Ensayo modificado del número más probable para cuantificar la salmonela en productos de pollo crudos y listos para cocinar

Cuantificar con precisión la Salmonella en las aves de corral a niveles bajos es un desafío industrial y regulatorio actual. Este protocolo describe un ensayo de NMP que permite la cuantificación de Salmonella en productos avícolas crudos y listos para cocinar. Este método es rápido, sensible y se alinea con las pautas del FSIS, mejorando la seguridad alimentaria y apoyando los esfuerzos de salud pública.

La salmonela es una de las principales causas de enfermedades transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos, particularmente en los productos avícolas. Los métodos tradicionales para detectar Salmonella se centran en la prevalencia más que en la cuantificación, lo que limita su utilidad para evaluar los niveles y riesgos de contaminación. Este estudio presenta un nuevo ensayo del número más probable (NMP) diseñado para cuantificar la Salmonella en productos avícolas listos para cocinar, como el pollo cordon bleu. El método consiste en lavar la muestra de aves de corral, concentrar el enjuague a través de la centrifugación y diluirlo en serie en un bloque de 48 pocillos. El ensayo MPN se integra con el método de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para proporcionar una cuantificación sensible, precisa y rápida de la contaminación por Salmonella dentro del mismo período de tiempo que los protocolos existentes del Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria (FSIS). Los resultados muestran una fuerte correlación lineal entre las mediciones de MPN-LAMP y los niveles teóricos de inoculación (R² = 0,933). Sin embargo, la variabilidad a concentraciones más bajas pone de relieve los desafíos para detectar con precisión Salmonella a estos niveles, con el límite inferior práctico de detección estimado en aproximadamente 300 UFC/g. Los posibles refinamientos para mejorar la aplicabilidad del protocolo incluyen el aumento de la cantidad muestreada para mejorar aún más el límite de detección, la optimización de las formulaciones de los medios de enriquecimiento y la expansión de la detección molecular para dirigirse a múltiples serovares de Salmonella . En general, este estudio presenta una herramienta práctica para la industria alimentaria, que permite la cuantificación fiable de la contaminación por Salmonella en productos avícolas, contribuyendo a mejorar la seguridad alimentaria y la salud pública.

Como una de las principales causas de enfermedades, hospitalizaciones y muertes transmitidas por los alimentos en los EE. UU., la salmonela tiene un impacto económico y de salud pública significativo. La carga económica estimada del patógeno solo en 2013 fue de 3.670^millones de dólares. Aunque las recientes iniciativas regulatorias tienen como objetivo reducir la salmonelosis en un 25% para 2030², las brechas en las estrategias actuales de detección y mitigación siguen siendo evidentes, particularmente en la alineación de la vigilancia de las plantas de procesamiento con los resultados de salud pública³ .

Los productos avícolas congelados listos para cocinar, que se han visto implicados en múltiples brotes de Salmonella , son una preocupación importante para la salud pública. En respuesta, el Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria (FSIS, por sus siglas en inglés) clasificó a la Salmonella como adulterante en estos productos. Actualmente, la Guía de Laboratorio de Microbiología (MLG) 4.15 del FSIS se centra únicamente en determinar la prevalencia de Salmonella en productos avícolas⁴. Según esta directriz, las muestras recogidas se enriquecen durante 18-24 horas y luego se analizan utilizando el Sistema de Detección Molecular (MDS), que identifica la presencia o ausencia de Salmonella pero no ofrece información sobre el nivel de contaminación. Si bien este enfoque es valioso para detectar la presencia de patógenos, no proporciona información cuantitativa que podría ayudar a los procesadores de alimentos a evaluar los riesgos de contaminación con mayor precisión y tomar medidas correctivas específicas.

En este estudio, desarrollamos un método para aumentar la detección desde la prevalencia hasta la cuantificación de patógenos microbianos. Fue diseñado para una integración perfecta en los procesos existentes para detectar Salmonella en productos avícolas con una interrupción mínima de los protocolos actuales del FSIS. En lugar de simplemente enriquecer la muestra a granel, el método comienza lavando los productos avícolas utilizando medios consistentes con los métodos actuales del FSIS. Luego, el enjuague se distribuye en la primera columna de un bloque de pozos de 48 profundidades. Se realizan diluciones seriadas en las cinco columnas restantes, y el bloque se incuba durante 18-24 h, alineándose con el protocolo MLG 4.15. Después de la incubación, los pocillos se analizan para detectar Salmonella y los resultados se utilizan para calcular el número más probable (NMP)^5,6. Este enfoque permite la cuantificación de la contaminación dentro del mismo marco de tiempo que el proceso FSIS actual, lo que lo convierte en una opción práctica tanto para la industria como para el uso regulatorio. La Figura 1 muestra un diagrama de bloques que resume el ensayo MPN modificado. La figura incluye fotografías tomadas en etapas específicas, el bloque de 48 pocillos utilizado para la dilución y el crecimiento de réplicas, y las tres técnicas utilizadas como puntos de referencia para evaluar el número más probable de Salmonella presente en el pollo molido. En la primera fase de este estudio, utilizamos pollo molido irradiado para minimizar el impacto de la microflora de fondo y la incertidumbre de las mediciones relativas al inóculo verificado antes de aplicar el protocolo a muestras de pollo no irradiadas.

NOTA: Todo el trabajo asociado con este protocolo debe realizarse dentro de un laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2). Cuando sea apropiado, este protocolo debe llevarse a cabo dentro de una cabina de seguridad biológica (BSC) para mantener las condiciones asépticas y minimizar el riesgo de contaminación de la muestra o exposición del operador a patógenos microbianos. Al transferir muestras fuera del BSC, utilice recipientes sellados para mantener la integridad de la muestra y evitar derrames en caso de caídas accidentales. Preferiblemente, se deben usar componentes desechables durante todo el procedimiento para mitigar la posibilidad de contaminación cruzada. En los casos en que los desechables no sean factibles, asegúrese de que todos los equipos y materiales sean estériles antes de usarlos. La gestión adecuada de los residuos es crucial; Todos los componentes desechables usados deben desecharse como residuos de riesgo biológico. Materiales reutilizables en autoclave antes de su reutilización para garantizar una esterilización y contención adecuadas de materiales potencialmente peligrosos. El cumplimiento de estas precauciones no solo salvaguarda la integridad de la muestra, sino que también minimiza el riesgo de exposición del operador a patógenos microbianos.

1. Preparación de muestras de carne

1. Adquisición y procesamiento de muestras de carne
   1. Carne fresca
      1. Compre pollo molido en el departamento de carne fresca de los minoristas locales. Transfiera todas las muestras al almacenamiento a 4 °C y procese dentro de las 24 horas posteriores a la recepción. Divida asépticamente la carne en muestras de 25 g.
      2. Sellar al vacío e irradiar la muestra. Aquí, el Centro Nacional de Investigación por Haz de Electrones de Texas A&M AgriLife irradió carne sometida a una dosis de ~25 kGy.
         NOTA: Si bien la irradiación se utilizó como medida de control en este estudio para garantizar la eliminación de la microflora de fondo, no es un requisito previo para el protocolo en aplicaciones prácticas, como lo demuestran los productos listos para cocinar no irradiados utilizados en la sección siguiente. En entornos de campo, los métodos alternativos, como los medios selectivos o la especificidad del diagnóstico molecular, pueden abordar la posible interferencia de microorganismos no objetivo.
   2. Productos de pollo listos para cocinar
      1. Adquiera productos de pollo listos para cocinar en la sección de alimentos congelados de los minoristas locales. Dividir asépticamente en muestras de 25 g.
      2. Recoja muestras del centro de las piezas individuales para asegurarse de que todos los ingredientes (por ejemplo, empanizado y queso) estén incluidos.
2. Preparación de los medios
   1. Prepare agua de peptona tamponada (BPW) disolviendo 25 g de polvo de BPW en 1 L de H₂O nanopuro.
   2. Prepare placas de infusión cerebro-corazón (BHI). Para ello, disuelva 37 g de polvo de BHI en 1 L de nanopure H₂O y añada 15 g de agar en la solución de BHI. Esterilice todos los medios esterilizándolos en autoclave a 121 °C durante 15 min. Vierta de 20 a 25 ml de medio en placas de Petri con tapa transparente (100 mm x 15 mm).
      NOTA: Lo mejor es verter las placas dentro de una cabina de seguridad biológica para mantener las condiciones asépticas.

2. Cultivo celular

1. Preparar el cultivo inicial rayando Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 en una placa de agar BHI e incubar a 37 °C durante la noche.
2. Prepare cultivos durante la noche inoculando 25 mL de caldo BHI con una colonia de Salmonella recién cultivada. Cultivo aeróbico durante la noche a 37 °C con agitación a 100 rpm.

3. Inoculación de muestras de aves de corral

1. Dilución y recubrimiento de cultivos
   1. Prepare una serie de diluciones 10 veces del cultivo nocturno en BPW para lograr concentraciones finales de aproximadamente 1 x 10⁸ a 1 x 10^{1 UFC} /mL. Supongamos que la concentración del cultivo nocturno de Salmonella es de 1 x 10⁹ UFC/mL.
   2. Transfiera 0,5 mL del cultivo nocturno a 4,5 mL de BPW, mezcle, luego transfiera 0,5 mL de la dilución a 4,5 mL de BPW por cada dilución adicional.
      1. Extienda 10 μL de la dilución de 1 x 10³ UFC/mL en una placa de agar BHI por triplicado para la enumeración de células para calcular la concentración de cultivo durante la noche.
2. Inoculación de muestras de carne
   1. Transfiera asépticamente 25 g de pollo molido irradiado a una bolsa estomacal estéril por duplicado. La bolsa mide 7,5 x 12 pulgadas y está etiquetada como 1,63 L. La bolsa contiene una partición de filtro con un diámetro de orificio de 330 μm, y hay 285 por cm cuadrado.
   2. Inocular cada muestra con 1 mL de la concentración objetivo de dilución. Por ejemplo, agregue 1 mL de cultivo de la dilución de 1 x 10³ UFC/mL para lograr un nivel de contaminación de aproximadamente 1,000 células/25 g de pollo. Distribuya suavemente el inóculo líquido sobre la superficie de las muestras de pollo utilizando un esparcidor de células estéril y déjelo reposar durante 1 h a 4 °C.
   3. Prepare muestras de control negativas agregando 1 mL de BPW estéril.

4. Procesamiento de muestras

1. Agregue 225 mL de BPW a cada muestra. La relación entre el volumen y el medio se seleccionó para alinearse con FSIS MLG 4.15⁴.
2. Homogeneizar las muestras utilizando el Stomacher⁷ a velocidad normal y una duración de 120 s.
3. Centrifugación y resuspensión
   1. Retire con cuidado el líquido del lado filtrado de la bolsa con una pipeta de 50 ml. Divida el líquido en dos botellas de centrífuga estériles.
   2. Equilibre los frascos con BPW estéril para garantizar pesos iguales. Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 3 mL de caldo BPW con una espátula estéril.
   3. Agregue 27 ml adicionales de caldo BPW y mezcle bien revolviendo con una espátula. Combine el contenido de ambos frascos de centrífuga en un frasco para cada muestra.

5. Configuración de bloques MPN

NOTA: La Tabla 1 muestra un esquema de las diluciones en un bloque de 48 pocillos.

1. Agregue 3 mL de la muestra resuspendida a cada pocillo en la columna 1 del bloque de 48 pocillos (8 repeticiones).
2. Prepare una serie de diluciones de 10 veces en las columnas 1-6 dentro del bloque utilizando una pipeta de ocho canales.
3. Añada 0,3 mL de muestra en 2,7 mL de pipeta BPW para mezclar. Repita para cada dilución. Incubar los bloques durante la noche (~18 h) a 37 °C con agitación a ~100 rpm.

6. Enchapado y enumeración

1. Enumeración de placa de caída modificada
   1. Placa de 7 μL de muestra cultivada durante la noche de cada dilución en una rejilla de 4 x 6 en una placa de agar utilizando una pipeta multicanal (Figura 2). El uso de una cuadrícula de 4 x 6 en dos placas acomoda mejor 8 muestras, a diferencia de la típica cuadrícula de 6 x 6 de gotas⁸.
   2. Deje que las placas se sequen al aire durante 10 minutos antes de la incubación. Incubar las placas de agar durante la noche (~18-24 h) a 37 °C. Después de la incubación, cuente el número de colonias en cada plato.

7. Detección de Salmonella por qPCR

1. Extracción de ADN con un kit comercial
   1. Mezcle los cultivos en el bloque de 48 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Pipetear 200 μL de cada cultivo en una placa de PCR de 96 pocillos.
   2. Selle y luego centrifugue la placa a 6.600 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y añada 20 μL del reactivo del kit al pellet.
   3. Vuelva a suspender el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Selle y caliente la placa a 99 °C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20 °C.
   4. Vuelva a centrifugar a 6.600 x g durante 10 min. Utilice 2 μL del sobrenadante para el análisis de qPCR.
2. Configuración de la placa
   1. Prepare la mezcla de reacción de qPCR de acuerdo con^{el protocolo 9} establecido de la siguiente manera: 10 μL de 2x Master Mix; 0,4 μL de cada cebador y sonda (10 μM de solución de trabajo): invA adelante: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA reverso: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTCTC-3' etiquetados con el colorante de fluorenos Cal Fluor Orange 560; 0,2 μL de plantilla de control de amplificación interna (IAC) (6 x 10⁴ copias/μL)⁹; 0,4 μL de cada cebador y sonda IAC (10 μM): IAC hacia adelante: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC hacia atrás: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTA-3', sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' marcada con colorante TAMRA. Ajuste el volumen con ddH₂O a 20 μL en total.
   2. Realice PCR en tiempo real con las siguientes condiciones de ciclo⁹: 95 °C durante 10 min (desnaturalización inicial del ADN y activación de la polimerasa de arranque en caliente), 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min, utilice la configuración predeterminada de Ct para exportar los resultados para el análisis.

8. Detección mediante el ensayo MDS de 3M

1. Siga el protocolo del kit de ensayo de detección molecular de Salmonella . Mezcle los cultivos en el bloque de 48 pocillos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Pipetear 20 μL de cada muestra en el tubo de lisis suministrado por el kit.
2. Calentar las muestras a 100 °C durante 15 min. La solución cambiará de rosa a amarillo. Incubar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente. La solución cambiará de amarillo a rosa.
3. Transfiera 20 μL de lisado a un tubo de reactivo y cargue los tubos de reactivo en el soporte.
4. Agregue el soporte al instrumento MDS y configure el software para comunicar la información sobre el kit y la muestra. El instrumento requiere que cada pocillo esté etiquetado con el número de lote del ensayo y un nombre de muestra. Ejecute el software MDS y exporte el informe.

9. Análisis de datos

1. Clasificación de resultados positivos y negativos.
   1. Para el recubrimiento de 4 x 6 gotas, evalúe las manchas en las placas de agar con al menos 1 colonia como positivas y las manchas en las placas de agar sin crecimiento como negativas.
   2. Para la qPCR, evalúe los pocillos que tienen un Ct menor o igual a 30 como positivos y los pocillos que tienen un Ct mayor que 30 como negativos.
   3. En el caso de MDS, utilice los resultados del sistema MDS, notificados como positivos o negativos.
2. Cálculo de MPN
   1. Analice los positivos y negativos anotados utilizando el método de resolución de probabilidad máxima simple (SMPR^{) descrito anteriormente} 6 o calculadoras MPN verificadas alternativas. ¹⁰

Carne irradiada
En el análisis de regresión, una pendiente de 1 indica que por cada unidad de aumento en la variable independiente (eje x), la variable dependiente (eje y) aumenta exactamente 1 unidad. Esto sugiere una relación proporcional entre las dos variables, lo que significa que el cambio en la variable dependiente refleja el cambio en la variable independiente. Una intersección con el cliente 0 significa que cuando la variable independiente es 0, la variab...

Importancia del protocolo
La salmonela sigue siendo una preocupación importante en la inocuidad de los alimentos, particularmente dentro de los productos avícolas, que a menudo están implicados en brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos^13,14. Como una de las principales causas de enfermedades bacterianas transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos, los métodos confiables pa...

Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola (USDA-ARS), Programa Nacional 108, Número del Sistema de Información de Investigación Actual 8072-42000-093-000-D y 8072-42000-094-000-D. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica una recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.