geçirmez bir sızdırmazlık oluşturan otoklavlanmış bandın yerleştirilmesini gösteren tamamen monte edilmiş transfer diskinin yandan görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İzokafes raf sisteminin şematik diyagramı. (A) Kafesler yerleştirilmiş ve hava üfleyici durumu, HEPA filtre durumu ve acil durum bataryası için izleme ekranını gösteren bir etiket ile komple izokafes rafı. Rafın sol alt tarafında, raf düzeyinde HEPA filtresi yuvası bulunur. (B) Raf tarafından sağlanan pozitif basıncı gösteren kapalı Magnehelic göstergesi. (C) Raf ile hava nozulları arasında başarılı bir bağlantı olduğunu gösteren, görünür sarı yanaşma göstergesi olmayan kenetlenmiş bir izokafes. (D) Rafta, rafın yerinde olmadığını ve hava nozullarının bir izokafes ile bağlantısı olmadığını gösteren görünür bir otomatik kenetlenme göstergesi ile boş bir yuva. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tüm hayvan deneyleri, Florida Üniversitesi'ndeki (UF) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve UF Hayvan Bakım Tesislerinde (IACUC Protokolü #IACUC202300000005) gerçekleştirildi. Mikropsuz vahşi tip koloniler (GF WT; C57BL / 6) fareleri, UF Hayvan Bakım Hizmetleri Mikropsuz Bölümü tarafından izolatörlerde yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Karışık cinsiyetli GF WT fareleri, üreme izolatörlerinden transfer edildi ve mikrobiyal manipülasyona izin vermek için ISOcage P Biyodışlama sistemine yerleştirildi.

İnsan dışkı örnekleri, immün kontrol noktası inhibitörü (ICI) tedavisi alan hastalardan uzunlamasına dışkı örnekleri toplayan prospektif bir gözlemsel çalışmadan elde edildi¹². Advarra IRB (MCC # 18611, Pro00017235) tarafından çalışma onayından sonra hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Denekler, fonksiyonel çalışmalar için bakteri canlılığını korumak amacıyla bir sıvı dental taşıma ortamı (LDTM) dışkı toplama kiti aldı ve tamamladı. Yanıt değerlendirmesi, n = 4 örneği yanıtlayıcı ( R ) ve n = 6 örneği yanıt vermeyen (NR) olarak karakterize etti. Homojenize LDTM ile korunmuş hasta örnekleri ayrı ayrı çözüldü, her biri 90 saniyeden fazla olmayan bir anaerobik odaya yerleştirildi ve yanıt fenotipi ile bir araya getirildi ( R : n = 4 , NR: n = 6 ). Toplanan numuneler daha sonra bu protokolde kullanılmak üzere -80 ° C'de ayrıldı ve donduruldu. Donör dışkısının anaerobik koloni oluşturan birimler (CFU) sayımlarını belirlemek için, her deneğin dışkısı seri olarak 1 × ^10-5'e seyreltildi ve her seyreltmenin 10 μL'si anaerobik beyin kalp infüzyonu (BHI) ve Luria Bertani (LB) agar plakaları ve gram dışkı başına CFU sayıları tahmin edildi. Her denekten eşit CFU, farelere gavaj için fekal inokülum örneklerinde toplandı.

1. Kafeslerin hazırlanması ve otoklavlama

1. İzokafes hazırlama
   1. Kafesleri ~ 500 mL 2018SX diyeti veya istenen herhangi bir güçlendirilmiş otoklavlanabilir diyetle önceden doldurun ve tabanı ALPHA-dri yatak takımı ile katmanlayın. Kafes yatağına otoklavlanabilir bir zenginleştirme kulübesi yerleştirin. Tel rafın üzerine boş, sızdırmaz bir su şişesi ve nozulu ve uzun geniş uçlu forseps yerleştirin.
   2. Otoklav döngüsü başına bir kafes içinde yiyeceğe çift tür bir biyolojik indikatör yerleştirin. Her kafesin dışına bir kimyasal entegratör şeridi yerleştirin.
   3. Kafesleri 121 ° C'de 45 dakika ve minimum 15 PSI ve ardından 30 dakika kuruma süresi boyunca bir vakum döngüsünde otoklavlayın. Kafeslerin kapalı kalmasına ve buharın, kafes açılana kadar steril ortamı koruyan dahili HEPA filtreden geçmesine izin veren uluslararası bir Standardizasyon Örgütü (ISO) dekontaminasyon rafı kullanarak kafesleri sterilize edin.
   4. 1 L'lik şişeleri içme suyuyla doldurun, lastik kapaklarla kapatın ve şişenin yüzeyine bir kimyasal entegratör şeridi yerleştirin. 121 °C'de ve 45 dakika boyunca minimum 15 PSI'da otoklav, sıvılar için yavaş egzoz programını kullanarak.
   5. Uygun otoklav parametrelerinin anında doğrulanması için her bir kafese yapıştırılan kimyasal entegratörleri görsel olarak kontrol edin.
      NOT: Biyolojik indikatör, steril koşullar altında izokafesin ilk açılışında çıkarılmalıdır. Biyolojik indikatörü 37 °C'de 24 saat inkübe edin ve herhangi bir renk değişikliğini gözlemleyin. Orijinal mavi/mor berrak çözeltiden sarı veya bulanık bir sıvıya canlı bir renk değişimi, mikrobiyal büyümenin mevcut olduğunu gösterir. Gösterge berrak ve mavi/mor renkte kalırsa, bu, söz konusu otoklav döngüsünde kafeslerin iç kısmının tam sterilitesinin teyididir.

2. Klor dioksit sterilant hazırlığı

DİKKAT: Klor dioksit sterilantı etkinleştirildiğinde son derece aşındırıcıdır. Aktif klor dioksit sterilantı, aktivatörün baz ile karıştırılmasından 24 saat sonra sona erer. Klor dioksit sterilantı, mukozal yüzeyleri tahriş edebilen ve cilt ile temasında tahrişe neden olabilecek dumanlar üretir. Sterilant hazırlama odasının bir lavaboya ve uygun havalandırmaya erişimi olduğundan emin olun. Hayvan barınma tesisi için gerekli kişisel koruyucu ekipmana (KKD) ek olarak klor dioksit sterilantı ile çalışırken koruyucu gözlük, solunum cihazı ve kimyasallara dayanıklı eldivenler takın.

1. Karıştırma tabanı ve aktivatör
   1. Standart 6 L hacimde klor dioksit sterilantı yapmak için, önce 1 L dereceli bir silindirde 1 L klor dioksit sterilant bazını ölçün ve 20 L hacimli bir dunk tankına dökün.
   2. Aynı dereceli silindiri kullanarak, 4 L musluk suyunu ölçün ve smaç tankına dökün.
   3. Taban ve su için kullanılan dereceli silindiri bir kenara koyun. 1 L klor dioksit sterilant aktivatörünü ölçmek için yeni dereceli bir silindir kullanın ve bunu dunk tankına dökün.
   4. Aktivatör tanka eklendikten sonra, tankın içeriğini karıştırmak için dereceli silindiri kullanın.
2. Etkinleştirme
   1. Kapağı dunk tankının üzerine yerleştirin ve aktivatörün eklendiği tarih ve saat ile onu hazırlayan personelin adı ile klor dioksit sterilantı olarak etiketleyin. İstenirse, sterilantı karıştırmak için kullanılan dereceli silindir, 1 L'yi bir sprey şişesine aktarmak için kullanılabilir.
   2. Dunk tankını ve sprey şişelerini, Isocage rafı ve kafeslerinin bulunduğu hayvan barınma odasına taşıyın. Aktif klor dioksit sterilantı, tam aktivasyonu sağlamak için kullanımdan önce en az 20 dakika bekletilmelidir.
      NOT: Büyük miktarlarda kafesi (>9) manipüle etmek için, smaç tankında bir seferde 12 L'ye kadar hazırlanabilir. 1 kafesi manipüle etmek için veya acil durumlarda, 1,2 L klor dioksit sterilantı daha küçük bir kapta hazırlanabilir ve daha sonra 2 1 L sprey şişelerine aktarılabilir. Sterilantın, mikropsuz farelerin beklenen transferinden en az 1 saat önce hazırlanması önerilir.

3. Sterilizasyon

1. Don KKD
   1. Birincil kafes manipülatörü olarak koruyucu gözlük, solunum cihazı, kimyasallara dayanıklı eldivenler, steril bir cerrahi önlük, kabarık, kol kılıfları ve galoşlar giyin. Kumaşın klor dioksit sterilantı ile herhangi bir teması yoğun lekelenmeye neden olacağından, KKD'nin altına fırça giyin.
   2. Birincil kafes manipülatörüne bir asistan önerilir. Asistanın, steril olmayan bir cerrahi önlük giyebilmelerine rağmen, birincil kafes manipülatörü ile aynı KKD'yi giymesini sağlayın.
2. Biyogüvenlik kabininin hazırlanması
   1. Klor dioksit sterilant dunk tankına 10 mendil koyun ve tamamen ıslandıklarından emin olun.
   2. Islatılmış mendilleri biyogüvenlik kabinine taşıyın ve kabinin tüm yüzeylerini arkadan öne doğru şu sırayla ıslatın: düz çalışma yüzeyi, sol taraf, davlumbazın arkası, sağ taraf ve ön iç cam. Biyogüvenlik kabininin korumasız yüzeylerinin temassız ıslatma işlemini, mendilleri bu yüzeylere dokunmadan sıkarak gerçekleştirin.
   3. Bir tur temizlikten sonra, mendilleri ıslatmak için klor dioksit sterilant smaç tankına geri koyun.
3. İzokafeslerin hazırlanması
   1. Dereceli bir silindir kullanarak en az 100 mL klor dioksit sterilantı ile doldurarak büyük bir plastik torba hazırlayın ve tüm iç yüzeylerin ıslandığından emin olmak için torbayı sallayın. Torbayı herhangi bir düz yüzeye yerleştirin.
   2. Raftan tek bir izokafesi çıkarın ve kafesin her yüzeyi sıvı ile temas edecek şekilde klor dioksit sterilant dunk tankına yerleştirin. Tam sıvı temasını sağlamak için kafes yüzeylerini daha fazla ovalamak için tanka batırılmış mendilleri kullanın.
   3. Kafesi ıslattıktan sonra, asistanın ıslatılmış plastik torbayı açmasını sağlayın. Kafesi çantaya yerleştirin ve asistanın hemen açıklığı kapatmasını sağlayın. Sprey şişesini kullanarak torba ağzına klor dioksit sterilantı püskürtün. Kullanılacak her kafes için bu prosedürü izleyin; Tek bir 36" 32" 48" çantaya dört adede kadar kafes sığabilir.
   4. Gerektiği kadar sterilize edilmiş 1 L'lik su şişesini (2 kafes için 1 L su) klor dioksit sterilant dunk tankına daldırın, ardından başka bir ıslatılmış plastik torbaya koyun. Tüm malzemeler torbaya yerleştirildiğinde, torbayı kapatın ve sprey şişesini kullanarak torba ağzına klor dioksit sterilantı püskürtün.
   5. Tüm kafesler ve malzemeler torbalandıktan sonra, kimyasallara dayanıklı eldivenleri klor dioksit sterilantına batırın (açıklığa ulaşmadan eldivenlerin mümkün olduğunca yukarısına).
4. 20 dk sterilizasyon süresi
   1. Tam sterilizasyon en az 20 dakikalık sıvı temas süresi gerektirir. Son ürün sterilize edilir edilmez ve plastik ıslatma torbası kapatılır kapatılmaz, asistanın 20 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlamasını sağlayın. Zamanlayıcı başladıktan sonra kimyasallara dayanıklı eldivenlerin klor dioksit sterilantı ile ıslatılmamış hiçbir yüzeye temas etmediğinden emin olun.
   2. Biyogüvenlik kabini sterilizasyon işlemini (adım 3.2) zamanlayıcı 20 dakika geçtiğini gösterene kadar tekrar tekrar gerçekleştirin.
   3. Asistanın, içindeki kafes ve şişe yüzeyleriyle tutarlı sıvı teması sağlamak için ıslatılmış plastik torbanın dış yüzeylerini sık sık sallamasını sağlayın.
   4. 20 dakikalık süreden sonra, asistanın sterilize edilmiş kafesleri ve su şişelerini ortaya çıkarmak için ıslatılmış plastik torbayı açmasını sağlayın ve torbanın yalnızca dış yüzeylerine dokunmaya dikkat edin.
   5. Sterilize edilmiş kimyasallara dayanıklı eldivenleri kullanarak, her bir kafesi ve şişeyi sterilize edilmiş biyogüvenlik kabinine taşıyın. Biyogüvenlik kabinine sığamayacak kadar çok kafes varsa, plastik torbanın ağzı kapatıldığı ve her açıklık arasında klor-dioksit sterilant ile ıslatıldığı sürece steril kalacağı için kalan kafesleri plastik torbalarda bırakın.

4. Mikropsuz fare aktarımı

1. İzokafeslerin hazırlanması
   1. Hava geçirmez şekilde kapatılmış izokafesi açmak için, kapağın yanlarındaki iki kelepçedeki beyaz tırnakları kaldırın ve ardından her bir kelepçeyi yanlara doğru çekin. Kapağın kafesten kaldırılması için kapağın kafesin alt kısmından serbest olması gerekir. Kapağı kafesin soluna baş aşağı yerleştirin ve bunu steril bir iş istasyonu olarak kullanın.
      NOT: Kafes kapaklarını veya otoklavlanmış alet çantalarının içini steril bir çalışma yüzeyi olarak kullanmanın bir alternatifi, daha geniş bir yüzey alanı sağlayan ve bir hata yapılması durumunda kafes kapağının kasıtsız olarak kirlenmesini önleyen otoklavlanmış perdelerin kullanılmasıdır.
   2. Tel rafın üstündeki kafesin içinde bulunan steril forsepsleri kullanarak boş su şişesini çıkarın ve kapağın içine yerleştirin. Lastik contayı çıkararak 1 L'lik su şişesini açın ve doldurmak için suyu su şişesine dökün. Forseps kullanarak nozulu su şişesinin üzerine yerleştirin ve sızdırmaz hale getirmek için sıkıca bastırın.
   3. Tel ızgarayı kaldırmak için steril forseps kullanın ve kafesin dibine bir açıklık sağlamak için birkaç inç geri ayarlayın. Steril forsepsleri tel ızgara üzerine yerleştirin ve tutamakların kafes yüzeyleriyle temas etmediğinden emin olun.
2. Aktarım diski kullanımı
   NOT: Yetiştirme izolatörlerinin bakım ve bakımından eğitimli mikropsuz personel sorumludur. Üreme izolatörlerinin açılmasıyla ilgili riskler göz önüne alındığında, bu personel transfer diski sterilizasyonunu, hazırlanmasını ve mikropsuz farelerin izolatörlerden izokafeslere transferini gerçekleştirir. İşlemi kısaca anlatmak gerekirse, transfer diskleri sterilizasyona izin vermek için otoklavlanabilir bir silindir içinde hazırlanır. Sterilitelerini doğrulamak için biyolojik indikatörler kullanılır. Transfer disklerini kapatmak için kullanılan bant, silindirin içinde de otoklavlanır. Bu malzemeleri çevreleyen sterilize edilmiş silindir, bir transfer manşonu vasıtasıyla izolatöre bağlanır ve fareler kafeslerden diske taşınır. Kapak daha sonra diskin üzerine yerleştirilir ve diskin çevresi ve hava delikleri üzerinde hava geçirmez bir sızdırmazlık oluşturmak için otoklavlanmış bant kullanılır. Mühürlü disk hemen izolatörün çıkış portuna yerleştirilir. Ev izolatörünün port kapağı daha sonra kapatılır ve diskin dışı sterilant ile iyice temizlenir ve sterilantla ıslatılmış bir torbaya yerleştirilir, tam dekontaminasyonu sağlamak için 20 dakika boyunca izlenir. Mikropsuz üreme personeli daha sonra bu diskleri çalışma personeline teslim eder. Fareler, aktarım diskinin mühürlendiği andan itibaren 30 dakikadan daha uzun süre mühürlü diskte tutulamaz, bu nedenle bu protokoldeki önceki tüm adımların, aktarım diskinin gelmesinden önce yeterli süre içinde tamamlanmış olması önemlidir.
   1. Aktarım diskini aldıktan sonra, asistanın plastik kapağı tutmasını ve kısmen açmasını sağlayın, böylece transfer diskinin ıslatılmış yüzeyi açıkta kalır, ancak asistan tarafından dokunulmaz.
   2. Aktarım diskini aldıktan sonra, asistanın plastik kapağı tutmasını ve kısmen açmasını sağlayın, böylece transfer diskinin ıslatılmış yüzeyi açıkta kalır, ancak asistan tarafından dokunulmaz.
   3. Klor dioksit sterilantına batırılmış kimyasallara dayanıklı eldivenleri giyerek, sterilanta batırılmamış herhangi bir yüzeye dokunmamaya dikkat ederek transfer diskini plastik ambalajdan çıkarın. Ardından, transfer diskini sterilize edilmiş biyogüvenlik kabininin düz yüzeyine yerleştirin.
   4. Aktarım diskini açmak için bandı soyun, disk çevresini kapatın ve biyogüvenlik kabininin dışına atın. Aktarım diskinin kapağını çıkarın ve biyogüvenlik kabininin dışına atın.
   5. Aktarım diskinin içinde tek bir açıklığı olan dönebilen bir bölme kapağı bulunur. Aktarım için gereken fareye açıklığı hareket ettirmek için bu bölme kapağını manipüle etmek için daha önce kafesin tel rafına yerleştirilmiş steril forsepsleri kullanın.
3. Farelerin diskten izokale aktarılması
   1. Forsepsleri kullanarak, farenin kuyruğunun tabanını plastik disk kapağındaki açıklıktan kavrayın ve fareyi daha önce tel ızgara ile kafes arasında açılan boşluktan kaldırın ve izokafese aktarın. Bu kafese yönelik tüm fareler için tekrarlayın.
   2. Tüm fareler bu izokafeye aktarıldıktan sonra, forseps kullanarak tel ızgarayı değiştirin. Ardından kafes kapağını kaldırın ve forseps kullanarak kafesin üzerine geri yerleştirin.
   3. Kafes kapağının her bir kelepçesini yukarı kaldırın ve kafesin yanlarına dikkatlice indirin, ardından kafes kapağını kapatmak için beyaz tırnakları aşağı doğru itin.
   4. Kafes kapatıldıktan sonra, asistanın yerleştirme alanının her bir nozuluna kafes rafına klor dioksit sterilantı püskürtmesini sağlayın. Ardından, kafesi davlumbazdan çıkarın ve daha sonra kafesi rafa yerleştirebilecek olan asistana iletin.
   5. Aktarım diskindeki her fare için bu adımları yineleyin.
4. Biyogüvenlik kabininin temizlenmesi
   1. Tüm fare transferlerinin izokafeye dönüştürülmesi tamamlandıktan sonra, herhangi bir kalıntının kapağını boşaltın ve klor dioksit sterilantla ıslatılmış mendillerle tamamen silin.
   2. Kalan klor dioksit sterilanını çıkarmak için davlumbazı izopropil alkolle silin. Davlumbazın çalışma yüzeyinin altındaki boşluk, sterilizasyon işleminden büyük miktarda sterilant toplar. Bunu kuru mendille emilim yoluyla çıkarın ve izopropil alkol ile silin.
   3. Sıvı klor dioksit sterilantını aktivasyondan 24 saat sonra lavabo tahliyesi yoluyla atın. Sterilant ile kontamine olmuş katı malzemeleri normal atık olarak atın.
      NOT: İzokafes koşullarına aktarılan mikropsuz fareler, herhangi bir müdahale öncesinde yeni ortamlarına alışmaları için 1 hafta bekletilir. Bu, hayvanların yaşadığı stresi azaltır ve bu da çalışma sonuçlarına müdahale edebilir. Bu 1 haftalık alışma süresinin sonunda, herhangi bir müdahaleden önce mikropsuz durumu doğrulamak için 6. adımda anlatıldığı gibi dışkı toplayın.

5. İnsan dışkı bulamacının mikropsuz farelere oral gavajı

1. Otoklavlanmış gavaj malzemelerinin hazırlanması
   1. Oral gavaj işleminden 1 gün önce oral gavaj iğnelerini kendinden sızdırmaz sterilizasyon poşetlerine (fare başına 1 adet) ve steril 1 mL şırıngaları kendinden sızdırmaz sterilizasyon poşetlerine (fare başına 1 adet) yerleştirin. Bunları ve 600 mL polipropilen beherleri (fare başına 1 adet) ve bir çift uzun forseps'i otoklav güvenli bir torbaya koyun ve otoklav ile sterilize edin.
   2. Torbayı otoklavdan çıkardıktan hemen sonra, torbayı ambalaj bandı ile kapatın ve ertesi güne kadar saklayın.
2. İnsan dışkı bulamacının hazırlanması
   1. Gavaj gününde, homojenize edilmiş ve anaerobik koruma ortamında (bu örnekte Sıvı Dental Taşıma Ortamı) saklanan insan dışkısını -80 °C dondurucudan anaerobik odaya aktarın. Homojenize dışkı materyalini 10 mL'lik konik bir tüpte steril, anaerobik tuzlu su çözeltisi içinde yaklaşık 1:10 oranında seyreltin.
   2. İnsan dışkı bulamacını içeren tüpü parafilm ile kapatın, girdapla homojenize edin ve ardından partikülleri çökeltmek için 5 dakika boyunca 200 g'da santrifüjleyin.
   3. Tüpü anaerobik odaya geri yerleştirin ve süpernatanı başka bir 10 mL konik tüpe aktarın. İnsan dışkı süpernatantı içeren tüpü parafilm ile kapatın, anaerobik odadan çıkarın ve ikincil bir sızdırmaz kaba koyun. Konteynırı, otoklavlanmış gavaj malzemeleri torbası ile birlikte hayvan barınağı konumuna taşıyın.
      NOT: Raporlama amacıyla gavaj amaçlı insan dışkısının toplam CFU/mL'sini tahmin etmek önemlidir. Yeterli kolonizasyonu sağlamak için minimum CFU yükünün ne olduğu belirsizdir, ancak daha yüksek CFU'lar donör dışkısının daha iyi aşılanmasına yol açar¹³. İnsan dışkı materyalinin CFU yükü düşük aşılama oranlarına neden oluyorsa, insan dışkı örneklerini hatırlayın. Bir canlılık koruma ortamının kullanılması, toplanan dışkı örneklerinden CFU geri kazanımını artıracaktır. Donör dışkısının anaerobik / aerobik CFU sayımlarını belirlemek için, numuneyi seri olarak 1 x ^10-5'e seyreltin ve aerobik ve anaerobik BHI ve LB agar plakaları üzerinde iki kopya halinde her seyreltmenin 10 μL'sini plakalayın. 24 saat (aerobik) ve 48 saat (anaerobik) sonra, dışkı gramı başına CFU'yu sayın.
3. İzokafeslerin hazırlanması
   1. Adım 2 ve 3'ü tekrarlayın, şimdi tek fark bu kafeslerde farelerin bulunmasıdır ve rafın çıkarılmasından sonraki 30 dakika içinde her bir izokafesin sterilize edilmiş davlumbaza yerleştirildiğinden ve kapağın farelere hava akışına izin vermek için havalandırıldığından emin olmak için özen gösterilmelidir.
   2. Otoklavlanmış gavaj malzemesi torbasını ve insan dışkı bulamaç tüpünü 5.1 ve 5.2 adımlarından klor dioksit sterilant doygunluğu yoluyla su şişelerine benzer şekilde sterilize edin (yani, sterilanta batırın ve ardından sterilantla ıslatılmış bir torbaya koyun).
   3. 20 dakikalık sterilizasyon süresinin tamamlanmasının ardından izokafesleri ve oral gavaj malzemelerini biyogüvenlik kabinine aktarın. Torbayı içinde bulunan uzun forsepslere doğru iterek otoklavlanmış tedarik torbasını delin ve ardından malzemeleri çıkarın ve torbayı kaputun dışına atın.
4. Gavaj
   1. Artık klor dioksit sterilantının farelerle temas etmesini önlemek için kimyasallara dirençli eldivenler yerine yeni bir steril cerrahi önlük ve steril cerrahi eldiven giyin. Gerekirse asistanın bu süreçte yardım etmesini sağlayın.
   2. Her bir sterilizasyon poşetini açarak gavaj iğnelerini hazırlayın ve poşetin içini kuru, steril bir dinlenme yüzeyi olarak kullanın. Gavaj iğnesini her bir şırıngaya bağlayın, dışkı bulamaç tüpünü açın ve her şırıngaya 200 μL dışkı bulamacı çekin.
   3. Forseps kullanarak, kafesteki tek bir farenin kuyruğunun tabanını kavrayın ve tel rafın üzerine yerleştirin. Fareyi sürterek nazikçe tutun ve fareyi dik dikey konumda tutarken iğneyi yerleştirin ve dışkı bulamacını nazikçe enjekte edin, ardından iğneyi hemen çıkarın.
   4. Fareyi gözlem için doğrudan sterilize edilmiş kaplardan birine yerleştirin. Kafesteki her fare için işlemi tekrarlayın. Tüm fareler gavajı aldıktan sonra, her fareyi kafes yatağına geri taşımak için forsepsleri kullanın ve 4.3.2-4.3.4 adımlarında açıklandığı gibi kafesi kapatın.
      NOT: İki veya daha fazla ayrı dışkı bulamacının kullanıldığı durumlarda, biyogüvenlik kabininin ve gerekli kafes ve malzemelerin tamamen yeniden sterilizasyonu gereklidir. Bir grup farenin mikropsuz kaldığı durumlarda, bu farelerin başka herhangi bir grup tedavi edilmeden önce kontrol gavajlarını almaları önerilir.
   5. Klor dioksit sterilant ve sterilant ile ıslatılmış malzemeleri atmak için adım 4.4'teki prosedürü izleyin. İnsan dışkı bulamacı ile kontamine olmuş tüm malzemeleri biyomedikal atık olarak değerlendirin ve bunları çevre sağlığı ve güvenliği prosedürlerine göre atın.

6. Canlılığın korunması için insanlaştırılmış farelerden dışkı toplama

1. Otoklavlanmış malzemeleri hazırlayın
   1. Kısa geniş uçlu forsepsleri kendinden sızdırmaz sterilizasyon torbalarına (fare başına 1 adet), 600 mL polipropilen beherlere (fare başına 1 adet) ve bir çift uzun forsepsleri otoklav güvenli bir torbaya yerleştirin ve dışkı toplama işleminden 1 gün önce otoklav ile sterilize edin.
   2. Torbayı otoklavdan çıkardıktan hemen sonra, torbayı ambalaj bandı ile kapatın ve ertesi güne kadar saklayın.
2. Koruma ortamı tüpünün hazırlanması
   1. Bir anaerobik canlılık koruma ortamı seçin (burada Cary Blair kullanılmıştır). 1 mL koruma ortamını steril, vidalı kapaklı 2 mL'lik tüplere bir biyogüvenlik kabininde koyun. Optimum koruma için 1:10 dışkı:ortam oranı önerilir.
   2. Her tüpü kalıcı bir işaretleyici ile önceden etiketleyin, ancak klor dioksit sterilantına maruz kalmanın plastik yüzeylerden kalıcı işaretleyici etiketleri çıkarabileceğini unutmayın. Diğer bir yöntem, tüpleri etiketsiz bırakmak ve dondurmadan önce tüpleri topladıktan hemen sonra yardımcı etiketli tüplere sahip olmaktır.
   3. Klor dioksit sterilantı ile temas ederek sterilizasyonu sağlarken, tüplerin dik olarak saklanmasına izin vermek için bu tüpleri standart bir polipropilen tüp rafına yerleştirin.
3. Sterilizasyon kafesleri ve biyogüvenlik kabini
   1. İzokafesleri ve biyogüvenlik kabinini sterilize etmek için 2. ve 3. adımları tekrarlayın. Yine, rafın çıkarılmasından sonraki 30 dakika içinde, her bir izokafesin sterilize edilmiş davlumbaza yerleştirildiğinden ve farelere hava akışına izin vermek için kapağın havalandırıldığından emin olun.
   2. Ek olarak, hazırlanan tüpleri içeren otoklavlanmış besleme torbasını ve rafını klor dioksit sterilant doygunluğu ile sterilize edin ve bunları kafesleri içeren ıslatılmış plastik torbaya yerleştirin. Amaç, her bir tüpün tüm yüzeyleri ve rafın kendisi ile tam sıvı temasıdır.
4. Dışkı örneği toplama ve saklama
   1. 20 dakikalık sterilizasyon süresinin tamamlanmasının ardından izokafesleri, otoklavlanmış malzemeleri ve tüp rafını biyogüvenlik kabinine aktarın. Torbayı içinde bulunan uzun forsepslere doğru iterek otoklavlanmış tedarik torbasını delin, malzemeleri çıkarın ve torbayı kaputun dışına atın.
   2. Artık klor dioksit sterilantının farelerle temas etmesini önlemek için kimyasallara dirençli eldivenler yerine yeni bir steril cerrahi önlük ve steril cerrahi eldiven giyin. İsterseniz asistanın bu süreçte yardımcı olmasını sağlayın.
   3. Torbaları açarak ve iç torba yüzeyini steril bir alan olarak kullanarak künt uçlu forsepsleri hazırlayın. Tüp rafını biyogüvenlik başlığının yüzeyine yerleştirin.
   4. Uzun forseps kullanarak, kafesteki tek bir farenin kuyruğunun tabanını kavrayın ve gözlem için doğrudan sterilize edilmiş kaplardan birine yerleştirin. Kafesteki her fare için bu işlemi tekrarlayın.
   5. En az iki taze geçirilmiş dışkı peleti üretilene kadar fareleri gözlemleyin.
      1. Künt uçlu forsepsleri kullanarak dışkı topaklarını alın ve doğrudan tüpe yerleştirin. Vidalı kapak kapağını hemen kapatın ve asistana iletin.
      2. Asistanın tüpü etiketlemesini sağlayın ve dışkıyı girdap yoluyla hemen homojenize edin. Homojen hale geldikten sonra, tüpü sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.
   6. Kafesteki her fare için dışkı toplama işlemini tekrarlayın. Dışkı toplandıktan sonra her fareyi ev kafesine yerleştirin ve kafesleri raflarına yeniden yerleştirin. Davlumbazı temizlemek ve atıkları atmak için adım 4.4'ü tekrarlayın.

ICI yanıtlayıcı ve yanıt vermeyen fenotip (daha önce protokolde açıklanmıştır) tarafından toplanan insan dışkı örnekleri, grup başına 3 izokafeste barındırılan karışık cinsiyetli GF-WT farelerine gavaged edildi (n = 1-2 fare / kafes, n = 6 yanıtlayıcı için ve n = 5 yanıt vermeyenler için). Farelerin transferden sonra 1 hafta boyunca alışmalarına izin verildi. Daha sonra bu farelerden dışkı örnekleri toplandı (mikropsuz koşullar). Fareler daha sonra 1...

Burada açıklanan protokol, deneysel izokafeslerde barındırılan mikropsuz farelerin insanlaştırılması için tekrarlanabilir, oldukça ayrıntılı bir yöntem sağlar. Dışkı topluluklarını insan deneklerden murin konakçılarına özel olarak nakletme yeteneği, mikrobiyom araştırmaları için paha biçilmezdir. Fareye özgü kommensal mikrobiyota kontaminasyonu olmadan, insanda yaşayan bakterilerin çeşitli sağlık ve hastalık durumları üzerindeki etkisi veya diyet ...

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar, gnotobiyotik yetiştiriciliğe yardımcı oldukları için UF Hayvan Bakım Hizmetleri'nin Mikropsuz Hizmetler Bölümü'ne, veterinerlik ve IACUC yardımı için Dr. Brooke Bloomberg ve Dr. Laura Eurell'e ve 16S rRNA gen dizilimi ile ilgili yardım için Josee Gauthier'e minnettardır. Bu araştırma, kısmen, UF Sağlık Kanser Merkezi Fonları (CJ) ve UF Tıp Bölümü Gatorade Fonu (CJ) tarafından desteklenmiştir. R.Z.G., UF Sağlık Kanser Merkezi fonları tarafından desteklenmiştir. R.C.N., Florida Üniversitesi'nde (TL1TR001428, UL1TR001427) Ulusal Sağlık Enstitüleri TL1 Eğitim Bursu, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Ekip Tabanlı Disiplinlerarası Kanser Araştırma Programı ödülü T32CA257923 ve UF Sağlık Kanser Merkezi tarafından desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, kısmen Fla. Stat. § 381.915 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Kanser Enstitüsü P30CA247796 Ödül Numarası altında. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Florida Eyaleti'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.