تحضير وصيانة تجربة القفص المتساوي الإيجابي للاستبعاد الحيوي لزرع البراز البشري في الفئران الخالية من الجراثيم

يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات لنقل الفئران الخالية من الجراثيم إلى العوازل التجريبية أحادية القفص (isocages) وإيواؤها مع الحفاظ على ظروف معقمة. تتم مناقشة طرق زرع البراز في الفئران الخالية من الجراثيم وجمع البكتيريا القابلة للحياة من هذه الفئران "المتوافقة مع البشر" في الأمعاء لمزيد من التطبيقات.

تعد الفئران الخالية من الجراثيم أداة تحقيق مهمة لفهم مساهمة الكائنات الحية الدقيقة في صحة المضيف وأمراضه ، مما يتيح تقييم الدور المحدد للأفراد أو مجموعات محددة أو معقدة من الكائنات الحية الدقيقة في استجابة المضيف. يتم تربيتها وتربيتها تقليديا في عوازل مرنة أو شبه صلبة ، وتربية الفئران الخالية من الجراثيم والتلاعب التجريبي مكلفة وتتطلب العديد من الموظفين المدربين ومساحة كبيرة في مرافق إسكان. يسمح نظام القفص IsoPositive بالتلاعب التجريبي بالفئران الخالية من الجراثيم في أقفاص عازلة فردية محكمة الغلق والضغط الإيجابي (isoocages) ، مما يقلل التكلفة ويتيح مرونة أكبر في التلاعب التجريبي.

هنا ، يتم وصف بروتوكول لنقل الفئران الخالية من الجراثيم من عوازل التكاثر إلى المزاويات ونقل البراز اللاحق من براز متبرع بشري إلى الفئران لإنشاء فئران مستقرة على المدى الطويل "أنسنة" في الأمعاء للدراسات المستقبلية. يتم وصف المواد والمستحضرات اللازمة لاستخدام نظام التوازن ، بما في ذلك استخدام المعقم الكيميائي المعقم بثاني أكسيد الكلور لتنظيف الأقفاص والإمدادات والمعدات ومعدات الحماية الشخصية. تتم مناقشة طرق تأكيد الحالة الخالية من الجراثيم للفئران المنقولة وكيفية تحديد التلوث في نظام الأقفص. تتم مناقشة إجراءات التربية ، بما في ذلك الفراش والغذاء وإمدادات المياه. تم وصف بروتوكول تحضير الملاط البراز البشري والتزقيم في الفئران الخالية من الجراثيم لإنشاء فئران "إنسانية" في الأمعاء ، جنبا إلى جنب مع جمع البراز لمراقبة تكوين المجتمع الميكروبي لهذه الفئران. توضح تجربة أن زرع البراز البشري بعد أسبوعين يسمح بالاستعمار المستقر للميكروبات المانحة في مضيفي الفئران ، مما يتيح الاستخدام التجريبي اللاحق. علاوة على ذلك ، يتم وصف مجموعة براز الفأر المتوافق مع البشر في وسائط الحفاظ على الجدوى ، مما يتيح استخدامها في المزيد من التجارب الوظيفية. بشكل عام ، تسمح هذه الأساليب بإنشاء آمن وفعال لمجتمعات الفئران المتوافقة مع البشر في أقفاص العرف الحيوية التجريبية لمزيد من التلاعب.

تعد الفئران الخالية من الجراثيم أداة أساسية في ذخيرة الباحثين في الميكروبيوم ، مما يسمح للمرء بتشريح مساهمة الكائنات الحية الدقيقة في حالات الصحة والمرض المضيف. تولد الفئران الخالية من الجراثيم معقمة تماما وتظل محورية طوال^{حياتها 1}. يتيح استعمار الفئران الخالية من الجراثيم ذات السلالات البكتيرية المحددة إجراء دراسات مسببة بين تلك الأصناف ووظائف التمثيل الغذائي أو المناعة أو المضيف الأخرى^2،3،4،5. من المفيد بشكل خاص القدرة على "إضفاء الطابع الإنساني" على الفئران الخالية من الجراثيم على مستوى الجراثيم عن طريق زرع البراز الذي تم الحصول عليه من متبرعين بشريين ، وعند وضعه في ظروف حاجز ، منع التلوث من الكائنات الحية الدقيقة المشتقة من^{المورين 1}. مكن هذا النهج من العديد من الاكتشافات المهمة في مجال الميكروبيوم ، على سبيل المثال ، تأثير ميكروبيوم الأمعاء البشرية على استجابة العلاج المناعي للسرطان^6،7،8.

ومع ذلك ، في حين أن الفئران الخالية من الجراثيم المتوافقة مع البشر لا تقدر بثمن لجهود البحث في مجال الميكروبيوم ، إلا أن هناك العديد من القيود التي أعاقت التكيف الأوسع لهذا النهج. يتم تربية الفئران الخالية من الجراثيم وصيانتها في عوازل كبيرة شبه صلبة أو مرنة ، لكن التجارب الوظيفية تتطلب إعداد عوازل صغيرة منفصلة ، مع وجود عازل صغير واحد يحتوي على عدة أقفاص ولكن فقط في ظل حالة تجريبية واحدة. يزيد نهج المعزل المصغر هذا من المساحة والتكلفة مع الحد بشدة من عدد الظروف التجريبية التي يمكن التحقيق فيها في التجربة وعدد التجارب التي يمكن إجراؤها بالتوازي. الحل الواعد هو استخدام نظام قفص فردي معياري يسمى نظام الاستبعاد البيولوجي ISOcage P (يشار إليه هنا باسم نظام isocage) ^9،10. يسمح نظام isocage بالتلاعب التجريبي بالفئران الخالية من الجراثيم في أقفاص عازلة فردية محكمة الغلق والضغط الإيجابي ، مما يتيح ظروفا تجريبية منفصلة بين كل قفص بدلا من كل عازل صغير. باستخدام تقنية التعقيم المناسبة ، يمكن إيواء في أحجار لمدة تصل إلى 12 أسبوعا في ظل ظروف خالية من الجراثيم أو إضفاء الطابع الإنساني عليها عن طريق زرع البراز البشري لاستخدامها في أي نهج تجريبي متوافق (أي يمكن إجراؤها في ظل ظروف معقمة). يمكن إجراء تجارب مستقلة متعددة بالتوازي باستخدام نظام isocage ، وتكون المساحة والتكلفة أقل بشكل كبير من إجراء تجارب متعددة عبر العوازل الصغيرة.

الغرض من تربية الفئران الخالية من الجراثيم في عوازل تربية الأفلام المرنة هو الحفاظ بعناية على الحالة المحورية¹¹. تشمل التقنيات المستخدمة لمراقبة الحالة الخالية من الجراثيم المسحات الروتينية لأسطح جسم الفئران وتجاويف الفم ، بالإضافة إلى الجمع المعقم لعينات البراز ، والتي يتم زراعتها واختبارها بواسطة المقايسات التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الاختبارات البكتيرية والمصلية والفطرية لهذه العينات كلها مطلوبة لتحديد الحالة الخالية من الجراثيم¹¹. عندما يتم نقل الفئران الخالية من الجراثيم من عوازل التكاثر إلى isocages للاستخدام التجريبي ، يتم مسح الفئران واختبارها للتحقق من حالتها الخالية من الجراثيم عند النقل. يتم إجراء فحوصات العقم المتساوي من خلال الجمع المعقم لعينات البراز ، والتي يتم زراعتها بعد ذلك للكشف عن الملوثات البكتيرية والفيروسية والفطرية. يعد جمع نتائج فحوصات العقم هذه وتسجيلها بعناية من الولادة حتى نهاية البروتوكول التجريبي أمرا ضروريا للتحقق من صحة حالة هذه الفئران الخالية من الجراثيم.

يتكون نظام isocage من أقفاص فردية (الشكل 1) ، وأقراص نقل للنقل خارج عوازل التكاثر (الشكل 1) ، ورف isocaj ، الذي يضم الأقفاص (الشكل 2). يحتوي كل معضل على مرشح هواء جسيمات عالي الكفاءة (HEPA) على مستوى القفص مثبت على مدخل هواء الإمداد وحشية سيليكون تصنع ختما محكما عند إغلاقه ، مما يضمن عدم دخول الملوثات إلى القفص عبر الهواء (الشكل 1 أ). يمكن استخدام غطاء القفص هذا كسطح عمل معقم عند وضعه رأسا على عقب داخل خزانة السلامة الحيوية المعقمة (الشكل 1 أ). رف سلكي داخل القفص يحمل زجاجة الطعام والماء (الشكل 1 ب). يتم استخدام الملقط المعقم داخل القفص لجميع عمليات التلاعب التي تتطلب ملامسة أسطح الأقفاص الداخلية. يحتوي القفص نفسه على شقوق لحامل بطاقة قفص قابل للإزالة لتحديد من الخارج وفوهات سحب الهواء والتصدير التي ترسو في رف الحوض (الشكل 1C-E). تعمل مشابك الإغلاق الآمن وقفل علامة التبويب على الغطاء على إغلاق القفص عندما يكون جاهزا لإعادة رسمه على نظام الحامل (الشكل 1F). الفراش المقترح هو Alpha-dri ، ويوصى أيضا باستخدام كوخ تخصيب قابل للتعقيم (الشكل 1F). تستخدم أقراص النقل لنقل الفئران الخالية من الجراثيم من عوازل التكاثر إلى الأيزوكاج وتحتوي على غطاء حجرة قابل للدوران بفتحة مثلثة للسماح بالتلاعب بالحيوانات (الشكل 1G-H). تأتي الأقراص بأحجام صغيرة (قطرها 21.6 سم) وكبيرة (قطر 28 سم) ، وكلاهما بسعة ثمانية فئران. يستخدم الشريط المعقم لإنشاء أختام محكمة الإغلاق على محيط القرص وفتحات الهواء ، والتي يتم إجراؤها قبل النقع بمعقم ونقله في كيس مبلل بالتعقيم (الشكل 1I). يحتوي نظام الحامل نفسه على شاشة لمراقبة منفاخ الهواء ، وحالة مرشح HEPA على مستوى الحامل ، وطاقة البطارية في حالات الطوارئ للحامل ، وكلها ميزات مضمنة للنظام (الشكل 2 أ). يعرض مقياس Magnehelic المغلق الضغط الإيجابي الذي يحتفظ به نظام القفص ، ويظهر مؤشر الإرساء المرئي التلقائي حالة إرساء الأقفاص (علامة التبويب الصفراء تعني عدم إرساء القفص ، أو أن الرصيف لم ينجح) (الشكل 2B-D). من الضروري أيضا التلاعب ب isocages خزانة السلامة الحيوية القياسية المعتمدة.

يصف البروتوكول المقدم هنا الطرق المناسبة للنقل الناجح للفئران الخالية من الجراثيم من عوازل التكاثر في ظل ظروف معقمة إلى الأحجار مع الحفاظ على حالة خالية من الجراثيم ، وإضفاء الطابع الإنساني على الفئران الخالية من الجراثيم مع ملاط براز متبرع بشري ، وجمع البراز من الفئران الموجودة في isocage إما لتأكيد الحالة الخالية من الجراثيم أو الحفاظ على الجدوى لمزيد من الدراسات الوظيفية. في هذا المثال ، يتم إضفاء الطابع الإنساني على الفئران الخالية من الجراثيم بعينات براز مجمعة من أشخاص عولجوا بالعلاج المناعي لسرطان الرئة ومزدوجة التقسيم كمستجيبين أو غير مستجيبين للعلاج. في هذه الحالة ، تم نقل النمط الظاهري للاستجابة للاستجابة للعلاج المناعي عن طريق إضفاء الطابع الإنساني على ميكروبات الأمعاء إلى الفئران المتلقية ، والتي يمكن بعد ذلك تلقيحها بالخلايا السرطانية وعلاجها بالعلاج المناعي. يمكن تكييف بروتوكول ملاط البراز البشري بسهولة مع أي براز متبرع بشري أو أي نموذج قبل سريري للمرض يرغب فيه المحقق. باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن نقل أي ميكروبات متبرعة بشرية بالبراز إلى مضيف خال من الجراثيم ، مما يتيح إجراء مزيد من التحقيق في دور الكائنات الحية الدقيقة في الصحة والمرض.

الشكل 1: رسم تخطيطي لأقراص القياس والنقل. (أ) منظر من أعلى إلى أسفل للجانب السفلي من غطاء القفص ، مع ملصقات تشير إلى موقع مرشح HEPA الداخلي على مستوى القفص وختم حشية السيليكون. (ب) منظر من أعلى إلى أسفل للجزء الداخلي من القفص ، مع ملصقات تشير إلى غطاء شريط السلك ، وزجاجة المياه الداخلية ، والفوهة ، والموقع في الرف السلكي لحمل الطعام القابل للتعقيم. (ج) منظر أمامي للقفص يظهر شقوق لحامل بطاقة القفص. (د) منظر من أعلى إلى أسفل لقفص كامل مع غطاء في الأعلى ، يوضح كيفية تركيب مرشح HEPA على فوهة سحب الهواء. (ه). منظر خلفي للقفص يظهر فوهات سحب الهواء والتصدير التي ترسو على نظام رف isocage. (و) منظر جانبي لقفص كامل مع غطاء في الأعلى ، مع ملصقات تشير إلى مشابك الإغلاق الآمن في الوضع المفتوح ، مع علامات تبويب بيضاء على كل مشبك تثبتها في مكانها. يظهر الجزء الداخلي من القفص فراشا من Alpha-dri طبقات في الأسفل ويقترح كوخ التخصيب الموضوع في الفراش. (G) عرض من أعلى إلى أسفل لأقراص النقل مع غطاء في الأعلى. (ح) منظر من أعلى إلى أسفل للجزء الداخلي من قرص النقل، يظهر غطاء المقصورة القابل للدوران بفتحة مثلثة للسماح بالتلاعب بالحيوانات. (ط) منظر جانبي لقرص النقل المجمع بالكامل يظهر وضع الشريط المعقم ، مما يخلق ختما محكما أثناء النقل من عازل التكاثر إلى التكاثر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رسم تخطيطي لنظام رف isocage. (أ) رف متساوي كامل مع أقفاص مثبتة وملصق يشير إلى شاشة المراقبة لحالة منفاخ الهواء وحالة مرشح HEPA وبطارية الطوارئ. يوجد في الجانب الأيسر السفلي من الحامل فتحة مرشح HEPA على مستوى الحامل. (ب) مقياس Magnehelic المرفق يوضح الضغط الإيجابي الذي يحتفظ به الحامل. (ج) إرساء إرساء بدون مؤشر إرساء أصفر مرئي ، مما يدل على اتصال ناجح بين الحامل وفوهات الهواء. (د) فتحة فارغة في الحامل ، مع مؤشر إرساء مرئي تلقائي مرئي يشير إلى عدم وجود رف في مكانه ولا يوجد توصيل لفوهات الهواء بحاجز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة فلوريدا (UF) وتم إجراؤها في مرافق رعاية في جامعة فلوريدا (بروتوكول IACUC #IACUC202300000005). مستعمرات من نوع البرية الخالية من الجراثيم (GF WT; C57BL / 6) تم تربية الفئران وصيانتها في العوازل من قبل قسم UF لخدمات رعاية الخالي من الجراثيم. تم نقل الفئران GF WT المختلطة من عوازل التكاثر ووضعها في نظام الاستبعاد الحيوي ISOcage P للسماح بالتلاعب الميكروبي.

تم الحصول على عينات البراز البشري من دراسة قائمة على الملاحظة مستقبلية جمعت عينات البراز الطولية من المرضى الذين تلقوا العلاج بمثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICI)¹². تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى بعد الموافقة على الدراسة من قبل Advarra IRB (MCC # 18611 ، Pro00017235). تلقى الأشخاص وأكملوا مجموعة أدوات جمع البراز لوسيط نقل الأسنان السائل (LDTM) والتي تهدف إلى الحفاظ على صلاحية البكتيريا للدراسات الوظيفية. وصف تقييم الاستجابة n = 4 عينات على أنها مستجيبين (R) و n = 6 على أنها غير مستجيبين (NR). تم إذابة عينات المرضى المتجانسة المحفوظة ب LDTM بشكل فردي ، ووضعت كل منها في غرفة لاهوائية لمدة لا تزيد عن 90 ثانية وتم تجميعها حسب النمط الظاهري للاستجابة (R: n = 4 ، NR: n = 6). ثم تم اقتباس العينات المجمعة وتجميدها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في هذا البروتوكول. لتحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرة اللاهوائية (CFU) لبراز المتبرع ، تم تخفيف براز كل موضوع بشكل متسلسل إلى 1 × ^{10-5 ،} وتم طلاء 10 ميكرولتر من كل تخفيف في نسخ مكررة على ضخ القلب اللاهوائي للدماغ (BHI) وألواح أجار لوريا بيرتاني (LB) وعدد CFU لكل جرام براز مقدر. تم تجميع CFU متساوية من كل موضوع في عينات لقاح البراز للتزقيم في الفئران.

1. تحضير الأقفاص والتعقيم

1. تحضير Isocage
   1. املأ الأقفاص مسبقا ب ~ 500 مل من نظام 2018SX الغذائي أو أي نظام غذائي مدعم قابل للتعقيم وطبقة من القاع بفراش ALPHA-dri. ضع كوخا للتخصيب القابل للتعقيم في سرير القفص. ضع زجاجة ماء فارغة وغير محكمة الغلق وفوهة ملقط طويل عريض الرأس أعلى الرف السلكي.
   2. ضع مؤشرا بيولوجيا مزدوج النوع في الطعام داخل قفص واحد لكل دورة أوتوكلاف. ضع شريط تكامل كيميائي على السطح الخارجي لكل قفص.
   3. قم بتعقيم الأقفاص في دورة فراغ لمدة 45 دقيقة عند 121 درجة مئوية وحد أدنى 15 رطل لكل بوصة مربعة متبوعا بوقت تجفيف لمدة 30 دقيقة. قم بتعقيم الأقفاص باستخدام رف إزالة التلوث التابع للمنظمة الدولية للتوحيد القياسي (ISO) الذي يسمح للأقفاص بالبقاء مغلقة ومرور البخار عبر مرشح HEPA الداخلي ، والذي يحافظ على البيئة المعقمة حتى يتم فتح القفص.
   4. املأ زجاجات سعة 1 لتر بمياه الشرب ، وأغلقها بأغطية مطاطية ، وضع شريط تكامل كيميائي على سطح الزجاجة. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية والحد الأدنى 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 45 دقيقة ، باستخدام برنامج العادم البطيء للسوائل.
   5. تحقق بصريا من أجهزة التكامل الكيميائي الملصقة على كل قفص للتحقق الفوري من معلمات الأوتوكلاف المناسبة.
      ملاحظة: يجب إزالة المؤشر البيولوجي عند الفتح الأول للقوارب في ظل ظروف معقمة. احتضان المؤشر البيولوجي لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ولاحظ أي تغييرات في اللون. يشير تغيير اللون الزاهي من المحلول الأصلي الأزرق / الأرجواني الشفاف إلى سائل أصفر أو عكر إلى وجود نمو ميكروبي. إذا ظل المؤشر واضحا وأزرق / أرجواني اللون ، فهذا تأكيد على العقم الكامل للأقفاص الداخلية في دورة الأوتوكلاف تلك.

2. تحضير معقم ثاني أكسيد الكلور

تنبيه: معقم ثاني أكسيد الكلور شديد التآكل بمجرد تنشيطه. تنتهي صلاحية معقم ثاني أكسيد الكلور المنشط بعد 24 ساعة من خلط المنشط مع القاعدة. ينتج معقم ثاني أكسيد الكلور أبخرة يمكن أن تكون مزعجة للأسطح المخاطية وتسبب تهيجا عند ملامسة الجلد. تأكد من أن غرفة تحضير التعقيم لديها إمكانية الوصول إلى حوض وتهوية مناسبة. ارتد نظارات واقية وجهاز تنفس وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية عند العمل بمعقم ثاني أكسيد الكلور بالإضافة إلى معدات الحماية الشخصية المطلوبة لمنشأة إسكان.

1. قاعدة الخلط والمنشط
   1. لعمل حجم قياسي سعة 6 لتر من معقم ثاني أكسيد الكلور ، قم أولا بقياس 1 لتر من قاعدة معقمة ثاني أكسيد الكلور في أسطوانة متدرجة سعة 1 لتر واسكبها في خزان غمر بحجم 20 لترا.
   2. باستخدام نفس الأسطوانة المتدرجة ، قم بقياس وصب 4 لترات من ماء الصنبور في خزان الغمر.
   3. ضع جانبا الأسطوانة المتدرجة المستخدمة للقاعدة والماء. استخدم أسطوانة متدرجة جديدة لقياس 1 لتر من منشط التعقيم بثاني أكسيد الكلور وصبها في خزان الغمر.
   4. بمجرد إضافة المنشط إلى الخزان ، استخدم الأسطوانة المتدرجة لخلط محتويات الخزان.
2. التنشيط
   1. ضع الغطاء على خزان الغمس وقم بتسميته بأنه معقم ثاني أكسيد الكلور مع تاريخ ووقت إضافة المنشط واسم الموظفين الذين أعدوه. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استخدام الأسطوانة المتدرجة المستخدمة لخلط المعقم لنقل 1 لتر إلى زجاجة رذاذ.
   2. انقل خزان الغمر وزجاجات الرش إلى غرفة سكن ، حيث يوجد رف Isocage والأقفاص. يجب أن يظل معقم ثاني أكسيد الكلور المنشط لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام لضمان التنشيط الكامل.
      ملاحظة: لمعالجة كميات كبيرة من الأقفاص (>9) ، يمكن تحضير ما يصل إلى 12 لترا في وقت واحد في خزان الغمر. للتلاعب بقفص واحد أو في حالات الطوارئ ، يمكن تحضير 1.2 لتر من معقم ثاني أكسيد الكلور في حاوية أصغر ثم نقله إلى زجاجات رذاذ 2 1 لتر. يوصى بتحضير المعقم قبل ساعة واحدة على الأقل من النقل المتوقع للفئران الخالية من الجراثيم.

3. التعقيم

1. دون معدات الوقاية الشخصية
   1. بصفته مناور القفص الأساسي ، ارتد نظارات واقية ، وجهاز تنفس ، وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ، وثوب جراحي معقم ، ومنفخ ، وأغطية أكمام ، وأغطية أحذية. ارتد مقشرات أسفل معدات الوقاية الشخصية لأن أي ملامسة للقماش مع معقم ثاني أكسيد الكلور سيؤدي إلى تلطيخ واسع النطاق.
   2. يوصى باستخدام مساعد لمناور القفص الأساسي. اطلب من المساعد ارتداء نفس معدات الوقاية الشخصية مثل معالج القفص الأساسي ، على الرغم من أنه قد يرتدي ثوبا جراحيا غير معقم.
2. تحضير خزانة السلامة الحيوية
   1. ضع 10 مناديل في خزان غمس معقم بثاني أكسيد الكلور وتأكد من نقعها تماما.
   2. انقل المناديل المبللة إلى خزانة السلامة الحيوية وانقع جميع أسطح الخزانة بالترتيب التالي من الخلف إلى الأمام: سطح عمل مسطح ، الجانب الأيسر ، الجزء الخلفي من غطاء المحرك ، الجانب الأيمن ، والزجاج الداخلي الأمامي. قم بإجراء نقع غير ملامسة للأسطح غير المحمية لخزانة السلامة الحيوية عن طريق الضغط على المناديل المبللة على هذه الأسطح دون لمسها.
   3. بعد جولة واحدة من التنظيف ، ضع المناديل المبللة مرة أخرى في خزان غمس معقم بالكلور وثاني أكسيد الكلور لتنقع.
3. تحضير الأحجار
   1. قم بإعداد كيس بلاستيكي كبير عن طريق ملئه بما لا يقل عن 100 مل من معقم ثاني أكسيد الكلور باستخدام أسطوانة متدرجة ورج الكيس لضمان نقع جميع الأسطح الداخلية. ضع الكيس على أي سطح مستو.
   2. قم بإزالة أنبوب واحد من الرف وضعه في خزان غمس معقم بثاني أكسيد الكلور بحيث يتلامس كل سطح من القفص مع السائل. استخدم المناديل المبللة في الخزان لفرك أسطح القفص لضمان ملامسة السوائل بالكامل.
   3. بعد نقع القفص ، اطلب من المساعد فتح الكيس البلاستيكي المنقوع. ضع القفص في الكيس ، واطلب من المساعد إغلاق الفتحة على الفور. رش فتحة الكيس بمعقم ثاني أكسيد الكلور باستخدام زجاجة الرش. اتبع هذا الإجراء لكل قفص يتم استخدامه. يمكن وضع ما يصل إلى أربعة أقفاص في حقيبة واحدة مقاس 36 بوصة 32 بوصة 48 بوصة.
   4. اغمر أكبر عدد ممكن من زجاجات المياه المعقمة سعة 1 لتر حسب الحاجة (1 لتر ماء لقفصين) في خزان غمس معقم بثاني أكسيد الكلور ، ثم ضعها في كيس بلاستيكي آخر مبلل. عندما يتم وضع جميع المستلزمات في الكيس ، أغلق الكيس ورش فتحة الكيس بمعقم ثاني أكسيد الكلور باستخدام زجاجة الرش.
   5. بمجرد تعبئة جميع الأقفاص والإمدادات ، اغمر القفازات المقاومة للمواد الكيميائية في معقم ثاني أكسيد الكلور (إلى أقصى حد ممكن من القفازات دون الوصول إلى الفتحة).
4. فترة تعقيم 20 دقيقة
   1. يتطلب التعقيم الكامل ما لا يقل عن 20 دقيقة من وقت ملامسة السائل. بمجرد تعقيم العنصر الأخير وإغلاق كيس النقع البلاستيكي ، اطلب من المساعد ضبط مؤقت لمدة 20 دقيقة. تأكد من أنه بعد بدء المؤقت ، لا تلمس القفازات المقاومة للمواد الكيميائية أي سطح غير مبلل بمعقم ثاني أكسيد الكلور.
   2. قم بإجراء عملية تعقيم خزانة السلامة الحيوية (الخطوة 3.2) بشكل متكرر حتى يشير المؤقت إلى مرور 20 دقيقة.
   3. اطلب من المساعد هز الأسطح الخارجية للكيس البلاستيكي المنقوع بشكل متكرر لضمان ملامسة سائل متسقة لأسطح القفص والزجاجات بداخلها.
   4. بعد فترة 20 دقيقة ، اطلب من المساعد فتح الكيس البلاستيكي المنقوع للكشف عن الأقفاص وزجاجات المياه المعقمة ، مع الحرص على لمس الأسطح الخارجية للكيس فقط.
   5. باستخدام القفازات المعقمة المقاومة للمواد الكيميائية ، انقل كل قفص وزجاجة إلى خزانة السلامة الحيوية المعقمة. إذا كان هناك عدد كبير جدا من الأقفاص بحيث لا يمكن وضعها في خزانة السلامة الحيوية ، فاترك الأقفاص المتبقية في الأكياس البلاستيكية لأنها ستظل معقمة طالما أن فتحة الكيس البلاستيكي مغلقة وغارقة بمعقم ثاني أكسيد الكلور بين كل فتحة.

4. نقل الماوس الخالي من الجراثيم

1. تحضير الأحجار
   1. لفتح المشابك محكمة الغلق ، ارفع الألسنة البيضاء على المشابك الموجودة على جانبي الغطاء ثم اسحب كل مشبك جانبيا. يجب أن يكون الغطاء خاليا من الجزء السفلي من القفص لرفع الغطاء عن القفص. ضع الغطاء رأسا على عقب على يسار القفص واستخدمه كمحطة عمل معقمة.
      ملاحظة: بديل لاستخدام أغطية الأقفاص أو الجزء الداخلي من أكياس الأدوات المعقمة كسطح عمل معقم هو استخدام الستائر المعقمة ، والتي توفر مساحة سطح أكبر وتمنع التلوث غير المقصود لغطاء القفص في حالة حدوث خطأ.
   2. باستخدام الملقط المعقم الموجود داخل القفص أعلى الرف السلكي ، قم بإزالة زجاجة الماء الفارغة وضعها داخل الغطاء. افتح زجاجة الماء سعة 1 لتر عن طريق إزالة الختم المطاطي ، واسكب الماء في زجاجة الماء لملئها. ضع الفوهة على زجاجة الماء باستخدام الملقط واضغط لأسفل بقوة لإغلاقها.
   3. استخدم ملقطا معقما لرفع الرف السلكي ووضعه للخلف عدة بوصات للسماح بفتح قاع القفص. ضع الملقط المعقم على الرف السلكي ، مع التأكد من عدم ملامسة المقابض لأسطح الأقفاص.
2. استخدام قرص النقل
   ملاحظة: الموظفون المدربون الخاليون من الجراثيم مسؤولون عن رعاية وصيانة عوازل التربية. نظرا للمخاطر المرتبطة بفتح عوازل التكاثر ، يقوم هؤلاء الموظفون بتعقيم قرص النقل وإعداده ونقل الفئران الخالية من الجراثيم من العوازل إلى الموازين. لوصف العملية بإيجاز ، يتم تحضير أقراص النقل في أسطوانة قابلة للتعقيم للسماح بالتعقيم. تستخدم المؤشرات البيولوجية للتحقق من عقمها. يتم تعقيم الشريط لإغلاق أقراص النقل داخل الأسطوانة أيضا. يتم توصيل الأسطوانة المعقمة التي تحيط بهذه المواد عبر غلاف نقل إلى العازل ، ويتم نقل الفئران من الأقفاص إلى القرص. ثم يتم وضع الغطاء على القرص ، ويتم استخدام شريط معقم لإنشاء ختم محكم على محيط القرص وفتحات الهواء. يتم وضع القرص المغلق على الفور في منفذ الخروج من المعزل. ثم يتم إغلاق غطاء منفذ المعزل المنزلي ، ويتم مسح الجزء الخارجي من القرص جيدا بمعقم ووضعه في كيس مبلل بالتعقيم ، ويتم مراقبته لمدة 20 دقيقة لضمان إزالة التلوث الكامل. ثم يقوم موظفو التربية الخالية من الجراثيم بتسليم هذه الأقراص إلى موظفي الدراسة. لا يمكن الاحتفاظ بالفئران في القرص المغلق لمدة تزيد عن 30 دقيقة من وقت إغلاق قرص النقل ، لذلك من الضروري أن تكون جميع الخطوات السابقة في هذا البروتوكول قد اكتملت بوقت كاف قبل وصول قرص النقل.
   1. عند استلام قرص النقل، اطلب من المساعد أن يمسك الغطاء البلاستيكي ويفكه جزئيا بحيث يتعرض السطح المنقوع لقرص النقل ولكن لا يلمسه المساعد.
   2. عند استلام قرص النقل، اطلب من المساعد أن يمسك الغطاء البلاستيكي ويفكه جزئيا بحيث يتعرض السطح المنقوع لقرص النقل ولكن لا يلمسه المساعد.
   3. ارتداء القفازات المقاومة للمواد الكيميائية المنقوعة في معقم ثاني أكسيد الكلور ، قم بإزالة قرص النقل من الغلاف البلاستيكي ، مع الحرص على عدم لمس أي سطح غير مبلل بالمعقم . ثم ضع قرص النقل على السطح المسطح لخزانة السلامة الحيوية المعقمة.
   4. لفتح قرص النقل ، انزع الشريط ، وأغلق محيط القرص ، وتخلص منه خارج خزانة السلامة الحيوية. قم بإزالة غطاء قرص النقل وتخلص منه خارج خزانة السلامة الحيوية.
   5. يوجد داخل قرص النقل غطاء حجرة قابل للدوران بفتحة واحدة. استخدم الملقط المعقم الذي كان عليه مسبقا على الرف السلكي للقفص لمعالجة غطاء المقصورة هذا لنقل الفتحة إلى الماوس اللازم للنقل.
3. نقل الفئران من القرص إلى القرص
   1. باستخدام الملقط ، أمسك قاعدة ذيل الماوس من خلال الفتحة الموجودة في غطاء القرص البلاستيكي ، وارفع الماوس وانقله إلى الماوس من خلال الفراغ المفتوح مسبقا بين رف السلك والقفص. كرر مع جميع الفئران الموجهة إلى هذا القفص.
   2. بمجرد نقل جميع الفئران إلى هذا الملقط ، استبدل رف السلك باستخدام الملقط. ثم ارفع غطاء القفص وضعه مرة أخرى فوق القفص باستخدام الملقط.
   3. ارفع كل مشبك من غطاء القفص لأعلى وخفضه بحذر على جوانب القفص ، متبوعا بدفع الألسنة البيضاء لإغلاق غطاء القفص.
   4. بمجرد إغلاق القفص ، اطلب من المساعد رش كل فوهة من موقع الإرساء على رف القفص بمعقم ثاني أكسيد الكلور. بعد ذلك ، قم بإزالة القفص من غطاء المحرك وقم بتمريره إلى المساعد ، الذي يمكنه بعد ذلك إرساء القفص على الرف.
   5. كرر هذه الخطوات لكل ماوس في قرص النقل.
4. تنظيف خزانة السلامة الحيوية
   1. عند الانتهاء من جميع عمليات نقل الماوس إلى الماوس ، قم بإفراغ غطاء المحرك من أي حطام وامسحه تماما بمناديل مبللة بالتعقيم بثاني أكسيد الكلور.
   2. امسح الشفاط بكحول الأيزوبروبيل لإزالة بقايا معقم ثاني أكسيد الكلور. تجمع المساحة الموجودة أسفل سطح العمل للغطاء كمية كبيرة من المعقم من عملية التعقيم. قم بإزالة هذا عن طريق الامتصاص بمناديل جافة وامسحه بكحول الأيزوبروبيل.
   3. تخلص من معقم ثاني أكسيد الكلور السائل عن طريق تصريف الحوض بعد 24 ساعة من التنشيط. التخلص من المواد الصلبة الملوثة بالمواد المعقمة كنفايات عادية.
      ملاحظة: تترك الفئران الخالية من الجراثيم المنقولة إلى ظروف الإعاقة لمدة أسبوع واحد للتأقلم مع بيئتها الجديدة قبل أي تدخل. هذا يقلل من الإجهاد الذي تعاني منه ، مما قد يتداخل مع نتائج الدراسة. في نهاية فترة التأقلم هذه التي تبلغ أسبوعا واحدا ، اجمع البراز كما هو موضح في الخطوة 6 لتأكيد حالة خالية من الجراثيم قبل أي تدخل.

5. التزقيم الفموي للملاط البراز البشري إلى الفئران الخالية من الجراثيم

1. تحضير مستلزمات التزقيم المعقمة
   1. ضع إبر التزقيم الفموية في أكياس التعقيم ذاتية الغلق (1 لكل فأر) ومحاقن معقمة سعة 1 مل في أكياس تعقيم ذاتية الغلق (1 لكل فأر) قبل يوم واحد من إجراء التزقيم الفموي. ضع هذه أكواب البولي بروبلين سعة 600 مل (1 لكل فأر) وزوج من الملقط الطويل في كيس آمن للأوتوكلاف وقم بتعقيمها عن طريق الأوتوكلاف.
   2. فور إخراج الكيس من الأوتوكلاف ، أغلق الكيس بشريط تغليف وقم بتخزينه حتى اليوم التالي.
2. تحضير ملاط البراز البشري
   1. في يوم التزقيم ، قم بنقل البراز البشري المتجانس والمخزن في وسائط الحفظ اللاهوائية (في هذه الحالة ، وسائط نقل الأسنان السائلة) من الفريزر -80 درجة مئوية إلى الغرفة اللاهوائية. تمييع مادة البراز المتجانسة حوالي 1:10 في محلول ملحي معقم لاهوائي في أنبوب مخروطي سعة 10 مل.
   2. أغلق الأنبوب الذي يحتوي على ملاط البراز البشري بالبارافيلم ، وتجانسه بواسطة الدوامة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 200 جم لمدة 5 دقائق لتسوية الجسيمات.
   3. ضع الأنبوب مرة أخرى في الغرفة اللاهوائية وانقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 10 مل. أغلق الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية البرازية البشرية بالبارافيلم ، وقم بإزالته من الغرفة اللاهوائية ، وضعه في حاوية ثانوية مانعة للتسرب. انقل الحاوية مع كيس إمدادات التزقيم المعقم إلى موقع سكن.
      ملاحظة: من الضروري تقدير إجمالي CFU / مل من البراز البشري المخصص للتزقيم لأغراض الإبلاغ. من غير الواضح ما هو الحد الأدنى من حمل CFU لضمان الاستعمار الكافي ، لكن ارتفاع CFUs يؤدي إلى نقش أفضل للبراز المتبرع¹³. إذا أدى حمل CFU للمواد البرازية البشرية إلى انخفاض معدلات النقش ، فتذكر عينات البراز البشرية. سيؤدي استخدام وسائط الحفاظ على الجدوى إلى تعزيز استعادة CFU من عينات البراز التي تم جمعها. لتحديد تعداد CFU اللاهوائي / الهوائي لبراز المتبرع ، قم بتخفيف العينة بشكل متسلسل إلى 1 × ^10-5 ولوحة 10 ميكرولتر من كل تخفيف في نسختين على ألواح أجار BHI و LB الهوائية واللاهوائية. بعد 24 ساعة (هوائية) و 48 ساعة (لاهوائية) ، احسب CFU لكل جرام من البراز.
3. تحضير الأحجار
   1. كرر الخطوتين 2 و 3 ، مع الاختلاف الوحيد الآن هو وجود فئران موجودة في هذه الأقفاص ، ويجب توخي الحذر لضمان أنه في غضون 30 دقيقة من إزالة الرف ، يتم وضع كل مفصل في غطاء المحرك المعقم وتنفيس الغطاء للسماح بتدفق الهواء إلى الفئران.
   2. قم بتعقيم كيس مادة التزقيم المعقم وأنبوب الملاط البرازي البشري من الخطوتين 5.1 و 5.2 عن طريق تشبع معقم ثاني أكسيد الكلور بطريقة مشابهة لزجاجات المياه (أي اغمرها في مادة معقمة ثم ضعها في كيس مبلل بالتعقيم).
   3. انقل الأحجار الوافية ومستلزمات التزقيم عن طريق الفم إلى خزانة السلامة الحيوية بعد الانتهاء من فترة التعقيم البالغة 20 دقيقة. قم بثقب كيس الإمداد المعقم عن طريق دفع الكيس مقابل الملقط الطويل الموجود بداخله ، ثم قم بإزالة المستلزمات وتخلص من الكيس خارج غطاء المحرك.
4. التزقيم
   1. ارتد ثوبا جراحيا معقما جديدا وقفازات جراحية معقمة بدلا من القفازات المقاومة للمواد الكيميائية لمنع بقايا معقم ثاني أكسيد الكلور من ملامسة الفئران. اطلب من المساعد المساعدة في هذه العملية إذا لزم الأمر.
   2. قم بإعداد إبر التزقيم عن طريق فك كل كيس تعقيم واستخدم الجزء الداخلي من الحقيبة كسطح راحة جاف ومعقم. قم بتوصيل إبرة التزقيم بكل حقنة ، وافتح أنبوب الملاط البرازي ، واسحب 200 ميكرولتر من الملاط البرازي في كل حقنة.
   3. باستخدام الملقط ، أمسك قاعدة ذيل فأر واحد في القفص وضعها على رف السلك. كبح الماوس برفق عن طريق الجرجر ، وأثناء إمساك الماوس في وضع رأسي رأسي ، أدخل الإبرة وحقن الملاط البرازي برفق ، متبوعا بالإزالة الفورية للإبرة.
   4. ضع الماوس مباشرة في أحد الأكواب المعقمة للمراقبة. كرر العملية لكل فأر في القفص. بعد أن تتلقى جميع الفئران التزقيم ، استخدم الملقط لتحريك كل فأر مرة أخرى إلى سرير القفص وإغلاق القفص كما هو موضح في الخطوات 4.3.2-4.3.4.
      ملاحظة: في الحالات التي يتم فيها استخدام ملاط براز منفصل أو أكثر ، يلزم إعادة التعقيم الكامل لخزانة السلامة الحيوية والأقفاص والمواد المطلوبة. في الحالات التي تظل فيها مجموعة من الفئران خالية من الجراثيم ، يوصى بأن تتلقى هذه الفئران تزويقها قبل علاج أي مجموعة أخرى.
   5. اتبع الإجراء الوارد في الخطوة 4.4 للتخلص من المواد المعقمة بثاني أكسيد الكلور والمواد المنقوعة بالمعقمات. معالجة أي مواد ملوثة بالملاط البراز البشري كنفايات طبية حيوية والتخلص منها وفقا لإجراءات الصحة والسلامة البيئية.

6. جمع البراز من الفئران المتوافقة مع البشر للحفاظ على الجدوى

1. تحضير المستلزمات المعقمة
   1. ضع ملقطا قصيرا عريضا في أكياس تعقيم ذاتية الغلق (1 لكل ماوس) ، وأكواب 600 مل من مادة البولي بروبيلين (1 لكل فأر) ، وزوج من الملقط الطويل في كيس آمن للأوتوكلاف وتعقيمه عن طريق الأوتوكلاف قبل يوم واحد من إجراء جمع البراز.
   2. فور إخراج الكيس من الأوتوكلاف ، أغلق الكيس بشريط تغليف وقم بتخزينه حتى اليوم التالي.
2. إعداد أنبوب وسائط الحفظ
   1. حدد وسائط الحفاظ على الجدوى اللاهوائية (هنا تم استخدام كاري بلير). Aliquot 1 مل من وسائط الحفظ في أنابيب معقمة ولولبية 2 مل في خزانة السلامة الحيوية. يوصى بنسبة 1:10 براز: الوسائط للحفظ الأمثل.
   2. قم بتسمية كل أنبوب مسبقا بعلامة دائمة ، ولكن كن على دراية بأن التعرض لمعقم ثاني أكسيد الكلور يمكن أن يزيل ملصقات العلامات الدائمة من الأسطح البلاستيكية. هناك طريقة أخرى تتمثل في ترك الأنابيب بدون تسمية والحصول على أنابيب الملصقات المساعد مباشرة بعد التجميع قبل التجميد.
   3. ضع هذه الأنابيب في رف أنبوب قياسي من مادة البولي بروبلين للسماح بتخزين الأنابيب في وضع مستقيم مع الاستمرار في تمكين التعقيم عن طريق ملامسة معقم ثاني أكسيد الكلور.
3. أقفاص التعقيم وخزانة السلامة الحيوية
   1. كرر الخطوتين 2 و 3 لتعقيم الأيزوكاج وخزانة السلامة الحيوية. مرة أخرى ، احرص على التأكد من أنه في غضون 30 دقيقة من إزالة الرف ، يتم وضع كل إيسوكاج في الغطاء المعقم ، ويتم تنفيس الغطاء للسماح بتدفق الهواء إلى الفئران.
   2. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعقيم كيس الإمداد المعقم والرف الذي يحتوي على أنابيب محضرة عن طريق تشبع معقم ثاني أكسيد الكلور ووضعه في الكيس البلاستيكي المنقوع الذي يحتوي على الأقفاص. الهدف هو ملامسة السائل الكامل لجميع أسطح كل أنبوب والرف نفسه.
4. جمع عينات البراز وتخزينها
   1. انقل الأيزوكاج والإمدادات المعقمة ورف الأنبوب إلى خزانة السلامة الحيوية بعد الانتهاء من فترة التعقيم البالغة 20 دقيقة. قم بثقب كيس الإمداد المعقم عن طريق دفع الكيس مقابل الملقط الطويل الموجود بداخله ، وقم بإزالة المستلزمات وتخلص من الكيس خارج غطاء المحرك.
   2. ارتد ثوبا جراحيا معقما جديدا وقفازات جراحية معقمة بدلا من القفازات المقاومة للمواد الكيميائية لمنع بقايا معقم ثاني أكسيد الكلور من ملامسة الفئران. اطلب من المساعد المساعدة في هذه العملية إذا رغبت في ذلك.
   3. قم بإعداد ملقط الطرف غير الحاد عن طريق فك الأكياس واستخدام سطح الحقيبة الداخلي كمنطقة معقمة. ضع رف الأنبوب على سطح غطاء السلامة الحيوية.
   4. باستخدام ملقط طويل ، أمسك قاعدة ذيل فأر واحد في القفص وضعها مباشرة في أحد الأكواب المعقمة للمراقبة. كرر هذه العملية لكل فأر في القفص.
   5. راقب الفئران حتى يتم إنتاج حبيبات براز حديثة على الأقل.
      1. باستخدام ملقط الطرف غير الحاد ، التقط الكريات البرازية وضعها مباشرة في الأنبوب. أغلق غطاء الغطاء اللولبي على الفور وقم بتمريره إلى المساعد.
      2. اطلب من المساعد تسمية الأنبوب وتجانس البراز على الفور عن طريق الدوامة. بمجرد أن يكون متجانسا ، قم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل وتخزينه على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
   6. كرر عملية جمع البراز لكل فأر في القفص. استبدل كل فأر في قفص المنزل بعد جمع البراز ، وأعد إرساء الأقفاص على الرف. كرر الخطوة 4.4 لتنظيف الشفاط والتخلص من النفايات.

تم تجميع عينات البراز البشرية ، التي تم تجميعها بواسطة المستجيب ل ICI والنمط الظاهري غير المستجيب (الموصوف سابقا في البروتوكول) ، إلى فئران GF-WT مختلطة من الجنس توجد في 3 متساويات لكل مجموعة (ن = 1-2 فئران / قفص ، ن = 6 للمستجيب و ن = 5 لغير المستجيبين). سمح للفئران بالتأقلم لمدة أسب...

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة قابلة للتكرار ومفصلة للغاية لإضفاء الطابع الإنساني على الفئران الخالية من الجراثيم الموجودة في التجارب التجريبية. إن القدرة على زرع مجتمعات البراز حصريا من البشر إلى مضيفات الفئران لا تقدر بثمن لأبحاث الميكروبيوم. بدون تلوث من الجراث?...

لا يوجد تضارب في المصالح بين المؤلفين.

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لقسم الخدمات الخالية من الجراثيم في خدمات رعاية في UF للمساعدة في تربية الجنوتبيوتيك ، وللدكتورة بروك بلومبرج والدكتورة لورا أوريل للمساعدة البيطرية و IACUC ، وجوزي غوتييه للمساعدة في تسلسل جين 16S rRNA. تم دعم هذا البحث ، جزئيا ، من قبل صناديق مركز UF الصحي للسرطان (CJ) وصندوق جاتوريد التابع لوزارة الطب في جامعة فلوريدا (CJ). R.Z.G. تم دعمه من قبل أموال مركز UF الصحي للسرطان. تم دعم R.C.N. من قبل منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة TL1 في جامعة فلوريدا (TL1TR001428 ، UL1TR001427) ، والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعهد الوطني للصحة القائم على فريق المعاهد الوطنية للصحة ، وجائزة برنامج التدريب على أبحاث السرطان متعدد التخصصات القائم على المعاهد الوطنية للصحة T32CA257923 ومركز UF الصحي للسرطان. تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل مركز UF الصحي للسرطان ، مدعوما جزئيا باعتمادات الدولة المقدمة في فلوريدا. إحصائيات § 381.915 والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم P30CA247796. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو ولاية فلوريدا. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.