Çiğ ve pişirmeye hazır tavuk ürünlerinde salmonella'yı ölçmek için modifiye edilmiş en olası sayı testi

Kümes hayvanlarında Salmonella'nın düşük seviyelerde doğru bir şekilde ölçülmesi, mevcut bir endüstriyel ve düzenleyici zorluktur. Bu protokol, çiğ ve pişirmeye hazır kümes hayvanı ürünlerinde Salmonella'nın miktar tayinini sağlayan bir MPN testini açıklar. Bu yöntem hızlı, hassastır ve FSIS yönergeleriyle uyumludur, gıda güvenliğini artırır ve halk sağlığı çabalarını destekler.

Salmonella , Amerika Birleşik Devletleri'nde, özellikle kümes hayvanı ürünlerinde, gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen bir nedenidir. Salmonella'yı tespit etmek için kullanılan geleneksel yöntemler, kontaminasyon seviyelerini ve risklerini değerlendirmedeki faydalarını sınırlayan nicelikten ziyade yaygınlığa odaklanır. Bu çalışma, tavuk cordon bleu gibi pişirmeye hazır kümes hayvanı ürünlerinde Salmonella'yı ölçmek için tasarlanmış yeni bir en olası sayı (MPN) testini tanıtmaktadır. Yöntem, kümes hayvanı numunesinin yıkanmasını, durulamanın santrifüjleme yoluyla konsantre edilmesini ve 48 oyuklu bir blokta seri olarak seyreltilmesini içerir. MPN testi, mevcut Gıda Güvenliği ve Denetim Hizmeti (FSIS) protokolleriyle aynı zaman dilimi içinde Salmonella kontaminasyonunun hassas, doğru ve hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlamak için döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) yöntemiyle entegre edilmiştir. Sonuçlar, MPN-LAMP ölçümleri ile teorik aşılama seviyeleri arasında güçlü bir doğrusal korelasyon olduğunu göstermektedir (R² = 0.933). Bununla birlikte, daha düşük konsantrasyonlardaki değişkenlik, Salmonella'nın bu seviyelerde doğru bir şekilde tespit edilmesindeki zorlukları vurgulamaktadır ve pratik alt tespit limiti yaklaşık 300 CFU/g olarak tahmin edilmektedir. Protokolün uygulanabilirliğini iyileştirmeye yönelik potansiyel iyileştirmeler arasında, tespit sınırını daha da iyileştirmek için örneklenen miktarın artırılması, zenginleştirme ortamı formülasyonlarının optimize edilmesi ve birden fazla Salmonella serovarını hedeflemek için moleküler tespitin genişletilmesi yer alır. Genel olarak, bu çalışma, kümes hayvanı ürünlerinde Salmonella kontaminasyonunun güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlayan, gıda güvenliğinin ve halk sağlığının iyileştirilmesine katkıda bulunan gıda endüstrisi için pratik bir araç sunmaktadır.

ABD'de gıda kaynaklı hastalıkların, hastaneye yatışların ve ölümlerin önde gelen bir nedeni olan Salmonella , önemli bir halk sağlığı ve ekonomik etkiye sahiptir. Patojenin yalnızca 2013 yılında tahmini ekonomik yükü 3,67 milyar^dolardı1. Son düzenleyici girişimler salmonellozu 2030 yılına kadar %25 oranında azaltmayı hedeflese^de2, özellikle işleme tesisi gözetiminin halk sağlığı sonuçlarıyla uyumlu hale getirilmesinde mevcut tespit ve azaltma stratejilerindeki boşluklar belirgin olmaya devam etmektedir³ .

Birden fazla Salmonella salgınında rol oynayan dondurulmuş pişirmeye hazır kümes hayvanı ürünleri, halk sağlığı için önemli bir endişe kaynağıdır. Buna karşılık, Gıda Güvenliği ve Denetim Servisi (FSIS), Salmonella'yı bu ürünlerde bir katkı maddesi olarak sınıflandırdı. Şu anda, FSIS Mikrobiyoloji Laboratuvarı Rehberi (MLG) 4.15, yalnızca kanatlı ürünlerinde Salmonella prevalansının belirlenmesine odaklanmaktadır⁴. Bu kılavuz uyarınca, toplanan numuneler 18-24 saat boyunca zenginleştirilir ve daha sonra Salmonella'nın varlığını veya yokluğunu tanımlayan ancak kontaminasyon seviyesi hakkında bilgi sunmayan Moleküler Tespit Sistemi (MDS) kullanılarak taranır. Bu yaklaşım, patojenlerin varlığını tespit etmek için değerli olsa da, gıda işleyicilerinin kontaminasyon risklerini daha doğru bir şekilde değerlendirmesine ve hedefe yönelik düzeltici eylemler almasına yardımcı olabilecek nicel bilgiler sağlamada başarısız olur.

Bu çalışmada, mikrobiyal patojenlerin prevalansından niceliksel olarak belirlenmesini artırmak için bir yöntem geliştirdik. Mevcut FSIS protokollerinde minimum kesinti ile kümes hayvanı ürünlerinde Salmonella'yı tespit etmek için mevcut süreçlere sorunsuz entegrasyon için tasarlanmıştır. Yöntem, toplu numuneyi basitçe zenginleştirmek yerine, kümes hayvanı ürünlerini mevcut FSIS yöntemlerine uygun ortam kullanarak yıkayarak başlar. Durulama daha sonra 48 derinliğindeki bir kuyu bloğunun ilk sütununa dağıtılır. Kalan beş sütun boyunca seri seyreltmeler gerçekleştirilir ve blok, MLG 4.15 protokolü ile uyumlu olarak 18-24 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, kuyucuklar Salmonella için test edilir ve sonuçlar en olası sayıyı (MPN) hesaplamak için ^{kullanılır5,6}. Bu yaklaşım, mevcut FSIS süreciyle aynı zaman dilimi içinde kontaminasyonun ölçülmesine izin vererek, onu hem endüstri hem de düzenleyici kullanım için pratik bir seçenek haline getirir. Şekil 1, değiştirilmiş MPN testini özetleyen bir blok diyagramı göstermektedir. Şekil, belirli adımlarda çekilen fotoğrafları, kopyaların seyreltilmesi ve büyümesi için kullanılan 48 oyuklu bloğu ve öğütülmüş tavukta bulunan en olası Salmonella sayısını değerlendirmek için kıyaslama olarak kullanılan üç tekniği içerir. Bu çalışmanın ilk aşamasında, protokolü ışınlanmamış tavuk örneklerine uygulamadan önce arka plan mikroflorasının etkisini ve doğrulanmış aşılamaya göre ölçümlerin belirsizliğini en aza indirmek için ışınlanmış öğütülmüş tavuk kullandık.

NOT: Bu protokolle ilişkili tüm çalışmalar bir Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında yürütülmelidir. Uygun olduğunda, bu protokol aseptik koşulları korumak ve numune kontaminasyonu veya operatörün mikrobiyal patojenlere maruz kalma riskini en aza indirmek için bir biyolojik güvenlik kabini (BSC) içinde yürütülmelidir. Numuneleri BSC dışına aktarırken, numune bütünlüğünü korumak ve kazara düşme durumunda dökülmeyi önlemek için kapalı kaplar kullanın. Tercihen, çapraz kontaminasyon olasılığını azaltmak için prosedür boyunca tek kullanımlık bileşenler kullanılmalıdır. Tek kullanımlık malzemelerin mümkün olmadığı durumlarda, kullanmadan önce tüm ekipman ve malzemelerin steril olduğundan emin olun. Uygun atık yönetimi çok önemlidir; Kullanılan tüm tek kullanımlık bileşenler, biyolojik tehlike atığı olarak atılmalıdır. Potansiyel olarak tehlikeli maddelerin uygun şekilde sterilize edilmesini ve muhafaza edilmesini sağlamak için yeniden kullanılabilir malzemeleri yeniden kullanmadan önce otoklavlayın. Bu önlemlere bağlı kalmak yalnızca numune bütünlüğünü korumakla kalmaz, aynı zamanda operatörün mikrobiyal patojenlere maruz kalma riskini de en aza indirir.

1. Et numunelerinin hazırlanması

1. Et numunelerinin alınması ve işlenmesi
   1. Taze et
      1. Yerel perakendecilerin taze et bölümünden kıyma tavuğu alın. Tüm numuneleri 4 °C'de depoya aktarın ve alındıktan sonra 24 saat içinde işleyin. Eti aseptik olarak 25 g'lık numunelere bölün.
      2. Numuneyi vakumla kapatın ve ışınlayın. Burada, Texas A&M AgriLife Ulusal Elektron Işını Araştırma Merkezi, ~ 25 kGy'lik bir doza tabi tutulan eti ışınladı.
         NOT: Bu çalışmada ışınlama, arka plan mikroflorasının ortadan kaldırılmasını sağlamak için bir kontrol önlemi olarak kullanılmış olsa da, sonraki bölümde kullanılan ışınlanmamış pişirmeye hazır ürünlerin gösterdiği gibi pratik uygulamalarda protokol için bir ön koşul değildir. Saha ortamlarında, seçici ortam veya moleküler teşhisin özgüllüğü gibi alternatif yöntemler, hedef olmayan mikroorganizmalardan kaynaklanan potansiyel parazitleri ele alabilir.
   2. Pişirmeye hazır tavuk ürünleri
      1. Yerel perakendecilerin dondurulmuş gıda bölümünden pişirmeye hazır tavuk ürünleri edinin. Aseptik olarak 25 g numunelere bölün.
      2. Tüm malzemelerin (örn. ekmek ve peynir) dahil edildiğinden emin olmak için tek tek parçaların ortasından örnekler toplayın.
2. Medya hazırlığı
   1. 25 g BPW tozunu 1 L nanosaf_H2O'daçözerek Tamponlu Pepton Suyu (BPW) hazırlayın.
   2. Beyin kalp infüzyonu (BHI) plakalarını hazırlayın. Bunu yapmak için, 37 g BHI tozunu 1 L nanosaf H₂O içinde çözün ve BHI çözeltisine 15 g agar ekleyin. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayarak tüm ortamları sterilize edin. Şeffaf Kapaklı Petri Kaplarına (100 mm x 15 mm) 20 ila 25 mL ortam dökün.
      NOT: Aseptik koşulları korumak için plakaları biyolojik bir güvenlik kabinine dökmek en iyisidir.

2. Hücre kültürü

1. Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028'i bir BHI agar plakasına çizerek ilk kültürü hazırlayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
2. 25 mL BHI suyunu bir koloni taze yetiştirilmiş Salmonella ile aşılayarak gece boyunca kültürler hazırlayın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 100 rpm'de çalkalayarak aerobik olarak büyütün.

3. Kanatlı hayvan örneklerinin aşılanması

1. Kültür seyreltme ve kaplama
   1. Yaklaşık 1 x 10⁸ ila 1 x 10¹ CFU / mL'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için BPW'de gece boyunca kültürün bir dizi 10 kat seyreltmesini hazırlayın. Gece boyunca Salmonella kültürünün konsantrasyonunun 1 x 10⁹ CFU/mL olduğunu varsayalım.
   2. Gece boyunca kültürün 0.5 mL'sini 4.5 mL BPW'ye aktarın, karıştırın, daha sonra her ilave seyreltme için 0.5 mL seyreltmeyi 4.5 mL BPW'ye aktarın.
      1. Gece boyunca kültür konsantrasyonunu hesaplamak için hücre sayımı için 1 x 10³ CFU/mL seyreltmenin 10 μL'sini bir BHI agar plakasına üç nüsha halinde yayın.
2. Et örneklerinin aşılanması
   1. 25 g ışınlanmış öğütülmüş tavuğu aseptik olarak iki kopya halinde steril bir mide torbasına aktarın. Çanta 7,5 x 12 inç boyutundadır ve 1,63 L olarak etiketlenmiştir. Torba, 330 μm delik çapına sahip bir filtre bölmesi içerir ve cm kare başına 285 tane vardır.
   2. Her numuneyi 1 mL hedef konsantrasyon seyreltmesi ile aşılayın. Örneğin, yaklaşık 1.000 hücre / 25 g tavukta bir kontaminasyon seviyesi elde etmek için 1 x 10³ CFU / mL seyreltmeden 1 mL kültür ekleyin. Sıvı aşıyı steril bir hücre yayıcı kullanarak tavuk numunelerinin yüzeyine nazikçe dağıtın ve 4 °C'de 1 saat bekletin.
   3. 1 mL steril BPW ekleyerek negatif kontrol numuneleri hazırlayın.

4. Numune işleme

1. Her numuneye 225 mL BPW ekleyin. Hacmin ortama oranı, FSIS MLG 4.15⁴ ile uyumlu olacak şekilde seçildi.
2. Numuneleri Mide^7'yi normal hızda ve 120 s sürede kullanarak homojenize edin.
3. Santrifüjleme ve yeniden süspansiyon
   1. 50 mL'lik bir pipet kullanarak torbanın filtrelenmiş tarafındaki sıvıyı dikkatlice çıkarın. Sıvıyı iki steril santrifüj şişesine bölün.
   2. Eşit ağırlıkları sağlamak için şişeleri steril BPW ile dengeleyin. Numuneleri 10,000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Hücre peletini steril bir spatula ile 3 mL BPW suyunda yeniden süspanse edin.
   3. 27 mL daha BPW suyu ekleyin ve bir spatula ile karıştırarak iyice karıştırın. Her iki santrifüj şişesinin içeriğini her numune için bir şişede birleştirin.

5. MPN blok kurulumu

NOT: Tablo 1 , 48 oyuklu bir bloktaki seyreltmelerin bir şemasını göstermektedir.

1. 48 oyuklu bloğun (8 tekrar) 1. sütunundaki her bir oyuklu kuyucuğa 3 mL yeniden askıya alınmış numune ekleyin.
2. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak blok içindeki 10-1 numaralı sütunlar boyunca bir dizi 6 katlı seyreltme hazırlayın.
3. Karıştırmak için 2,7 mL BPW pipete 0,3 mL numune ekleyin. Her seyreltme için tekrarlayın. Blokları gece boyunca (~ 18 saat) 37 ° C'de ~ 100 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.

6. Kaplama ve numaralandırma

1. Değiştirilmiş düşme plakası numaralandırması
   1. Çok kanallı bir pipet kullanılarak bir agar plakası üzerinde 4 x 6'lık bir ızgarada her seyreltmenin gece boyunca büyütülmüş numunesinin 7 μL'lik plakası (Şekil 2). İki plaka üzerinde 4 x 6'lık bir ızgara kullanmak, tipik 6 x 6 damlacık^{ızgarasının 8} aksine, 8 numuneyi daha iyi barındırır.
   2. İnkübasyondan önce plakaların 10 dakika kurumasını bekleyin. Agar plakalarını gece boyunca (~ 18-24 saat) 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, her plakadaki koloni sayısını sayın.

7. Salmonella'nın qPCR tespiti

1. Ticari bir kit kullanarak DNA ekstraksiyonu
   1. 48 oyuklu blokta kültürleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her kültürden 200 μL'yi 96 oyuklu bir PCR plakasına pipetleyin.
   2. Plakayı kapatın ve ardından 10 dakika boyunca 6.600 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve pelete 20 μL kit reaktifi ekleyin.
   3. Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin. Plakayı kapatın ve 99 °C'de 10 dakika ısıtın, ardından 20 °C'ye soğutun.
   4. 10 dakika boyunca 6.600 x g'da tekrar santrifüjleyin. qPCR analizi için 2 μL süpernatan kullanın.
2. Plaka kurulumu
   1. qPCR reaksiyon karışımını belirlenen protokol^9'a göre aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 μL 2x Master Mix; Her bir astar ve probun 0,4 μL'si (10 μM çalışma solüsyonu): invA ileri: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA geri: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', invA probu: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' Cal Fluor Orange 560 floren boyası ile etiketlenmiştir; 0,2 μL dahili amplifikasyon kontrolü (IAC) şablonu (6 x 10,⁴ kopya/μL)⁹; Her IAC astarı ve probunun 0,4 μL'si (10 μM): IAC ileri: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC geri: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTA-3', IAC probu: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' TAMRA boyası ile etiketlenmiştir. Hacmi ddH₂O ile toplam 20 μL'ye ayarlayın.
   2. Aşağıdaki döngü koşullarıyla gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin⁹: 10 dakika boyunca 95 °C (DNA'nın ilk denatürasyonu ve sıcak başlangıç polimerazın aktivasyonu), 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü ve 1 dakika boyunca 60 °C, sonuçları analiz için dışa aktarmak için varsayılan Ct ayarlarını kullanın.

8. 3M MDS testi kullanılarak tespit

1. Moleküler tespit testi Salmonella kit protokolünü takip edin. 48 oyuklu blokta kültürleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her numuneden 20 μL'yi kit tarafından sağlanan lizis tüpüne pipetleyin.
2. Numuneleri 100 °C'de 15 dakika ısıtın. Çözelti pembeden sarıya dönecektir. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Çözelti sarıdan pembeye değişecektir.
3. 20 μL lizatı bir reaktif tüpüne aktarın ve reaktif tüplerini tutucuya yükleyin.
4. Tutucuyu MDS cihazına ekleyin ve yazılımı, kit ve numune hakkındaki bilgileri iletecek şekilde yapılandırın. Cihaz, her bir kuyucuğun tahlil için lot numarası ve bir numune adı ile etiketlenmesini gerektirir. MDS yazılımını çalıştırın ve raporu dışa aktarın.

9. Veri analizi

1. Olumlu ve olumsuz sonuçların sınıflandırılması.
   1. 4 x 6 damla kaplama için, en az 1 koloni pozitif olan agar plakalarındaki lekeleri ve negatif olarak büyüme olmayan agar plakalarındaki lekeleri değerlendirin.
   2. qPCR için, Ct'si 30'a eşit veya daha düşük olan kuyucukları pozitif olarak ve Ct'si 30'dan büyük olan kuyuları negatif olarak değerlendirin.
   3. MDS için, MDS sisteminden alınan ve pozitif veya negatif olarak bildirilen sonuçları kullanın.
2. MPN hesaplaması
   1. Daha önce açıklanan basit maksimum olasılık çözünürlüğü (SMPR) yöntemini,⁶ veya alternatif doğrulanmış MPN hesaplayıcılarını kullanarak açıklamalı pozitifleri ve negatifleri analiz edin. ¹⁰

Işınlanmış et
Regresyon analizinde, 1'lik bir eğim, bağımsız değişkendeki (x ekseni) her birim artış için, bağımlı değişkenin (y ekseni) tam olarak 1 birim arttığını gösterir. Bu, iki değişken arasında orantılı bir ilişki olduğunu gösterir, yani bağımlı değişkendeki değişim, bağımsız değişkendeki değişikliği yansıtır. 0'lık bir kesişim, bağımsız değişken 0 olduğunda, bağımlı değişkenin de 0 olduğu anlamına...

Protokolün önemi
Salmonella, özellikle gıda kaynaklı hastalık salgınlarında sıklıkla rol oynayan kümes hayvanı ürünlerinde, gıda güvenliğinde önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir^13,14. Amerika Birleşik Devletleri'nde bakteriyel gıda kaynaklı hastalıkların önde gelen bir nedeni olarak, hem taze hem de pişirmeye hazır kümes hayvanı ürünlerinde Salmonell...

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi (USDA-ARS), Ulusal Program 108, Güncel Araştırma Bilgi Sistemi numaraları 8072-42000-093-000-D ve 8072-42000-094-000-D tarafından desteklenmiştir. Bu makalede ticari adlardan veya ticari ürünlerden bahsedilmesi, yalnızca belirli bilgiler sağlama amaçlıdır ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onay verildiği anlamına gelmez. USDA, fırsat eşitliği sağlayıcısı ve işverenidir.