Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

Este protocolo describe las mejores prácticas para la transferencia y el alojamiento de ratones libres de gérmenes en aisladores experimentales de una sola jaula (isojaulas) mientras se mantienen las condiciones estériles. Se discuten los métodos para el trasplante fecal en ratones libres de gérmenes y la recolección de bacterias viables de estos ratones "humanizados" intestinales para aplicaciones posteriores.

Los ratones libres de gérmenes son una importante herramienta de investigación para comprender la contribución de los microorganismos en la salud y la enfermedad del huésped, lo que permite evaluar el papel específico de los individuos, grupos definidos o complejos de microorganismos en la respuesta del huésped. Criados y criados tradicionalmente en aisladores de película flexible o semirrígidos, la cría de ratones libres de gérmenes y la manipulación experimental son costosos y requieren un gran número de personal capacitado y un gran espacio en las instalaciones de alojamiento de animales. El sistema de jaulas IsoPositive permite la manipulación experimental de ratones libres de gérmenes en jaulas aisladas (isojaulas) individuales, herméticamente selladas y con presión positiva, lo que reduce los costos y permite una mayor flexibilidad en las manipulaciones experimentales.

Aquí, se describe un protocolo para transferir ratones libres de gérmenes de los aisladores de cría a las isojaulas y la posterior transferencia fecal de las heces de donantes humanos a los ratones para crear ratones "humanizados" intestinales estables a largo plazo para estudios futuros. Se describen los materiales y la preparación necesarios para la utilización del sistema isocage, incluido el uso de esterilizante químico de dióxido de cloro para limpiar jaulas, suministros, equipos y equipos de protección personal. Se discuten los métodos para confirmar el estado libre de gérmenes de los ratones transferidos y cómo determinar la contaminación en el sistema de jaula. Se discute más a fondo el procedimiento para la cría, incluida la cama, la alimentación y el suministro de agua. Se describe el protocolo para la preparación de purines fecales humanos y la sonda nasogástrica en ratones libres de gérmenes para crear ratones "humanizados" intestinales, junto con la recolección de heces para monitorear la composición de la comunidad microbiana de estos ratones. Un experimento ilustra que dos semanas después del trasplante fecal humano permite una colonización estable de la microbiota del donante en los huéspedes murinos, lo que permite su posterior uso experimental. Además, se describe la recolección de heces de ratón humanizadas en medios de preservación de la viabilidad, lo que permite su uso en experimentos funcionales posteriores. En general, estos métodos permiten el establecimiento seguro y eficaz de comunidades de ratones humanizados en jaulas gnotobióticas experimentales para su posterior manipulación.

Los ratones libres de gérmenes son una herramienta esencial en el repertorio de los investigadores del microbioma, ya que permiten diseccionar la contribución de la microbiota en los estados de salud y enfermedad del huésped. Los ratones libres de gérmenes nacen completamente estériles y permanecen axénicos durante toda su vida¹. La colonización de ratones libres de gérmenes con cepas bacterianas específicas permite estudios causales entre esos taxones y las funciones metabólicas, inmunitarias u otras funciones del huésped 2,3,4,5. Particularmente ventajosa es la capacidad de "humanizar" ratones libres de gérmenes a nivel de la microbiota mediante el trasplante de heces obtenidas de donantes humanos y, cuando se alojan en condiciones de barrera, evitan la contaminación por microorganismos derivados de la murino¹. Este enfoque ha permitido muchos descubrimientos importantes en el campo del microbioma, por ejemplo, el efecto del microbioma intestinal humano en la respuesta a la inmunoterapia contra el cáncer ^6,7,8.

Sin embargo, aunque los ratones humanizados libres de gérmenes son invaluables para los esfuerzos de investigación en el campo del microbioma, existen muchas limitaciones que han inhibido la adaptación más amplia de este enfoque. Los ratones libres de gérmenes se crían y mantienen en grandes aisladores semirrígidos o de película flexible, pero los experimentos funcionales requieren que se establezcan mini-aisladores separados, con un mini-aislador que alberga varias jaulas, pero solo bajo una condición experimental. Este enfoque de mini-aislador aumenta la huella espacial y el costo, al tiempo que limita severamente el número de condiciones experimentales que se pueden investigar en un experimento y el número de experimentos que se pueden ejecutar en paralelo. Una solución prometedora es el uso de un sistema de jaula individual y modular llamado sistema de bioexclusión ISOcage P (en adelante, sistema isocage)^9,10. El sistema isocage permite la manipulación experimental de ratones libres de gérmenes en jaulas aisladas individuales, herméticamente selladas y con presión positiva, lo que permite condiciones experimentales separadas entre cada jaula en lugar de entre cada miniaislador. Con la técnica aséptica adecuada, los animales pueden ser alojados en isojaulas durante un máximo de 12 semanas en condiciones libres de gérmenes o humanizados mediante trasplante fecal humano para su uso en cualquier enfoque experimental compatible (es decir, puede realizarse en condiciones asépticas). Se pueden ejecutar múltiples experimentos independientes en paralelo utilizando el sistema isocage, y la huella de espacio y el costo son dramáticamente menores que la ejecución de múltiples experimentos en mini-aisladores.

El propósito de la cría de ratones libres de gérmenes en aisladores de reproducción de película flexible es preservar cuidadosamente el estado axénico¹¹. Las técnicas utilizadas para monitorear el estado libre de gérmenes incluyen hisopos de rutina de superficies corporales y cavidades orales de ratones, así como la recolección aséptica de muestras fecales, que se cultivan y analizan mediante ensayos comerciales basados en PCR. Se requieren pruebas bacterianas, serológicas y fúngicas de estas muestras para determinar^{el estado libre} de gérmenes. Cuando los ratones libres de gérmenes se transfieren de los aisladores de cría a las isojaulas para uso experimental, los ratones se frotan con muestras y se prueban para validar su estado libre de gérmenes en el momento de la transferencia. Los controles de esterilidad de Isocage se realizan mediante la recolección aséptica de muestras fecales, que luego se cultivan para la detección de contaminantes bacterianos, virales y fúngicos. Es necesario recopilar y registrar cuidadosamente los resultados de estos controles de esterilidad desde el nacimiento hasta el final de un protocolo experimental para validar el estado libre de gérmenes de estos ratones.

El sistema de isojaula está compuesto por jaulas individuales (Figura 1), discos de transferencia para el transporte fuera de los aisladores de cría (Figura 1) y el bastidor de isojaula, que alberga las jaulas (Figura 2). Cada isojaula contiene un filtro de aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) a nivel de jaula instalado en la entrada de aire de suministro y una junta de silicona que hace un sello hermético cuando está cerrada, lo que garantiza que ningún contaminante pueda ingresar a la jaula a través del aire (Figura 1A). Esta tapa de jaula se puede utilizar como superficie de trabajo estéril cuando se coloca boca abajo dentro de un gabinete de bioseguridad esterilizado (Figura 1A). Una rejilla de alambre dentro de la jaula sostiene la botella de comida y agua (Figura 1B). Las pinzas esterilizadas en autoclave dentro de la jaula se utilizan para todas las manipulaciones que requieren contacto con las superficies interiores de la jaula. La jaula en sí tiene muescas para un tarjetero de jaula extraíble para identificar a los animales en el exterior y boquillas de entrada y exportación de aire que se acoplan al estante de isocage (Figura 1C-E). Las abrazaderas de cierre seguras y un bloqueo de lengüeta en la tapa sellan la jaula cuando está lista para ser reacoplada en el sistema de bastidores (Figura 1F). La ropa de cama sugerida es Alpha-dri, y también se recomienda una cabaña de enriquecimiento esterilizable en autoclave (Figura 1F). Los discos de transferencia se utilizan para mover ratones libres de gérmenes desde los aisladores de cría hasta las isojaulas y contienen una tapa de compartimento giratoria con una abertura triangular para permitir la manipulación de los animales (Figura 1G-H). Los discos vienen en tamaños pequeños (21,6 cm de diámetro) y grandes (28 cm de diámetro), ambos con una capacidad de ocho ratones. La cinta esterilizada en autoclave se utiliza para crear sellos herméticos en la circunferencia y los orificios de aire del disco, lo que se realiza antes del remojo con esterilizante y el transporte en una bolsa empapada en esterilizante (Figura 1I). El sistema de rack en sí tiene una pantalla para monitorear los sopladores de aire, el estado del filtro HEPA a nivel de rack y la energía de emergencia de la batería para el rack, que son todas características incluidas en el sistema (Figura 2A). Un manómetro Magnehelic adjunto muestra la presión positiva mantenida por el sistema de jaulas, y un indicador visual de acoplamiento automático muestra el estado de acoplamiento de las jaulas (la lengüeta amarilla hacia afuera significa que no hay jaula acoplada, o que la jaula no tuvo éxito) (Figura 2B-D). También es necesario para la manipulación de isojaulas un gabinete de bioseguridad certificado estándar.

El protocolo presentado aquí describe los métodos adecuados para la transferencia exitosa de ratones libres de gérmenes de los aisladores de cría en condiciones asépticas a las isojaulas mientras se mantiene el estado libre de gérmenes, la humanización de ratones libres de gérmenes con purín fecal de donantes humanos y la recolección de heces de ratones alojados en la isojaula para la confirmación del estado libre de gérmenes o la preservación de la viabilidad para estudios funcionales posteriores. En este ejemplo, los ratones libres de gérmenes se humanizan con muestras fecales agrupadas de sujetos humanos tratados con inmunoterapia para el cáncer de pulmón y se dicotomizan como respondedores o no respondedores a la terapia. En este caso, el fenotipo de la respuesta a la inmunoterapia se transfirió mediante la humanización de la microbiota intestinal a los ratones receptores, que luego pudieron ser inoculados con células tumorales y tratados con inmunoterapia. El protocolo de purín fecal humano se puede adaptar fácilmente a cualquier heces de donante humano o a cualquier modelo preclínico de enfermedad que el investigador desee. Con este protocolo, es posible transferir cualquier microbiota fecal humana de un donante al huésped libre de gérmenes, lo que permite seguir investigando el papel de la microbiota en la salud y la enfermedad.

Figura 1: Diagrama esquemático de la isojaula y los discos de transferencia. (A) Vista de arriba hacia abajo de la parte inferior de la tapa de la jaula, con etiquetas que indican la ubicación del filtro HEPA interno a nivel de la jaula y el sello de la junta de silicona. (B) Vista de arriba hacia abajo del interior de la jaula, con etiquetas que indican la tapa de la barra de alambre, la botella de agua interna y el pico, y la ubicación en el estante de alambre para contener comida esterilizable en autoclave. (C) Vista frontal de la jaula que muestra muescas para el tarjetero de la jaula. (D) Vista de arriba hacia abajo de una jaula completa con la tapa en la parte superior, que muestra cómo se instala el filtro HEPA en la boquilla de entrada de aire. (E). Vista trasera de la jaula que muestra las boquillas de entrada y exportación de aire que se acoplan al sistema de bastidor isocage. (F) Vista lateral de una jaula completa con la tapa en la parte superior, con etiquetas que indican las abrazaderas de cierre seguras en la posición abierta, con lengüetas blancas en cada abrazadera que las bloquean en su lugar. El interior de la jaula muestra ropa de cama Alpha-dri en capas en la parte inferior y una cabaña de enriquecimiento sugerida colocada en la ropa de cama. (G) Vista de arriba hacia abajo de los discos de transferencia con la tapa en la parte superior. (H) Vista superior hacia abajo del interior del disco de transferencia, que muestra la tapa del compartimento giratorio con una abertura triangular para permitir la manipulación de los animales. (I) Vista lateral del disco de transferencia completamente ensamblado que muestra la colocación de la cinta esterilizada en autoclave, lo que crea un sello hermético durante la transferencia del aislador de cría a la isojaula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama esquemático del sistema de estanterías isocage. (A) Estantería isojaula completa con jaulas acopladas y una etiqueta que indica la pantalla de monitoreo para el estado del soplador de aire, el estado del filtro HEPA y la batería de emergencia. En la parte inferior izquierda del bastidor se encuentra la ranura para el filtro HEPA a nivel de bastidor. (B) Manómetro Magnehelic adjunto que muestra la presión positiva mantenida por el bastidor. (C) Una isojaula acoplada sin indicador de acoplamiento amarillo visible, que demuestre una conexión exitosa entre el bastidor y las boquillas de aire. (D) Una ranura vacía en el bastidor, con un indicador visual de acoplamiento automático visible que indica que no hay ningún bastidor en su lugar y que no hay conexión de las boquillas de aire con una isojaula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Florida (UF) y se realizaron en las Instalaciones de Cuidado Animal de la UF (Protocolo #IACUC202300000005 IACUC). Las colonias de especies silvestres libres de gérmenes (GF WT; C57BL/6) ratones fueron criados y mantenidos en aisladores por la División Libre de Gérmenes de UF Animal Care Services. Los ratones GF WT de género mixto se transfirieron de los aisladores de cría y se colocaron en el sistema de bioexclusión ISOcage P para permitir la manipulación microbiana.

Las muestras fecales humanas se obtuvieron de un estudio observacional prospectivo que recolectó muestras longitudinales de heces de pacientes que recibieron tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI)¹². Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes después de la aprobación del estudio por Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Los sujetos recibieron y completaron un kit de recolección de heces de medio de transporte dental líquido (LDTM) destinado a preservar la viabilidad bacteriana para estudios funcionales. La evaluación de la respuesta caracterizó a n=4 muestras como respondedoras (R) y n=6 como no respondedoras (NR). Las muestras homogeneizadas de pacientes conservadas con LDTM se descongelaron individualmente, cada una se colocó en una cámara anaeróbica durante no más de 90 s y se agruparon según el fenotipo de respuesta (R: n = 4, NR: n = 6). A continuación, las muestras agrupadas se alícustolan y se congelan a -80 °C para su uso en este protocolo. Para determinar los recuentos de unidades formadoras de colonias anaerobias (UFC) de las heces del donante, las heces de cada sujeto se diluyeron en serie a 1 × ^10-5, y 10 μL de cada dilución se sembraron por duplicado en placas anaeróbicas de infusión cerebro-corazón (BHI) y agar Luria Bertani (LB) y se estimaron los recuentos de UFC por gramo de heces. Las UFC iguales de cada sujeto se agruparon en muestras de inóculo fecal para su sonda nasogástrica en ratones.

1. Preparación de jaulas y autoclave

1. Preparación de Isocage
   1. Llene previamente las jaulas con ~ 500 ml de dieta 2018SX o cualquier dieta fortificada esterilizable en autoclave que desee y cubra el fondo con ropa de cama ALPHA-dri. Coloque una cabaña de enriquecimiento esterilizable en autoclave en la cama de la jaula. Coloque una botella de agua vacía y sin sellar y una boquilla y pinzas largas de punta ancha encima de la rejilla de alambre.
   2. Coloque un indicador biológico de doble especie en el alimento dentro de una jaula por ciclo de autoclave. Coloque una tira integradora de productos químicos en el exterior de cada jaula.
   3. Autoclave las jaulas en un ciclo de vacío durante 45 minutos a 121 °C y un mínimo de 15 PSI, seguido de un tiempo de secado de 30 minutos. Esterilice las jaulas utilizando un bastidor de descontaminación de la organización internacional de normalización (ISO) que permite que las jaulas permanezcan selladas y que el vapor pase a través del filtro HEPA interno, que mantiene el ambiente estéril hasta que se abre la jaula.
   4. Llene las botellas de 1 L con agua potable, séllelas con tapones de goma y coloque una tira integradora de productos químicos en la superficie de la botella. Autoclave a 121 °C y un mínimo de 15 PSI durante 45 min, utilizando el programa de escape lento para líquidos.
   5. Compruebe visualmente los integradores químicos colocados en cada jaula para la verificación inmediata de los parámetros adecuados del autoclave.
      NOTA: El indicador biológico debe retirarse a la primera apertura de la isojaula en condiciones estériles. Incubar el indicador biológico durante 24 h a 37 °C y observar cualquier cambio de color. Un cambio de color vívido de la solución transparente azul/púrpura original a un líquido amarillo o turbio indica que hay crecimiento microbiano. Si el indicador permanece claro y de color azul/púrpura, entonces esto es la confirmación de la esterilidad completa del interior de las jaulas en ese ciclo de autoclave.

2. Preparación del esterilizante de dióxido de cloro

PRECAUCIÓN: El esterilizante de dióxido de cloro es extremadamente corrosivo una vez activado. El esterilizante de dióxido de cloro activado caduca a las 24 horas de la mezcla del activador con la base. El esterilizante de dióxido de cloro produce vapores, que pueden ser irritantes para las superficies mucosas y causarán irritación en contacto con la piel. Asegúrese de que la sala para la preparación del esterilizante tenga acceso a un lavabo y a una ventilación adecuada. Use gafas de seguridad, respirador y guantes resistentes a productos químicos cuando trabaje con esterilizante de dióxido de cloro, además del equipo de protección personal (EPP) requerido para las instalaciones de alojamiento de animales.

1. Base de mezcla y activador
   1. Para hacer un volumen estándar de 6 L de esterilizante de dióxido de cloro, primero mida 1 L de base de esterilizante de dióxido de cloro en un cilindro graduado de 1 L y vierta en un tanque de inmersión de 20 L de volumen.
   2. Usando el mismo cilindro graduado, mida y vierta 4 L de agua del grifo en el tanque de inmersión.
   3. Deje a un lado el cilindro graduado utilizado para la base y el agua. Utilice un nuevo cilindro graduado para medir 1 L de activador de esterilizante de cloro-dióxido y viértalo en el tanque de inmersión.
   4. Una vez que se haya agregado el activador al tanque, use el cilindro graduado para mezclar el contenido del tanque.
2. Activación
   1. Coloque la tapa en el tanque de inmersión y etiquételo como esterilizante de dióxido de cloro con la fecha y la hora en que se agregó el activador y el nombre del personal que lo preparó. Si se desea, el cilindro graduado utilizado para mezclar el esterilizante se puede usar para transferir 1 L a una botella rociadora.
   2. Mueva el tanque de inmersión y las botellas rociadoras a la sala de alojamiento de animales, donde se encuentran el estante y las jaulas Isocage. El esterilizante de dióxido de cloro activado debe reposar durante al menos 20 minutos antes de su uso para garantizar una activación completa.
      NOTA: Para manipular grandes cantidades de jaulas (>9), se pueden preparar hasta 12 L a la vez en el tanque de inmersión. Para manipular 1 jaula o, en caso de emergencia, se pueden preparar 1,2 L de esterilizante de dióxido de cloro en un recipiente más pequeño y luego transferirlo a 2 botellas rociadoras de 1 L. Se recomienda que el esterilizante se prepare al menos 1 hora antes de la transferencia anticipada de ratones libres de gérmenes.

3. Esterilización

1. Don EPI
   1. Como manipulador principal de la jaula, póngase gafas de seguridad, un respirador, guantes resistentes a los productos químicos, una bata quirúrgica estéril, un bouffant, cubremangas y cubrezapatos. Use uniformes médicos debajo del EPP, ya que cualquier contacto de la tela con el esterilizante de dióxido de cloro provocará manchas extensas.
   2. Se recomienda un asistente para el manipulador de jaula principal. Haga que el asistente se ponga el mismo EPP que el manipulador de jaula principal, aunque puede usar una bata quirúrgica no estéril.
2. Preparación de la cabina de bioseguridad
   1. Coloque 10 toallitas en el tanque de inmersión del esterilizante de dióxido de cloro y asegúrese de que estén completamente empapadas.
   2. Mueva las toallitas empapadas al gabinete de bioseguridad y remoje todas las superficies del gabinete en el siguiente orden de atrás hacia adelante: superficie de trabajo plana, lado izquierdo, parte posterior del capó, lado derecho y vidrio interior frontal. Realice el remojo sin contacto de las superficies no protegidas de la cabina de bioseguridad apretando las toallitas sobre estas superficies sin tocarlas.
   3. Después de una ronda de limpieza, vuelva a colocar las toallitas en el tanque de inmersión del esterilizante de dióxido de cloro para remojarlas.
3. Preparación de las isojaulas
   1. Prepare una bolsa de plástico grande llenándola con al menos 100 ml de esterilizante de dióxido de cloro con un cilindro graduado y agite la bolsa para asegurarse de que todas las superficies interiores estén empapadas. Coloque la bolsa sobre cualquier superficie plana.
   2. Retire una sola isojaula de la rejilla y colóquela en el tanque de inmersión del esterilizante de cloro y dióxido de cloro para que todas las superficies de la jaula entren en contacto con el líquido. Use las toallitas empapadas en el tanque para frotar aún más las superficies de la jaula para garantizar un contacto completo con el líquido.
   3. Después de remojar la jaula, pídele al asistente que abra la bolsa de plástico empapada. Coloque la jaula en la bolsa y pídale al asistente que cierre la abertura de inmediato. Rocíe la abertura de la bolsa con esterilizante de dióxido de cloro usando la botella rociadora. Siga este procedimiento para cada jaula que se utilice; Hasta cuatro jaulas pueden caber en una sola bolsa de 36", 32", 48".
   4. Sumerja tantas botellas de agua esterilizadas de 1 L como sea necesario (1 L de agua para 2 jaulas) en el tanque de inmersión de esterilizante de cloro y dióxido de carbono, luego colóquelas en otra bolsa de plástico empapada. Cuando todos los suministros se hayan colocado en la bolsa, cierre la bolsa y rocíe la abertura de la bolsa con esterilizante de dióxido de cloro usando la botella rociadora.
   5. Una vez que todas las jaulas y suministros estén embolsados, sumerja los guantes resistentes a los productos químicos en un esterilizante de dióxido de cloro (lo más arriba posible de los guantes sin llegar a la abertura).
4. Período de esterilización de 20 minutos
   1. La esterilización completa requiere un mínimo de 20 minutos de tiempo de contacto con el líquido. Tan pronto como se haya esterilizado el último artículo y se cierre la bolsa de plástico para remojo, haga que el asistente configure un temporizador de 20 minutos. Asegúrese de que después de que el temporizador haya comenzado, los guantes resistentes a los productos químicos no toquen ninguna superficie que no esté empapada con esterilizante de dióxido de cloro.
   2. Realice el proceso de esterilización de la cabina de bioseguridad (paso 3.2) repetidamente hasta que el temporizador indique que han pasado 20 minutos.
   3. Pídale al asistente que sacuda con frecuencia las superficies exteriores de la bolsa de plástico empapada para garantizar un contacto constante del líquido con las superficies internas de la jaula y la botella.
   4. Después del período de 20 minutos, pídale al asistente que abra la bolsa de plástico empapada para revelar las jaulas esterilizadas y las botellas de agua, teniendo cuidado de tocar solo las superficies exteriores de la bolsa.
   5. Con los guantes esterilizados resistentes a los productos químicos, mueva cada jaula y biberón al gabinete de bioseguridad esterilizado. Si hay demasiadas jaulas para caber en el gabinete de bioseguridad, deje las jaulas restantes en las bolsas de plástico, ya que permanecerán estériles siempre que la abertura de la bolsa de plástico esté cerrada y empapada con esterilizante de dióxido de cloro entre cada abertura.

4. Transferencia de ratón libre de gérmenes

1. Preparación de las isojaulas
   1. Para abrir la isojaula herméticamente sellada, levante las lengüetas blancas de las dos abrazaderas a los lados de la tapa y luego saque cada abrazadera hacia los lados. La tapa debe estar libre de la parte inferior de la jaula para poder levantar la tapa de la jaula. Coloque la tapa boca abajo a la izquierda de la jaula y utilícela como una estación de trabajo estéril.
      NOTA: Una alternativa al uso de tapas de jaula o el interior de bolsas de instrumentos esterilizadas en autoclave como superficie de trabajo estéril es utilizar cortinas esterilizadas en autoclave, que proporcionan un área de superficie más grande y evitan la contaminación involuntaria de la tapa de la jaula si se comete un error.
   2. Usando las pinzas estériles que se encuentran dentro de la jaula en la parte superior de la rejilla de alambre, retire la botella de agua vacía y colóquela en el interior de la tapa. Abra la botella de agua de 1 litro quitando el sello de goma y vierta el agua en la botella de agua para llenarla. Coloque la boquilla en la botella de agua con las pinzas y presione firmemente para sellar.
   3. Use pinzas estériles para levantar la rejilla de alambre y colóquela varias pulgadas hacia atrás para permitir una abertura en el fondo de la jaula. Apoye las pinzas estériles en la rejilla de alambre, asegurándose de que los mangos no entren en contacto con las superficies de la jaula.
2. Uso del disco de transferencia
   NOTA: El personal capacitado libre de gérmenes es responsable del cuidado y mantenimiento de los aisladores de cría. Dados los riesgos asociados con la apertura de aisladores de cría, este personal realiza la esterilización del disco de transferencia, la preparación y la transferencia de ratones libres de gérmenes de los aisladores a las isojaulas. Para describir brevemente el proceso, los discos de transferencia se preparan en un cilindro esterilizable en autoclave para permitir la esterilización. Se utilizan indicadores biológicos para verificar su esterilidad. La cinta para sellar los discos de transferencia también se esteriliza en autoclave dentro del cilindro. El cilindro esterilizado que encierra estos materiales se conecta a través de un manguito de transferencia al aislador, y los ratones se mueven de las jaulas al disco. A continuación, se coloca la tapa en el disco y se utiliza cinta adhesiva para crear un sello hermético en la circunferencia del disco y los orificios de aire. El disco sellado se coloca inmediatamente en el puerto de salida del aislador. A continuación, se cierra la tapa del puerto del aislador doméstico y el exterior del disco se frota minuciosamente con esterilizante y se coloca en una bolsa empapada en esterilizante, controlada durante 20 minutos para garantizar una descontaminación completa. Luego, el personal de cría libre de gérmenes entrega estos discos al personal del estudio. Los ratones no pueden permanecer en el disco sellado más de 30 minutos desde el momento en que se sella el disco de transferencia, por lo que es esencial que todos los pasos anteriores de este protocolo se hayan completado con suficiente tiempo antes de la llegada del disco de transferencia.
   1. Al recibir el disco de transferencia, haga que el asistente sostenga y desenvuelva parcialmente la cubierta de plástico para que la superficie empapada del disco de transferencia quede expuesta pero no sea tocada por el asistente.
   2. Al recibir el disco de transferencia, haga que el asistente sostenga y desenvuelva parcialmente la cubierta de plástico para que la superficie empapada del disco de transferencia quede expuesta pero no sea tocada por el asistente.
   3. Usando los guantes resistentes a productos químicos empapados en esterilizante de dióxido de cloro, retire el disco de transferencia de la envoltura de plástico, teniendo cuidado de no tocar ninguna superficie que no esté empapada en esterilizante. A continuación, coloque el disco de transferencia sobre la superficie plana del armario de bioseguridad esterilizado.
   4. Para abrir el disco de transferencia, retire la cinta, selle la circunferencia del disco y deséchela fuera del gabinete de bioseguridad. Retire la tapa del disco de transferencia y deséchelo fuera del gabinete de bioseguridad.
   5. Dentro del disco de transferencia hay una tapa de compartimento giratoria con una sola abertura. Utilice las pinzas estériles previamente apoyadas en la rejilla de alambre de la jaula para manipular la tapa de este compartimento para mover la abertura al ratón necesaria para la transferencia.
3. Transferencia de ratones del disco a la isojaula
   1. Con las pinzas, agarre la base de la cola del ratón a través de la abertura de la cubierta del disco de plástico, y levante y transfiera el ratón a la isojaula a través del espacio abierto previamente entre la rejilla de alambre y la jaula. Repita el procedimiento para todos los ratones destinados a esa jaula.
   2. Una vez que todos los ratones hayan sido transferidos a esa isojaula, reemplace la rejilla de alambre con las pinzas. Luego, levante la tapa de la jaula y vuelva a colocarla encima de la jaula con las pinzas.
   3. Levante cada abrazadera de la tapa de la jaula y baje con cuidado sobre los lados de la jaula, luego empuje hacia abajo las lengüetas blancas para sellar la tapa de la jaula.
   4. Una vez que la jaula esté sellada, haga que el asistente rocíe cada boquilla del sitio de acoplamiento en el estante de la jaula con esterilizante de dióxido de cloro. A continuación, retira la jaula de la capucha y pásala al asistente, que puede acoplar la jaula en el estante.
   5. Repita estos pasos para cada ratón del disco de transferencia.
4. Limpieza de la cabina de bioseguridad
   1. Una vez completadas todas las transferencias de ratones a isocage, vacíe el capó de cualquier residuo y limpie completamente con toallitas empapadas en dióxido de cloro y esterilizante.
   2. Limpie la campana con alcohol isopropílico para eliminar el esterilizante de dióxido de cloro residual. El espacio debajo de la superficie de trabajo de la campana recoge un gran volumen de esterilizante del proceso de esterilización. Elimine esto por absorción con toallitas secas y limpie con alcohol isopropílico.
   3. Deseche el esterilizante líquido de dióxido de cloro a través del desagüe del fregadero 24 horas después de la activación. Deseche los materiales sólidos contaminados con esterilizante como si fueran residuos regulares.
      NOTA: Los ratones libres de gérmenes transferidos a condiciones de isojaula se dejan durante 1 semana para aclimatarse a su nuevo entorno antes de cualquier intervención. Esto reduce el estrés experimentado por los animales, lo que podría interferir con los resultados del estudio. Al final de este período de aclimatación de 1 semana, recoja las heces como se describe en el paso 6 para confirmar el estado libre de gérmenes antes de cualquier intervención.

5. Sonda nasogástrica oral de purín fecal humano en ratones libres de gérmenes

1. Preparación de suministros de sonda nasogástrica esterilizada en autoclave
   1. Coloque las agujas de sonda oral en bolsas de esterilización autosellantes (1 por ratón) y las jeringas estériles de 1 ml en bolsas de esterilización autosellantes (1 por ratón) 1 día antes del procedimiento de sonda nasogástrica oral. Coloque estos y 600 ml de vasos de polipropileno (1 por ratón) y un par de pinzas largas en una bolsa apta para autoclave y esterilícelas en autoclave.
   2. Inmediatamente después de retirar la bolsa del autoclave, selle la bolsa con cinta de embalaje y guárdela hasta el día siguiente.
2. Preparación de purines fecales humanos
   1. El día de la sonda nasogástrica, transfiera las heces humanas homogeneizadas y almacenadas en medios de conservación anaeróbicos (en este caso, medios de transporte dental líquidos) desde el congelador a -80 °C a la cámara anaeróbica. Diluir material fecal homogeneizado aproximadamente 1:10 en solución salina anaeróbica estéril en un tubo cónico de 10 mL.
   2. Sellar el tubo que contiene el purín fecal humano con parafilm, homogeneizar por vórtice y luego centrifugar a 200 g durante 5 min para sedimentar las partículas.
   3. Vuelva a colocar el tubo en la cámara anaeróbica y transfiera el sobrenadante a otro tubo cónico de 10 mL. Selle el tubo que contiene el sobrenadante fecal humano con parafilm, retírelo de la cámara anaeróbica y colóquelo en un recipiente secundario a prueba de fugas. Transporte el contenedor junto con la bolsa de suministros de sonda nasogástrica esterilizada en autoclave hasta el lugar del alojamiento de animales.
      NOTA: Es esencial estimar el total de UFC/mL de las heces humanas destinadas a la sonda nasogástrica para fines de notificación. No está claro cuál es la carga mínima de UFC para asegurar una colonización adecuada, pero las UFC más altas conducen a un mejor injerto de heces del donante¹³. Si la carga de UFC de material fecal humano da como resultado tasas bajas de injerto, recoja muestras fecales humanas. El uso de un medio de preservación de la viabilidad mejorará la recuperación de UFC de las muestras fecales recolectadas. Para determinar los recuentos de UFC anaeróbicas/aeróbicas de las heces del donante, diluya la muestra en serie a 1 x ^10-5 y coloque 10 μL de cada dilución por duplicado en placas de agar BHI y LB aeróbicas y anaeróbicas. Después de 24 h (aeróbico) y 48 h (anaeróbico), cuente las UFC por gramo de heces.
3. Preparación de las isojaulas
   1. Repita los pasos 2 y 3, con la única diferencia ahora de que hay ratones alojados en estas jaulas, y se debe tener cuidado para asegurarse de que dentro de los 30 minutos posteriores a la extracción de la rejilla, cada isojaula se coloque en la capucha esterilizada y la tapa se ventile para permitir el flujo de aire a los ratones.
   2. Esterilice la bolsa de material de sonda nasogástrica esterilizada en autoclave y el tubo de lodo fecal humano de los pasos 5.1 y 5.2 a través de la saturación de esterilizante de dióxido de cloro de manera similar a las botellas de agua (es decir, sumérjalas en esterilizante y luego colóquelas en una bolsa empapada en esterilizante).
   3. Transfiera las isojaulas y los suministros de sonda nasogástrica oral al gabinete de bioseguridad después de completar el período de esterilización de 20 minutos. Perfore la bolsa de suministros esterilizada en autoclave empujando la bolsa contra las pinzas largas que contiene en su interior, y luego retire los suministros y deseche la bolsa fuera de la capucha.
4. Sonda nasogástrica
   1. Use una bata quirúrgica estéril nueva y guantes quirúrgicos estériles en lugar de los guantes resistentes a los productos químicos para evitar que el esterilizante residual de dióxido de cloro entre en contacto con los ratones. Pídele al asistente que te ayude en este proceso si es necesario.
   2. Prepare las agujas de sonda nasogástrica desenvolviendo cada bolsa de esterilización y use el interior de la bolsa como una superficie de descanso seca y estéril. Conecte la aguja de sonda nasogástrica a cada jeringa, abra el tubo de suspensión fecal y extraiga 200 μL de suspensión fecal en cada jeringa.
   3. Con pinzas, agarre la base de la cola de un solo ratón en la jaula y colóquela en la rejilla de alambre. Sujete suavemente el ratón raspándolo y, mientras lo sostiene en posición vertical vertical, inserte la aguja e inyecte suavemente la suspensión fecal, seguido de la extracción inmediata de la aguja.
   4. Coloque el ratón directamente en una de las tazas esterilizadas para su observación. Repite el proceso para cada ratón de la jaula. Después de que todos los ratones hayan recibido la sonda nasogástrica, use las pinzas para mover a cada ratón de regreso a la cama de la jaula y selle la jaula como se describe en los pasos 4.3.2-4.3.4.
      NOTA: En los casos en que se utilicen dos o más lodos fecales separados, se requiere una reesterilización completa del gabinete de bioseguridad y de las jaulas y materiales requeridos. En los casos en que un grupo de ratones permanece libre de gérmenes, se recomienda que estos ratones reciban sus sonda de control antes de que cualquier otro grupo sea tratado.
   5. Siga el procedimiento del paso 4.4 para desechar el esterilizante de dióxido de cloro y los materiales empapados en esterilizantes. Tratar cualquier material contaminado con lodo fecal humano como residuo biomédico y desecharlo de acuerdo con los procedimientos de salud y seguridad ambiental.

6. Recolección de heces de ratones humanizados para la preservación de la viabilidad

1. Preparar suministros esterilizados en autoclave
   1. Coloque pinzas cortas de punta ancha en bolsas de esterilización autosellantes (1 por ratón), vasos de precipitados de polipropileno de 600 ml (1 por ratón) y un par de pinzas largas en una bolsa apta para autoclave y esterilícelas en autoclave 1 día antes del procedimiento de recolección de heces.
   2. Inmediatamente después de retirar la bolsa del autoclave, selle la bolsa con cinta de embalaje y guárdela hasta el día siguiente.
2. Preparación del tubo de medios de conservación
   1. Seleccione un medio anaeróbico de preservación de la viabilidad (aquí se utilizó Cary Blair). Alícuota de 1 mL de medio de conservación en tubos estériles con tapón de rosca de 2 mL en una cabina de bioseguridad. Se recomienda una proporción de 1:10 heces:medio para una conservación óptima.
   2. Etiquete previamente cada tubo con un marcador permanente, pero tenga en cuenta que la exposición al esterilizante de dióxido de cloro puede eliminar las etiquetas de los marcadores permanentes de las superficies de plástico. Otro método es dejar los tubos sin etiquetar y hacer que el asistente etiquete los tubos inmediatamente después de la recolección antes de congelarlos.
   3. Coloque estos tubos en una rejilla de tubos de polipropileno estándar para permitir que los tubos se almacenen en posición vertical y, al mismo tiempo, permitir la esterilización por contacto con el esterilizante de dióxido de cloro.
3. Jaulas de esterilización y cabina de bioseguridad
   1. Repita los pasos 2 y 3 para esterilizar las isojaulas y el gabinete de bioseguridad. Una vez más, asegúrese de que dentro de los 30 minutos posteriores a la extracción de la rejilla, cada isojaula se coloque en la capucha esterilizada y la tapa esté ventilada para permitir el flujo de aire a los ratones.
   2. Además, esterilice la bolsa de suministros esterilizada en autoclave y el estante que contiene los tubos preparados mediante la saturación de esterilizante de dióxido de cloro y colóquelos en la bolsa de plástico empapada que contiene las jaulas. El objetivo es el contacto completo del líquido con todas las superficies de cada tubo y con el propio rack.
4. Recolección y almacenamiento de muestras fecales
   1. Transfiera las isojaulas, los suministros esterilizados en autoclave y el bastidor de tubos al gabinete de bioseguridad después de completar el período de esterilización de 20 minutos. Perfore la bolsa de suministros esterilizada en autoclave empujando la bolsa contra las pinzas largas que contiene, retire los suministros y deseche la bolsa fuera de la capucha.
   2. Use una bata quirúrgica estéril nueva y guantes quirúrgicos estériles en lugar de los guantes resistentes a los productos químicos para evitar que el esterilizante residual de dióxido de cloro entre en contacto con los ratones. Pídele al asistente que te ayude en este proceso si lo deseas.
   3. Prepare las pinzas de punta roma desenvolviendo las bolsas y utilizando la superficie interior de la bolsa como área estéril. Coloque la rejilla de tubos en la superficie de la campana de bioseguridad.
   4. Con pinzas largas, agarre la base de la cola de un solo ratón en la jaula y colóquelo directamente en una de las tazas esterilizadas para observarlo. Repite este proceso para cada ratón en la jaula.
   5. Observe a los ratones hasta que se hayan producido al menos dos gránulos fecales recién expulsados.
      1. Con las pinzas de punta roma, recoja los gránulos fecales y colóquelos directamente en el tubo. Selle inmediatamente la tapa del tapón de rosca y pásela al asistente.
      2. Haga que el asistente etiquete el tubo y homogeneice inmediatamente las heces mediante vórtice. Una vez homogéneo, congele el tubo en nitrógeno líquido y guárdelo a largo plazo a -80 °C.
   6. Repita el proceso de recolección de heces para cada ratón en la jaula. Vuelva a colocar cada ratón en la jaula de la casa después de la recolección de heces y vuelva a acoplar las jaulas en su estante. Repita el paso 4.4 para limpiar la campana y desechar los desechos.

Las muestras fecales humanas, agrupadas por el fenotipo respondedor y no respondedor de ICI (descrito previamente en el protocolo), se colocaron en ratones GF-WT de género mixto alojados en 3 isojaulas por grupo (n = 1-2 ratones/jaula, n = 6 para el respondedor y n = 5 para el no respondedor). A los ratones se les permitió aclimatarse durante 1 semana después de la transferencia. A continuación, se recogieron muestras fecales de estos ratones (en condiciones libres de gérmenes). A c...

El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y muy detallado para la humanización de ratones libres de gérmenes alojados en isojaulas experimentales. La capacidad de trasplantar exclusivamente comunidades fecales de sujetos humanos a huéspedes murinos es invaluable para la investigación del microbioma. Sin contaminación por la microbiota comensal específica del ratón, se puede estudiar el impacto de las bacterias humanas en una variedad de estados de salud y enf...

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Los autores agradecen a la División de Servicios Libres de Gérmenes de UF Animal Care Services por la asistencia con la cría de gnotobióticos, a la Dra. Brooke Bloomberg y a la Dra. Laura Eurell por la asistencia veterinaria y de la IACUC, y a Josee Gauthier por la asistencia con la secuenciación del gen 16S rRNA. Esta investigación fue apoyada, en parte, por los Fondos del Centro de Cáncer de UF Health (C.J.) y el Fondo Gatorade del Departamento de Medicina de la UF (C.J.). R.Z.G. contó con el apoyo de los fondos del Centro Oncológico de UF Health. R.C.N. contó con el apoyo de la Subvención de Capacitación TL1 de los Institutos Nacionales de Salud de la Universidad de Florida (TL1TR001428, UL1TR001427), el Programa de Capacitación en Investigación del Cáncer Interdisciplinario Basado en Equipos del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud T32CA257923 y el Centro Oncológico de UF Health. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el UF Health Cancer Center, respaldada en parte por las asignaciones estatales provistas en Fla. Stat. § 381.915 y el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo la Adjudicación Número P30CA247796. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o del Estado de Florida. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.