Подготовка и проведение эксперимента по биоисключающей изопозитивной клетке для трансплантации фекалий человека стерильным мышам

В этом протоколе описаны передовые методы переноса стерильных мышей в экспериментальные однокамерные изоляторы (изокаги) и их содержания в них при сохранении стерильных условий. Обсуждаются методы трансплантации фекалий у стерильных мышей и сбор жизнеспособных бактерий из этих кишечных «гуманизированных» мышей для дальнейшего применения.

Стерильные мыши являются важным исследовательским инструментом для понимания вклада микроорганизмов в здоровье и заболевание хозяина, позволяя оценить специфическую роль индивидуумов, определенных или сложных групп микроорганизмов в ответе хозяина. Традиционно разводимые и выращиваемые в гибких пленочных или полужестких изоляторах, стерильное содержание мышей и экспериментальные манипуляции являются дорогостоящими и требуют большого количества обученного персонала и большой площади в помещениях для содержания животных. Система клеточного сопровождения IsoPositive позволяет проводить экспериментальные манипуляции с стерильными мышами в индивидуальных, герметично закрытых изоляторных клетках с положительным давлением (изокаги), снижая затраты и обеспечивая большую гибкость в экспериментальных манипуляциях.

Здесь описан протокол переноса стерильных мышей из селекционных изоляторов в изокагии и последующего переноса фекалий из стула донора человека мышам для создания стабильных «гуманизированных» мышей в кишечнике в долгосрочной перспективе для будущих исследований. Описаны материалы и подготовка, необходимые для использования изокажной системы, включая использование химического стерилизатора на основе диоксида хлора для очистки клеток, принадлежностей, оборудования и средств индивидуальной защиты. Обсуждаются методы подтверждения стерильного статуса перенесенных мышей и способы определения контаминации в клеточной системе. Далее обсуждается порядок ведения домашнего хозяйства, включая подстилку, питание и водоснабжение. Описан протокол приготовления фекальной суспензии человека и зондирования у стерильных мышей для создания кишечных «гуманизированных» мышей, а также сбор кала для мониторинга состава микробного сообщества этих мышей. Эксперимент показывает, что через две недели после трансплантации фекалий человека обеспечивается стабильная колонизация донорской микробиоты в организме мышей-хозяев, что позволяет использовать ее в последующих экспериментах. Кроме того, описан сбор гуманизированных мышиных фекалий в носители для сохранения жизнеспособности, что позволяет использовать их в дальнейших функциональных экспериментах. В целом, эти методы позволяют безопасно и эффективно создавать гуманизированные сообщества мышей в экспериментальных клетках с гнотобиотиками для дальнейших манипуляций.

Стерильные мыши являются важным инструментом в репертуаре исследователей микробиома, позволяя анализировать вклад микробиоты в здоровье хозяина и состояние болезни. Стерильные мыши рождаются полностью стерильными и остаются аксеничными в течение всей своей жизни¹. Колонизация стерильных мышей специфическими бактериальными штаммами позволяет проводить исследования причинно-следственных связей между этими таксонами и метаболическими, иммунными или другими функциями хозяина 2,3,4,5. Особенно выгодной является возможность «гуманизации» стерильных мышей на уровне микробиоты путем трансплантации фекалий, полученных от доноров-людей, и при размещении в барьерных условиях предотвращать заражение микроорганизмами, полученными от мочи¹. Этот подход позволил сделать много важных открытий в области микробиома, например, влияние микробиома кишечника человека на ответ иммунотерапии рака ^6,7,8.

Однако, в то время как гуманизированные стерильные мыши бесценны для исследовательских усилий в области микробиома, существует множество ограничений, которые препятствуют более широкой адаптации этого подхода. Стерильных мышей разводят и содержат в полужестких или гибких пленочных больших изоляторах, но функциональные эксперименты требуют установки отдельных мини-изоляторов, причем один мини-изолятор содержит несколько клеток, но только при одном экспериментальном условии. Такой подход с использованием мини-изоляторов увеличивает занимаемое пространство и стоимость, при этом строго ограничивая количество экспериментальных условий, которые могут быть исследованы в эксперименте, и количество экспериментов, которые могут быть проведены параллельно. Многообещающим решением является использование индивидуальной модульной системы кейтинга, называемой системой биоисключения ISOcage P (здесь именуемой системой изокага)^9,10. Система изокаге позволяет проводить экспериментальные манипуляции с стерильными мышами в индивидуальных, герметично закрытых клетках с положительным давлением, создавая отдельные экспериментальные условия между каждой клеткой, а не между каждым мини-изолятором. При правильной асептической технике животные могут быть размещены в изокажах на срок до 12 недель в условиях, свободных от микробов, или гуманизированы путем трансплантации фекалий человека для использования в любом совместимом экспериментальном подходе (т.е. могут быть выполнены в асептических условиях). С помощью системы изокаж можно параллельно проводить несколько независимых экспериментов, при этом занимаемая площадь и стоимость значительно меньше, чем при проведении нескольких экспериментов в мини-изоляторах.

Целью разведения стерильных мышей в изоляторах для разведения с гибкой пленкой является бережное сохранение аксенического статуса¹¹. Методы, используемые для мониторинга отсутствия микробов, включают рутинные мазки с поверхностей тела мышей и полостей полости рта, а также асептический сбор образцов кала, которые культивируются и тестируются с помощью коммерческих анализов на основе ПЦР. Бактериальное, серологическое и грибковое тестирование этих образцов необходимо для определения стерильного статуса¹¹. Когда стерильных мышей переводят из гнездовых изоляторов в изокагии для экспериментального использования, у мышей берут мазки и тестируют, чтобы подтвердить их статус стерильных мышей при переносе. Проверки стерильности изокажа проводятся путем асептического сбора образцов кала, которые затем культивируются для обнаружения бактериальных, вирусных и грибковых загрязнителей. Тщательный сбор и запись результатов этих проверок на стерильность с рождения до конца экспериментального протокола необходимы для подтверждения стерильного статуса этих мышей.

Изокажная система состоит из отдельных клеток (Рисунок 1), передаточных дисков для транспортировки из изоляторов для разведения (Рисунок 1) и стойки изокажа, в которой размещаются клетки (Рисунок 2). Каждый изокаж содержит высокоэффективный фильтр воздуха для твердых частиц (HEPA) на уровне клетки, установленный на заборе приточного воздуха, и силиконовую прокладку, которая обеспечивает герметичное уплотнение при закрытии, гарантируя, что загрязняющие вещества не могут попасть в клетку по воздуху (Рисунок 1A). Эту крышку клетки можно использовать в качестве стерильной рабочей поверхности, если поместить ее вверх ногами в стерилизованный шкаф биобезопасности (Рисунок 1A). Проволочная решетка внутри клетки удерживает бутылку с едой и водой (рис. 1B). Щипцы, автоклавированные внутри кейджа, используются для всех манипуляций, требующих контакта с внутренними поверхностями кейджа. Сама клетка имеет выемки для съемного держателя карты клетки для идентификации животных снаружи и забор воздуха и экспортные форсунки, которые стыкуются в стойку изокажа (рисунок 1C-E). Предохранительные зажимы и фиксатор на крышке герметизируют клетку, когда она готова к повторной установке на стеллажную систему (рис. 1F). Рекомендуется использовать подстилку Alpha-dri, а также автоклавируемую будку для обогащения (Рисунок 1F). Передаточные диски используются для перемещения стерильных мышей из изоляторов для разведения в изокагии и содержат вращающуюся крышку отсека с треугольным отверстием, позволяющую манипулировать животными (рис. 1G-H). Диски бывают небольших размеров (диаметр 21,6 см) и больших (диаметр 28 см), оба из которых вмещают восемь мышей. Автоклавная лента используется для создания герметичных уплотнений по окружности и вентиляционным отверстиям диска, что выполняется перед замачиванием стерилизатором и транспортировкой в пакете, пропитанном стерилизатором (рис. 1I). Сама стоечная система имеет экран для контроля воздуходувок, состояния фильтра HEPA на уровне стойки и аварийного питания батареи для стойки, которые входят в состав системы (рис. 2A). Закрытый магнехельный манометр отображает положительное давление, поддерживаемое системой каркаса, а автоматический визуальный индикатор стыковки показывает состояние стыковки сепараторов (желтая вкладка означает, что клетка не стыкуется или стыковка не была выполнена) (Рисунок 2B-D). Также необходимым для манипуляций с изокагами является стандартный сертифицированный шкаф биобезопасности.

Представленный здесь протокол описывает надлежащие методы для успешного переноса стерильных мышей из селекционных изоляторов в асептических условиях в изокагии с сохранением стерильного статуса, гуманизации стерильных мышей с помощью суспензии из фекалий донора человека, а также сбора кала у мышей, размещенных в изокаге, для подтверждения бесмикробного статуса или сохранения жизнеспособности для дальнейших функциональных исследований. В этом примере стерильные мыши гуманизируются с помощью объединенных образцов фекалий людей, получавших иммунотерапию по поводу рака легких, и дихотомизируются как отвечающие или не реагирующие на терапию. В этом случае фенотип ответа на ответ иммунотерапии был передан путем гуманизации микробиоты кишечника мышам-реципиентам, которых затем можно было дополнительно инокулировать опухолевыми клетками и лечить иммунотерапией. Протокол забора фекальной суспензии человека может быть легко адаптирован к любому фекалиям донора человека или к любой доклинической модели заболевания, которую пожелает исследователь. С помощью этого протокола можно перенести любую фекальную донорскую микробиоту человека в организм стерильного хозяина, что позволяет дополнительно изучить роль микробиоты в здоровье и болезнях.

Иллюстрация 1: Принципиальная схема изокажных и передаточных дисков. (A) Вид сверху вниз на нижнюю сторону крышки сепаратора с этикетками, указывающими на расположение внутреннего HEPA-фильтра на уровне клетки и силиконового уплотнения прокладки. (B) Вид сверху вниз на внутреннюю часть клетки, с этикетками, указывающими на крышку проволочной решетки, внутреннюю бутылку с водой и носик, а также расположение в проволочной решетке для хранения автоклавируемого чау. (C) Вид каркаса спереди с вырезами для держателя карточки каркаса. (D) Вид сверху вниз на полную клетку с крышкой сверху, показывающий, как фильтр HEPA установлен на сопле забора воздуха. (E). Вид каркаса сзади, показывающий воздухозаборные и экспортные форсунки, которые стыкуются с системой изокажных стоек. (F) Вид сбоку на полную клетку с крышкой наверху, с этикетками, указывающими на зажимы для безопасного закрытия в открытом положении, с белыми выступами на каждом зажиме, которые фиксируют их на месте. Внутри клетки видна подстилка Alpha-dri, расположенная на дне, и предполагаемая хижина для обогащения, помещенная в подстилку. (G) Вид сверху вниз на передаточные диски с крышкой сверху. (H) Вид сверху вниз на внутреннюю часть передаточного диска, показывающий вращающуюся крышку отсека с треугольным отверстием, позволяющим манипулировать животными. (I) Боковой вид полностью собранного передаточного диска с размещением автоклавной ленты, которая создает герметичное уплотнение во время переноса из изолятора для разведения в изокаж. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Принципиальная схема системы изокажных стоек. (A) Комплектная изокажная стойка с пристыкованными клетками и этикеткой, указывающей на экран мониторинга состояния воздуходувки, состояния фильтра HEPA и аварийной батареи. В нижней левой части стойки находится прорезь для HEPA-фильтра на уровне стойки. (B) Закрытый магнехельный манометр, показывающий положительное давление, поддерживаемое штативом. (C) Пристыкованный изокаж без видимого желтого индикатора стыковки, демонстрирующий успешное соединение между стойкой и воздушными форсунками. (D) Пустая прорезь в стойке с видимым автоматическим визуальным индикатором стыковки, указывающим на отсутствие стойки и соединение воздушных форсунок с изокажем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Флориды (UF) и проводились в учреждениях по уходу за животными UF (протокол IACUC #IACUC202300000005). Колонии стерильного безмикробного дикого типа (GF WT; C57BL/6) мышей разводили и содержали в изоляторах подразделением UF Animal Care Services Sterm-free Division. Мыши смешанного пола GF WT были переведены из селекционных изоляторов и помещены в систему биоисключения ISOcage P для проведения микробных манипуляций.

Образцы фекалий человека были получены в ходе проспективного обсервационного исследования, в ходе которого были собраны продольные образцы стула пациентов, получавших лечение ингибиторами контрольных точек иммунного ответа (ИК)¹². Информированное согласие пациентов было получено после одобрения исследования Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Испытуемые получили и заполнили набор для сбора кала с жидкой стоматологической транспортной средой (LDTM), предназначенный для сохранения жизнеспособности бактерий для функциональных исследований. Оценка ответа характеризовала n=4 выборки как ответившие (R) и n=6 как не ответившие (NR). Гомогенизированные образцы пациентов, сохраненные с помощью LDTM, были индивидуально разморожены, каждый помещен в анаэробную камеру не более чем на 90 с и объединен по фенотипу ответа (R: n = 4, NR: n = 6). Затем объединенные образцы были аликвотированы и заморожены при -80 °C для использования в этом протоколе. Для определения количества анаэробных колониеобразующих единиц (КОЕ) в фекалиях донора кал каждого субъекта последовательно разбавляли до 1 × ^10-5, и 10 мкл каждого разведения покрывали в двух экземплярах на агаровых тарелках анаэробной инфузии сердца мозга (BHI) и агаровых пластинах Лурии Бертани (LB) и оценивали количество КОЕ на грамм стула. Равные КОЕ от каждого субъекта были объединены в образцы фекального инокулюма для зондирования мышам.

1. Подготовка клеток и автоклавирование

1. Препарат изокаж
   1. Предварительно заполните клетки ~500 мл диеты 2018SX или любой желаемой обогащенной автоклавируемой диеты и покройте дно подстилкой ALPHA-dri. Поместите автоклавируемый домик для обогащения в кровать клетки. Поместите пустую незапечатанную бутылку из-под воды и насадку и длинные щипцы с широким наконечником на верхнюю часть решетки.
   2. Вводите в корм двухвидовой биологический индикатор в пределах одной клетки за цикл автоклава. Поместите полосу химического интегратора на внешнюю сторону каждой клетки.
   3. Автоклавирование клеток в вакуумном цикле в течение 45 минут при температуре 121 °C и минимальной давлении 15 фунтов на квадратный дюйм с последующим высыханием в течение 30 минут. Стерилизуйте клетки с помощью стойки для обеззараживания международной организации по стандартизации (ISO), которая позволяет клеткам оставаться герметичными, а пар проходить через внутренний фильтр HEPA, который поддерживает стерильную среду до тех пор, пока клетка не будет открыта.
   4. Наполните бутылки объемом 1 л питьевой водой, закройте резиновыми колпачками и поместите на поверхность бутылки полосу химического интегратора. Автоклав при 121 °C и минимальной давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 45 минут, используя программу медленного выпуска жидкостей.
   5. Визуально проверьте химические интеграторы, прикрепленные к каждой клетке, для немедленной проверки соответствующих параметров автоклава.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биологический индикатор должен быть удален при первом вскрытии изокажа в стерильных условиях. Инкубируйте биологический индикатор в течение 24 ч при 37 °C и наблюдайте за изменениями цвета. Резкое изменение цвета от исходного сине-фиолетового прозрачного раствора до желтой или мутной жидкости указывает на наличие микробного роста. Если индикатор остается четким и сине-фиолетового цвета, то это подтверждение полной стерильности внутренних помещений клеток в том автоклавном цикле.

2. Стерилизатор на основе диоксида хлора

ВНИМАНИЕ: Стерилизатор диоксидом хлора чрезвычайно коррозионный после активации. Срок годности активированного стерилизатора диоксида хлора истекает через 24 ч после смешивания активатора с основанием. Стерилизатор диоксидом хлора выделяет пары, которые могут раздражать поверхности слизистых оболочек и вызывать раздражение при контакте с кожей. Убедитесь, что помещение для приготовления стерилизатора имеет доступ к раковине и надлежащую вентиляцию. Надевайте защитные очки, респиратор и химически стойкие перчатки при работе со стерилизатором диоксидом хлора в дополнение к необходимым средствам индивидуальной защиты (СИЗ) для содержания животных.

1. Смесительная база и активатор
   1. Чтобы приготовить стандартный объем стерилизатора диоксидом хлора объемом 6 л, сначала отмерьте 1 л стерилизующего основания диоксида хлора в мерном цилиндре объемом 1 л и налейте в бак объемом 20 л.
   2. С помощью того же градуированного цилиндра отмерьте и налейте в бак для макания 4 л водопроводной воды.
   3. Отложите в сторону градуированный цилиндр, используемый для основания и воды. С помощью нового мерного баллона отмерьте 1 л активатора стерилизатора диоксида хлора и залейте его в бак для погружения.
   4. После того, как активатор будет добавлен в бак, используйте градуированный цилиндр для смешивания содержимого бака.
2. Активация
   1. Накройте бак крышкой и пометьте его как стерилизатор диоксидом хлора с указанием даты и времени добавления активатора, а также имени персонала, который его приготовил. При желании, мерный цилиндр, используемый для смешивания стерилизатора, может быть использован для переноса 1 л в бутылку с распылителем.
   2. Переместите бак для макания и пульверизаторы в помещение для содержания животных, где расположены стойка и клетки Isocage. Стерилизатор активированного диоксида хлора должен находиться не менее 20 минут перед использованием, чтобы обеспечить полную активацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с большим количеством клеток (>9) можно подготовить до 12 л за один раз в баке для погружения. Для манипуляций с 1 клеткой или в случае чрезвычайных ситуаций можно приготовить 1,2 л хлордиоксида стерилизатора в меньшей емкости, а затем перелить в 2 пульверизатора по 1 л. Рекомендуется готовить стерилизатор не менее чем за 1 ч до предполагаемого переноса стерильных мышей.

3. Стерилизация

1. Донские СИЗ
   1. В качестве основного манипулятора клетки наденьте защитные очки, респиратор, химически стойкие перчатки, стерильный хирургический халат, начес, чехлы для рукавов и бахилы. Носите скребы под СИЗ, так как любой контакт ткани со стерилизатором диоксидом хлора приведет к обширному окрашиванию.
   2. Рекомендуется наличие помощника манипулятора основной клетки. Попросите ассистента надеть те же СИЗ, что и основной манипулятор клетки, хотя он может быть одет в нестерильный хирургический халат.
2. Подготовка шкафа биобезопасности
   1. Поместите 10 салфеток в бак для стерилизации хлором и диоксидом воды и убедитесь, что они полностью пропитаны.
   2. Переместите смоченные салфетки в шкаф биобезопасности и замочите все поверхности шкафа в следующем порядке сзади вперед: плоская рабочая поверхность, левая сторона, задняя часть вытяжки, правая сторона и переднее внутреннее стекло. Выполняйте бесконтактное замачивание незащищенных поверхностей шкафа биобезопасности, выдавливая салфетки на эти поверхности, не касаясь их.
   3. После одного раунда очистки поместите салфетки обратно в бак для запитки со стерилизатором и диоксидом хлора.
3. Подготовка изокагов
   1. Подготовьте большой пластиковый пакет, наполнив его не менее чем 100 мл стерилизатора диоксида хлора с помощью мерного цилиндра, и встряхните пакет, чтобы убедиться, что все внутренние поверхности пропитаны. Поместите пакет на любую ровную поверхность.
   2. Извлеките один изокаж из решетки и поместите его в резервуар для стерилизации хлором и диоксидом азота так, чтобы каждая поверхность клетки соприкасалась с жидкостью. Используйте смоченные салфетки в аквариуме для дальнейшей очистки поверхностей клетки, чтобы обеспечить полный контакт с жидкостью.
   3. Замочив клетку, попросите помощника открыть размокший полиэтиленовый пакет. Поместите клетку в мешок, и попросите помощника немедленно закрыть отверстие. Опрыскайте отверстие пакета стерилизатором диоксидом хлора с помощью пульверизатора. Следуйте этой процедуре для каждой используемой клетки; В одну сумку размером 36 дюймов 32 дюйма 48 дюймов помещается до четырех клеток.
   4. Погрузите столько стерилизованных бутылок с водой объемом 1 л, сколько необходимо (1 л воды на 2 клетки) в резервуар для стерилизации хлором и диоксидом воды, затем поместите их в другой замоченный пластиковый пакет. Когда все принадлежности будут помещены в пакет, закройте пакет и распылите стерилизатор диоксидом хлора с помощью пульверизатора.
   5. После того, как все клетки и принадлежности будут упакованы, погрузите химически стойкие перчатки в стерилизатор диоксидом хлора (как можно дальше вверх по перчаткам, не доходя до отверстия).
4. Период стерилизации 20 мин
   1. Полная стерилизация требует минимум 20 минут контакта с жидкостью. Как только последний предмет будет стерилизован и пластиковый пакет для замачивания будет закрыт, попросите помощника установить таймер на 20 минут. Следите за тем, чтобы после запуска таймера химически стойкие перчатки не касались поверхностей, не пропитанных стерилизатором диоксидом хлора.
   2. Повторяйте процесс стерилизации шкафа биобезопасности (шаг 3.2) до тех пор, пока таймер не покажет, что прошло 20 минут.
   3. Попросите помощника часто встряхивать внешние поверхности пропитанного полиэтиленового пакета, чтобы обеспечить постоянный контакт жидкости с поверхностями клетки и бутылки внутри.
   4. По истечении 20 минут попросите помощника открыть размокший пластиковый пакет, чтобы показать стерилизованные клетки и бутылки с водой, стараясь касаться только внешних поверхностей пакета.
   5. Надев стерилизованные химически стойкие перчатки, переместите каждую клетку и бутылочку в стерилизованный шкаф биобезопасности. Если клеток слишком много, чтобы поместиться в шкаф биобезопасности, оставьте оставшиеся клетки в пластиковых пакетах, так как они будут оставаться стерильными до тех пор, пока отверстие пластикового пакета закрыто и пропитано стерилизатором диоксидом хлора между каждым отверстием.

4. Перенос мыши без микробов

1. Подготовка изокагов
   1. Чтобы открыть герметично закрытый изокаж, поднимите вверх белые выступы на двух зажимах по бокам крышки, а затем вытяните каждый зажим в сторону. Крышка должна быть свободна от нижней части клетки, чтобы крышка могла подняться с клетки. Поместите крышку вверх дном слева от клетки и используйте ее в качестве стерильного рабочего места.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой использованию крышек клетки или внутренней части автоклавных сумок для инструментов в качестве стерильной рабочей поверхности является использование автоклавных простыней, которые обеспечивают большую площадь поверхности и предотвращают непреднамеренное загрязнение крышки клетки в случае ошибки.
   2. С помощью стерильных щипцов, найденных внутри клетки в верхней части решетки, извлеките пустую бутылку из-под воды и установите ее на внутреннюю сторону крышки. Откройте бутылку для воды объемом 1 л, сняв резиновое уплотнение, и налейте воду в бутылку для воды, чтобы наполнить ее. Поместите насадку на бутылку с водой с помощью щипцов и плотно прижмите, чтобы запечатать.
   3. Используйте стерильные щипцы, чтобы поднять решетку и отодвинуть ее на несколько дюймов, чтобы обеспечить отверстие в нижней части клетки. Положите стерильные щипцы на решетку, следя за тем, чтобы ручки не соприкасались с поверхностями клетки.
2. Использование передаточного диска
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обученный стерильный персонал отвечает за уход и содержание питомников. Учитывая риски, связанные с открытием изоляторов для разведения, эти сотрудники выполняют стерилизацию переносных дисков, подготовку и перевод стерильных мышей из изоляторов в изокаги. Чтобы кратко описать процесс, можно сказать, что передаточные диски подготавливаются в автоклавируемом цилиндре для обеспечения стерилизации. Для проверки их стерильности используются биологические индикаторы. Лента для герметизации передаточных дисков также автоклавируется внутри цилиндра. Стерилизованный цилиндр, в котором находятся эти материалы, крепится через передаточный рукав к изолятору, и мыши перемещаются из клеток в диск. Затем на диск надевается крышка, а автоклавная лента используется для создания герметичного уплотнения по окружности диска и воздушных отверстий. Герметичный диск сразу же помещается в выходное отверстие изолятора. Затем крышка порта домашнего изолятора закрывается, а внешняя сторона диска тщательно протирается стерилизатором и помещается в пакет, пропитанный стерилизователем, под наблюдением в течение 20 минут для обеспечения полного обеззараживания. Затем биологически чистый селекционный персонал доставляет эти диски исследовательскому персоналу. Мышей нельзя держать в запечатанном диске дольше 30 минут с момента запечатывания передаточного диска, поэтому важно, чтобы все предыдущие шаги в этом протоколе были выполнены за достаточное время до прибытия передаточного диска.
   1. Получив диск для переноса, попросите помощника взять и частично развернуть пластиковую крышку так, чтобы промокшая поверхность диска для переноса была открыта, но не касалась помощником.
   2. Получив диск для переноса, попросите помощника взять и частично развернуть пластиковую крышку так, чтобы промокшая поверхность диска для переноса была открыта, но не касалась помощником.
   3. Надев химически стойкие перчатки, смоченные в стерилизаторе диоксидом хлора, снимите передаточный диск с пластиковой упаковки, стараясь не прикасаться к поверхности, не смоченной в стерилизаторе. Затем поместите передаточный диск на плоскую поверхность стерилизованного шкафа для биобезопасности.
   4. Чтобы открыть диск для переноса, снимите ленту, запечатайте окружность диска и выбросьте его за пределы шкафа биобезопасности. Снимите крышку передаточного диска и выбросьте его за пределы шкафа биобезопасности.
   5. Внутри передаточного диска находится вращающаяся крышка отсека с одним отверстием. С помощью стерильных щипцов, ранее упертых в решетку клетки, манипулируйте крышкой этого отсека, чтобы переместить отверстие к мыши, необходимое для переноса.
3. Перенос мышей с диска на изокаг
   1. С помощью щипцов возьмитесь за основание хвоста мыши через отверстие в пластиковой крышке диска, а затем поднимите и перенесите мышь в изокаж через пространство, открытое ранее между проволочной решеткой и клеткой. Повторите то же самое для всех мышей, предназначенных для этой клетки.
   2. После того, как все мыши будут переведены в этот изокаж, замените решетку с помощью щипцов. Затем поднимите крышку клетки и положите ее обратно на клетку с помощью щипцов.
   3. Поднимите каждый зажим крышки клетки вверх и осторожно опустите по бокам клетки, а затем нажмите на белые выступы, чтобы закрыть крышку клетки.
   4. После того, как клетка будет герметизирована, попросите помощника распылить стерилизователем диоксид хлора на каждую форсунку стыковочной стойки. Затем снимите клетку с капота и передайте ее помощнику, который затем сможет пристыковать клетку к стойке.
   5. Повторите эти действия для каждой мыши на передаточном диске.
4. Очистка шкафа биобезопасности
   1. По завершению всех переносов мыши в изокаж, опорожните капот от мусора и полностью протрите пропитанными стерилизователем салфетками с диоксидом хлора.
   2. Протрите вытяжку изопропиловым спиртом, чтобы удалить остатки хлордиоксида стерилизатора. Пространство под рабочей поверхностью вытяжки собирает большой объем стерилизатора в процессе стерилизации. Удалите его путем абсорбции сухими салфетками и протрите изопропиловым спиртом.
   3. Утилизируйте жидкий стерилизатор диоксидом хлора через слив раковины через 24 часа после активации. Утилизируйте твердые материалы, загрязненные стерилизатором, как обычные отходы.
      Примечание: Стерильных мышей, переведенных в изокажные условия, оставляют на 1 неделю для акклиматизации к новой среде перед любым вмешательством. Это снижает стресс, испытываемый животными, который может повлиять на результаты исследования. В конце этого 1-недельного периода акклиматизации соберите кал, как описано в шаге 6, чтобы подтвердить статус отсутствия микробов перед любым вмешательством.

5. Пероральный зондирование фекальной суспензии человека у стерильных мышей

1. Подготовка материалов для автоклавного зондирования
   1. Поместите иглы для перорального зондирования в самогерметизирующиеся стерилизационные мешочки (1 на мышь) и стерильные шприцы объемом 1 мл в самогерметизирующиеся стерилизационные пакеты (по 1 на мышь) за 1 день до процедуры перорального зондирования. Поместите эти стаканы, а также полипропиленовые стаканы объемом 600 мл (по 1 на мышь) и пару длинных щипцов в пакет, пригодный для автоклава, и простерилизуйте с помощью автоклава.
   2. Сразу после извлечения пакета из автоклава заклейте пакет упаковочной лентой и храните его до следующего дня.
2. Приготовление каловой суспензии человека
   1. В день зондирования перенесите гомогенизированный человеческий кал и хранящийся в анаэробных средах для консервации (в данном случае в жидких стоматологических транспортных средах) из морозильной камеры при температуре -80 °C в анаэробную камеру. Гомогенизированный фекальный материал развести примерно в соотношении 1:10 в стерильном анаэробном физиологическом растворе в конической пробирке объемом 10 мл.
   2. Запечатайте пробирку, содержащую человеческую фекальную суспензию, парапленкой, гомогенизируйте вихрем, а затем центрифугируйте при 200 г в течение 5 минут для осаждения частиц.
   3. Поместите трубку обратно в анаэробную камеру и перенесите надосадочную жидкость в другую коническую трубку объемом 10 мл. Запечатайте пробирку, содержащую надосадочную жидкость фекалий человека, парапленкой, извлеките ее из анаэробной камеры и поместите во вторичный герметичный контейнер. Транспортируйте контейнер вместе с автоклавным мешком с принадлежностями для зонда к месту содержания животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно оценить общее количество КОЕ/мл человеческих фекалий, предназначенных для измерения в области отчетности для целей отчетности. Неясно, какова минимальная нагрузка на КОЕ для обеспечения адекватной колонизации, но более высокие КОЕ приводят к лучшему приживлению донорского стула¹³. Если нагрузка КОЕ из человеческих фекалий приводит к низким показателям приживления, отберите образцы человеческих фекалий. Использование среды для сохранения жизнеспособности улучшит извлечение КОЕ из собранных образцов фекалий. Чтобы определить количество анаэробных/аэробных КОЕ в донорских фекалиях, последовательно разбавляйте образец до 1 x ^10-5 и вносите 10 мкл каждого разведения в двух экземплярах на аэробных и анаэробных агаровых планшетах BHI и LB. Через 24 ч (аэробный) и 48 ч (анаэробный) подсчитайте КОЕ на грамм стула.
3. Подготовка изокагов
   1. Повторите шаги 2 и 3, с той лишь разницей, что в этих клетках содержатся мыши, и следует позаботиться о том, чтобы в течение 30 минут после снятия стойки каждый изокадж был помещен в стерилизованный колпак, а крышка вентилировалась, чтобы обеспечить приток воздуха к мышам.
   2. Простерилизуйте автоклавный мешок с материалом для зондирования и трубку для суспензии для фекалий человека на этапах 5.1 и 5.2 путем насыщения стерилизатором диоксидом хлора таким же образом, как и бутылки с водой (т.е. погрузите их в стерилизатор, а затем поместите в пакет, пропитанный стерилизатором).
   3. Переложите изокажи и принадлежности для перорального зондирования в бокс биобезопасности после завершения 20-минутного периода стерилизации. Проколите автоклавный пакет для подачи материала, прижав его к длинным щипцам, содержащимся внутри, а затем извлеките расходные материалы и выбросьте пакет за пределы капюшона.
4. Зонд
   1. Наденьте новый стерильный хирургический халат и стерильные хирургические перчатки вместо химически стойких, чтобы предотвратить контакт остатков стерилизатора диоксида хлора с мышами. При необходимости попросите помощника помочь в этом процессе.
   2. Подготовьте иглы для зондажа, развернув каждый стерилизационный мешок, и используйте внутреннюю часть мешка в качестве сухой стерильной поверхности для отдыха. Подсоедините иглу для зондирования к каждому шприцу, откройте трубку для каловой суспензии и наберите 200 мл каловой суспензии в каждый шприц.
   3. С помощью щипцов возьмитесь за основание хвоста одной мыши в клетке и поместите его на решетку. Аккуратно зафиксируйте мышь путем потертостей, и, удерживая мышь в вертикальном положении, введите иглу и осторожно введите каловую жижу с последующим немедленным извлечением иглы.
   4. Поместите мышь прямо в одну из стерилизованных чашек для наблюдения. Повторите этот процесс для каждой мыши в клетке. После того, как все мыши получат зонд, с помощью щипцов переместите каждую мышь обратно в кровать клетки и запечатайте клетку, как описано в шагах 4.3.2-4.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случаях, когда используются две или более отдельных фекальных суспензии, требуется полная повторная стерилизация шкафа биобезопасности и необходимых клеток и материалов. В тех случаях, когда группа мышей остается свободной от микробов, рекомендуется, чтобы эти мыши получили контрольные зонды до того, как будет обработана любая другая группа.
   5. Следуйте процедуре, описанной в шаге 4.4, чтобы утилизировать стерилизатор диоксидом хлора и материалы, пропитанные стерилизатором. Любые материалы, загрязненные фекальной суспензией человека, следует рассматривать как биомедицинские отходы и утилизировать их в соответствии с процедурами охраны окружающей среды, здоровья и безопасности.

6. Забор кала у гуманизированных мышей для сохранения жизнеспособности

1. Подготовьте автоклавные припасы
   1. Поместите короткие щипцы с широким наконечником в самогерметизирующиеся стерилизационные мешочки (1 на мышь), полипропиленовые стаканы объемом 600 мл (1 на мышь) и пару длинных щипцов в пакет, безопасный для автоклава, и стерилизуйте с помощью автоклава за 1 день до процедуры сбора кала.
   2. Сразу после извлечения пакета из автоклава заклейте пакет упаковочной лентой и храните его до следующего дня.
2. Подготовка пробирки для консервационных сред
   1. Выберите анаэробную среду для сохранения жизнеспособности (здесь был использован метод Кэри Блэра). Аликвот 1 мл консервационной среды в стерильные, завинчивающиеся крышки на 2 мл пробирки в биобезопасном шкафу. Для оптимальной сохранности рекомендуется соотношение фекалии:медиа 1:10.
   2. Предварительно пометьте каждую пробирку перманентным маркером, но имейте в виду, что воздействие стерилизатора диоксида хлора может удалить перманентные маркировочные этикетки с пластиковых поверхностей. Другой метод заключается в том, чтобы оставить пробирки без маркировки и сделать пробирки помощника этикетки сразу после сбора перед замораживанием.
   3. Поместите эти пробирки в стандартный полипропиленовый штатив для пробирок, чтобы пробирки можно было хранить в вертикальном положении, обеспечивая при этом стерилизацию при контакте с стерилизатором диоксидом хлора.
3. Стерилизующие клетки и шкаф биобезопасности
   1. Повторите шаги 2 и 3 для стерилизации изокажей и шкафа биобезопасности. Опять же, позаботьтесь о том, чтобы в течение 30 минут после снятия решетки каждый изокаж был помещен в стерилизованный колпак, а крышка вентилировалась, чтобы обеспечить приток воздуха к мышам.
   2. Кроме того, простерилизуйте автоклавный пакет для подачи и штатив с подготовленными пробирками с помощью стерилизатора хлора и поместите их в пропитанный полиэтиленовый пакет, в котором находятся клетки. Целью является полный контакт жидкости со всеми поверхностями каждой пробирки и самим штативом.
4. Сбор и хранение образцов кала
   1. Перенесите изокаги, автоклавные расходные материалы и штатив для пробирок в шкаф биобезопасности после завершения 20-минутного периода стерилизации. Проколите автоклавный пакет для подачи материала, прижав его к длинным щипцам, содержащимся внутри, извлеките расходные материалы и выбросьте пакет за пределы капюшона.
   2. Наденьте новый стерильный хирургический халат и стерильные хирургические перчатки вместо химически стойких, чтобы предотвратить контакт остатков стерилизатора диоксида хлора с мышами. При желании попросите помощника помочь в этом процессе.
   3. Подготовьте щипцы с тупым кончиком, развернув мешочки и используя внутреннюю поверхность мешка в качестве стерильной зоны. Поместите штатив для пробирок на поверхность биозащитного колпака.
   4. С помощью длинных щипцов возьмитесь за основание хвоста одной мыши в клетке и поместите их прямо в одну из стерилизованных чашек для наблюдения. Повторите этот процесс для каждой мыши в клетке.
   5. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока не будут произведены хотя бы две только что выведенные фекальные гранулы.
      1. С помощью щипцов с тупым кончиком соберите каловые гранулы и поместите их прямо в трубку. Сразу же закупорьте завинчивающуюся крышку крышки и передайте ее помощнику.
      2. Попросите помощника пометить трубку и немедленно гомогенизируйте стул с помощью вортексинга. После однородности заморозьте пробирку в жидком азоте и храните в течение длительного времени при температуре -80 °C.
   6. Повторите процесс сбора кала для каждой мыши в клетке. Поместите каждую мышь в домашнюю клетку после сбора фекалий и установите клетки на стойку. Повторите шаг 4.4, чтобы очистить капот и утилизировать отходы.

Образцы фекалий человека, объединенные по фенотипу, ответившему на ICI и не ответившему (ранее описанному в протоколе), были опрошены у мышей GF-WT смешанного пола, размещенных в 3 изокагах в группе (n = 1-2 мыши/клетку, n = 6 для ответивших и n = 5 для не ответивших). Мышам дали аккл...

Описанный здесь протокол представляет собой воспроизводимый, высокодетализированный метод гуманизации стерильных мышей, содержащихся в экспериментальных изокагах. Возможность пересадки исключительно фекальных сообществ от человека к мышиным хозяевам бесценна д?...

У авторов нет конфликта интересов.

Авторы выражают благодарность Отделу услуг по защите от микробов UF Animal Care Services за помощь в разведении гнотобиотиков, доктору Брук Блумберг и доктору Лауре Юрелл за ветеринарную помощь и помощь IACUC, а также Жозе Готье за помощь в секвенировании гена 16S рРНК. Это исследование было поддержано, в частности, Фондом Онкологического центра UF Health (C.J.) и Фондом Gatorade Департамента медицины UF (C.J.). R.Z.G. был поддержан средствами Онкологического центра UF Health. R.C.N. был поддержан грантом Национальных институтов здравоохранения TL1 в Университете Флориды (TL1TR001428, UL1TR001427), премией Национального института рака Национальных институтов здравоохранения в рамках междисциплинарной программы обучения раку на основе команды T32CA257923 и Онкологическим центром UF Health. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Онкологическим центром UF Health, частично за счет государственных ассигнований, предоставленных в соответствии с § 381.915 Флориды, и Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения в рамках гранта No P30CA247796. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или штата Флорида. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.