Модифицированный метод наиболее вероятного числа для количественного определения сальмонеллы в сырых и полуфабрикатах из куриных продуктов

Точное количественное определение сальмонеллы у домашней птицы на низких уровнях является актуальной промышленной и нормативной проблемой. В этом протоколе описан анализ МПН, который позволяет количественно оценить сальмонеллу в сырых и готовых к приготовлению продуктах из птицы. Этот метод быстрый, чувствительный и соответствует рекомендациям FSIS, повышая безопасность пищевых продуктов и поддерживая усилия общественного здравоохранения.

Сальмонелла является основной причиной болезней пищевого происхождения в Соединенных Штатах, особенно в продуктах птицеводства. Традиционные методы обнаружения сальмонеллы сосредоточены на распространенности, а не на количественной оценке, что ограничивает их полезность для оценки уровней загрязнения и рисков. В этом исследовании представлен новый анализ наиболее вероятных чисел (MPN), предназначенный для количественной оценки сальмонеллы в готовых к приготовлению продуктах из птицы, таких как куриный кордон блю. Метод включает в себя промывку образца птицы, концентрирование ополаскивателя с помощью центрифугирования и последовательное разбавление его в 48-луночном блоке. Анализ МПН интегрирован с методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) для обеспечения чувствительной, точной и быстрой количественной оценки загрязнения сальмонеллой в те же сроки, что и существующие протоколы Службы безопасности и инспекции пищевых продуктов (FSIS). Результаты показывают сильную линейную корреляцию между измерениями MPN-LAMP и теоретическими уровнями инокуляции (R² = 0,933). Тем не менее, изменчивость при более низких концентрациях подчеркивает трудности в точном обнаружении сальмонеллы на этих уровнях, при этом практический нижний предел обнаружения оценивается примерно в 300 КОЕ/г. Потенциальные усовершенствования для улучшения применимости протокола включают увеличение количества проб для дальнейшего улучшения предела обнаружения, оптимизацию составов обогащающих сред и расширение молекулярного обнаружения для нацеливания на несколько сероваров сальмонеллы . В целом, данное исследование представляет собой практический инструмент для пищевой промышленности, позволяющий надежно количественно оценить загрязнение сальмонеллой продуктов птицеводства, способствуя повышению безопасности пищевых продуктов и здоровья населения.

Являясь основной причиной болезней пищевого происхождения, госпитализаций и смертей в США, сальмонелла оказывает значительное влияние на общественное здравоохранение и экономику. По оценкам, экономический ущерб от патогена только в 2013 году составил 3,67 млрд долларов^США1. Несмотря на то, что недавние инициативы в области регулирования направлены на снижение сальмонеллеза на 25% к 2030 году², пробелы в текущих стратегиях выявления и смягчения последствий остаются очевидными, особенно в том, что касается согласования эпиднадзора за перерабатывающими предприятиями с результатами в области общественного здравоохранения³ .

Замороженные полуфабрикаты из птицы, которые были причастны к многочисленным вспышкам сальмонеллы , представляют собой серьезную проблему для здоровья населения. В ответ на это Служба безопасности и инспекции пищевых продуктов (FSIS) классифицировала сальмонеллу как примесь в этих продуктах. В настоящее время Руководство FSIS по микробиологическим лабораториям (MLG) 4.15 сосредоточено исключительно на определении распространенности сальмонеллы в продуктах птицеводства⁴. В соответствии с этим руководством собранные образцы обогащают в течение 18-24 часов, а затем проверяют с помощью молекулярной системы обнаружения (MDS), которая определяет наличие или отсутствие сальмонеллы , но не дает представления об уровне загрязнения. Хотя этот подход ценен для обнаружения присутствия патогенов, он не предоставляет количественную информацию, которая могла бы помочь производителям продуктов питания более точно оценить риски заражения и принять целенаправленные корректирующие действия.

В этом исследовании мы разработали метод расширения обнаружения от распространенности до количественной оценки микробных патогенов. Он был разработан для бесшовной интеграции в существующие процессы обнаружения сальмонеллы в продуктах птицеводства с минимальным нарушением текущих протоколов FSIS. Вместо простого обогащения объемного образца метод начинается с промывки продуктов птицеводства с использованием среды, соответствующей текущим методам FSIS. Затем промывка распределяется по первой колонне колодца глубиной 48 лунок. Последовательное разведение выполняется в оставшихся пяти колонках, и блок инкубируется в течение 18-24 ч в соответствии с протоколом MLG 4.15. После инкубации лунки проверяют на сальмонеллу, и по результатам вычисляют наиболее вероятное число (МПН)^5,6. Такой подход позволяет количественно оценить загрязнение в те же сроки, что и текущий процесс FSIS, что делает его практичным вариантом как для промышленности, так и для нормативного использования. На рисунке 1 показана блок-схема, обобщающая модифицированный анализ МПН. Рисунок включает в себя фотографии, сделанные на конкретных этапах, блок из 48 лунок, используемый для разбавления и роста репликатов, и три метода, использованных в качестве ориентиров для оценки наиболее вероятного количества сальмонеллы, присутствующей в курином фарсе. На первом этапе этого исследования мы использовали облученный фарш из курицы, чтобы свести к минимуму влияние фоновой микрофлоры и неопределенность измерений относительно верифицированного инокулята перед применением протокола к образцам курицы, не подвергшимся облучению.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы, связанные с этим протоколом, должны проводиться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2). При необходимости этот протокол должен проводиться в шкафу биологической безопасности (КБП) для поддержания асептических условий и сведения к минимуму риска загрязнения проб или контакта оператора с микробными патогенами. При переносе проб за пределы ССП используйте герметичные контейнеры, чтобы сохранить целостность пробы и предотвратить разлив в случае случайного падения. Предпочтительно использовать одноразовые компоненты на протяжении всей процедуры, чтобы снизить вероятность перекрестного загрязнения. В случаях, когда одноразовые материалы невозможны, убедитесь, что все оборудование и материалы стерильны перед использованием. Надлежащее управление отходами имеет решающее значение; Все использованные одноразовые компоненты должны быть выброшены как биологически опасные отходы. Автоклавирование повторно используемых материалов перед повторным использованием для обеспечения надлежащей стерилизации и локализации потенциально опасных материалов. Соблюдение этих мер предосторожности не только гарантирует целостность пробы, но и сводит к минимуму риск контакта оператора с микробными патогенами.

1. Подготовка образцов мяса

1. Получение и обработка образцов мяса
   1. Свежее мясо
      1. Приобретайте куриный фарш в отделе свежего мяса местных розничных продавцов. Все образцы передают на хранение при температуре 4 °C и обрабатывают в течение 24 ч после получения. Асептически разделите мясо на образцы по 25 г.
      2. Вакуумное уплотнение и облучите образец. Здесь Национальный центр электронно-лучевых исследований Texas A&M AgriLife облучил мясо, подвергнутое дозе ~25 кГр.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что облучение использовалось в качестве контрольной меры в данном исследовании для обеспечения элиминации фоновой микрофлоры, оно не является обязательным условием для применения протокола на практике, как показано на примере необлученных полуфабрикатов, использованных в следующем разделе. В полевых условиях альтернативные методы, такие как селективная среда или специфичность молекулярной диагностики, могут устранить потенциальную интерференцию от микроорганизмов, не являющихся мишенью.
   2. Полуфабрикаты из курицы
      1. Приобретайте готовые к приготовлению куриные продукты в отделе замороженных продуктов местных розничных продавцов. Асептически разделить на образцы по 25 г.
      2. Соберите образцы из центра отдельных кусочков, чтобы убедиться, что все ингредиенты (например, панировка и сыр) включены.
2. Подготовка СМИ
   1. Приготовьте буферную пептонную воду (BPW), растворив 25 г порошка BPW в 1 л наночистого H₂O.
   2. Приготовьте пластины для инфузии сердца для мозга (BHI). Для этого 37 г порошка BHI растворить в 1 л наночистого H₂O и добавить в раствор BHI 15 г агара. Стерилизовать все среды путем автоклавирования при 121 °C в течение 15 минут. Налейте от 20 до 25 мл среды в чашки Петри с прозрачной крышкой (100 мм x 15 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего заливать пластины в шкаф биологической безопасности для поддержания асептических условий.

2. Культура клеток

1. Приготовьте исходную культуру, нанеся полосы Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 на агаровую пластину BHI и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
2. Приготовьте культуры на ночь, введя 25 мл бульона BHI в одну колонию свежевыращенной сальмонеллы. Аэробно выращивайте культуры в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 100 об/мин.

3. Посев образцов птицы

1. Разбавление культуры и покрытие
   1. Приготовьте серию 10-кратных разведений ночного посева в BPW для достижения конечных концентраций приблизительно от 1 x 10⁸ до 1 x 10¹ КОЕ/мл. Предположим, что концентрация сальмонеллы в культуре за ночь составляет 1 x 10⁹ КОЕ/мл.
   2. Перенесите 0,5 мл ночной культуры в 4,5 мл BPW, перемешайте, затем переведите 0,5 мл разведенного вещества в 4,5 мл BPW для каждого дополнительного разведения.
      1. Распределите 10 мкл разведения 1 x 10³ КОЕ/мл на агаровой пластине BHI в трех экземплярах для подсчета клеток для расчета концентрации культуры в течение ночи.
2. Инокуляция образцов мяса
   1. Асептически переложите 25 г облученного куриного фарша в стерильный желудочный мешок в двух экземплярах. Размер мешка составляет 7,5 х 12 дюймов, а на нем есть маркировка 1,63 л. Мешок содержит фильтрующую перегородку с диаметром отверстия 330 мкм, а на квадратный см их приходится 285.
   2. В каждый образец вводят 1 мл разведения целевой концентрации. Например, добавьте 1 мл культуры из разведения 1 x 10³ КОЕ/мл для достижения уровня контаминации примерно 1000 клеток/25 г курицы. Аккуратно распределите жидкий инокулят по поверхности образцов курицы с помощью разбрасывателя стерильных клеток и дайте ему постоять 1 ч при температуре 4 °C.
   3. Подготовьте отрицательные контрольные образцы, добавив 1 мл стерильного BPW.

4. Обработка образцов

1. Добавьте 225 мл BPW в каждый образец. Соотношение объема и среды было выбрано в соответствии с FSIS MLG 4.15⁴.
2. Гомогенизируйте образцы с помощью Stomacher⁷ с нормальной скоростью и продолжительностью 120 секунд.
3. Центрифугирование и ресуспендирование
   1. Осторожно удалите жидкость с отфильтрованной стороны пакета с помощью пипетки объемом 50 мл. Разделите жидкость на две стерильные центрифужные бутылки.
   2. Сбалансируйте бутылочки стерильным BPW, чтобы обеспечить одинаковый вес. Центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Суспендируйте клеточную гранулу в 3 мл бульона BPW с помощью стерильного шпателя.
   3. Добавьте еще 27 мл бульона BPW и тщательно перемешайте, помешивая лопаткой. Объедините содержимое обеих бутылок центрифуги в одну бутылку для каждого образца.

5. Настройка блока MPN

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 изображена схема разведений в блоке с 48 лунками.

1. Добавьте по 3 мл ресуспендированной пробы в каждую лунку в столбце 1 блока из 48 лунок (8 повторов).
2. Приготовьте серию 10-кратных разведений в столбцах 1-6 в блоке с помощью восьмиканальной пипетки.
3. Добавьте 0,3 мл образца в 2,7 мл пипетки BPW для смешивания. Повторяйте для каждого разведения. Инкубируйте блоки в течение ночи (~18 часов) при температуре 37 °C с встряхиванием при ~100 об/мин.

6. Гальванизация и перечисление

1. Измененное перечисление табличек
   1. Планшет 7 мкл выращенного за ночь образца каждого разведения в сетке 4 x 6 на агаровой пластине с использованием многоканальной пипетки (рис. 2). Использование сетки 4 х 6 на двух планшетах лучше вмещает 8 образцов, в отличие от типичной сетки 6 х 6 капель⁸.
   2. Дайте планшетам высохнуть на воздухе в течение 10 минут перед инкубацией. Инкубировать агаровые пластины в течение ночи (~18-24 ч) при температуре 37 °C. После инкубации подсчитайте количество колоний на каждой пластине.

7. Обнаружение сальмонеллы методом количественной ПЦР

1. Экстракция ДНК с помощью коммерческого набора
   1. Смешайте культуры в 48-луночном блоке, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Пипетку по 200 мкл каждой культуры в 96-луночный ПЦР-планшет.
   2. Запечатайте, а затем центрифугируйте планшет при 6 600 x g в течение 10 минут. Снимите надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 20 мкл реактива набора.
   3. Повторно суспендируйте гранулу пипетированием вверх и вниз. Закройте и нагрейте пластину при температуре 99 °C в течение 10 минут, а затем охладите до 20 °C.
   4. Снова центрифугируйте при 6 600 x g в течение 10 минут. Используйте 2 мкл надосадочной жидкости для количественного ПЦР-анализа.
2. Настройка пластин
   1. Приготовьте реакционную смесь для количественной ПЦР в соответствии с установленным протоколом⁹ следующим образом: 10 μл 2x Master Mix; 0,4 мкл каждого праймера и зонда (рабочий раствор 10 мкМ): invA вперед: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA обратно: 5'-GGAGGCTCTCCGGGGGTCAAG-3', invA зонд: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' с маркировкой флуореновым красителем Cal Fluor Orange 560; 0,2 мкл матрицы для управления внутренней амплификацией (IAC) (6 x 10⁴ коп./мкл)⁹; 0,4 мкл каждого праймера и зонда IAC (10 μM): прямой IAC: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', обратный IAC: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3', зонд IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGAAGAATGCCACCA-3' меченный красителем TAMRA. Отрегулируйте объем с помощью ddH₂O до 20 μL всего.
   2. Проведите ПЦР в реальном времени со следующими циклическими условиями⁹: 95 °C в течение 10 мин (начальная денатурация ДНК и активация полимеразы горячего старта), 40 циклов 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин, используйте стандартные настройки Ct для экспорта результатов для анализа.

8. Детектирование с помощью анализа 3М МДС

1. Следуйте протоколу набора для молекулярного обнаружения сальмонеллы . Смешайте культуры в 48-луночном блоке, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Пипетка нанесет 20 μл каждого образца в прилагаемую набором пробирку для лизиса.
2. Нагрейте образцы до 100 °C в течение 15 минут. Раствор превратится из розового в желтый. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре. Раствор изменится с желтого на розовый.
3. Перелейте 20 мкл лизата в пробирку с реагентом и загрузите пробирки с реагентом в держатель.
4. Добавьте держатель к прибору MDS и настройте программное обеспечение для передачи информации о наборе и образце. Прибор требует, чтобы каждая лунка была помечена номером партии для анализа и названием образца. Запустите программное обеспечение MDS и экспортируйте отчет.

9. Анализ данных

1. Классификация положительных и отрицательных результатов.
   1. Для покрытия 4 x 6 капель оцените пятна на агаровых пластинах с хотя бы 1 колонией как положительные, а пятна на агаровых пластинах без роста как отрицательные.
   2. Для количественной ПЦР оценивайте лунки с Ct меньше или равным 30 как положительные, а лунки с Ct больше 30 как отрицательные.
   3. Для MDS используйте результаты из системы MDS, сообщенные как положительные или отрицательные.
2. Расчет MPN
   1. Анализируйте аннотированные положительные и отрицательные результаты, используя простой метод максимального вероятностного разрешения (SMPR^{), описанный} ранее6, или альтернативные проверенные калькуляторы MPN. ¹⁰

Облученное мясо
В регрессионном анализе наклон 1 указывает на то, что с каждой единицей увеличения независимой переменной (ось x) зависимая переменная (ось y) увеличивается ровно на 1 единицу. Это предполагает пропорциональную связь между двумя переменными, а...

Значение протокола
Сальмонелла остается серьезной проблемой для безопасности пищевых продуктов, особенно в продуктах птицеводства, которые часто являются причиной вспышек болезней пищевого происхождения^13,14. Являясь ...

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Данное исследование было поддержано Министерством сельского хозяйства США, Службой сельскохозяйственных исследований (USDA-ARS), Национальной программой 108, Информационной системой текущих исследований No 8072-42000-093-000-D и 8072-42000-094-000-D. Упоминание торговых названий или коммерческих продуктов в этой статье предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.