생닭고기 및 바로 조리할 수 있는 닭고기 제품에서 살모넬라균 을 정량화하기 위해 수정된 가장 가능성 있는 숫자 분석

낮은 수준의 가금류에서 살모넬라균 을 정확하게 정량화하는 것은 현재 산업 및 규제의 과제입니다. 이 프로토콜은 생가금류 및 바로 조리할 수 있는 가금류 제품에서 살모넬라균 을 정량화할 수 있는 MPN 분석을 설명합니다. 이 방법은 빠르고 민감하며 FSIS 지침과 일치하여 식품 안전을 강화하고 공중 보건 노력을 지원합니다.

살모넬라균 은 미국에서 특히 가금류 제품에서 식인성 질병의 주요 원인입니다. 살모넬라균 을 검출하는 전통적인 방법은 정량화보다는 유병률에 중점을 두어 오염 수준과 위험을 평가하는 데 유용성을 제한합니다. 이 연구는 치킨 꼬르동 블루와 같은 즉석 조리 가금류 제품에서 살모넬라균 을 정량화하기 위해 고안된 새로운 MPN(Most Probable Number) 분석을 소개합니다. 이 방법은 가금류 샘플을 세척하고, 원심 분리를 통해 헹굼을 농축하고, 48웰 블록에서 연속적으로 희석하는 것입니다. MPN 분석은 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 방법과 통합되어 기존 식품 안전 및 검사 서비스(FSIS) 프로토콜과 동일한 기간 내에 살모넬라 오염 에 대한 민감하고 정확하며 신속한 정량화를 제공합니다. 결과는 MPN-LAMP 측정과 이론적 접종 수준(R² = 0.933) 사이에 강한 선형 상관관계를 보여줍니다. 그러나 낮은 농도에서의 변동성은 이러한 수준에서 살모넬라균 을 정확하게 검출하는 데 어려움을 부각시키며, 실제 검출 하한은 약 300 CFU/g으로 추정됩니다. 프로토콜의 적용 가능성을 개선하기 위한 잠재적인 개선 사항에는 검출 한계를 더욱 개선하기 위해 샘플링된 양을 늘리고, 농축 배지 제형을 최적화하고, 여러 Salmonella 혈청형을 표적으로 하도록 분자 검출을 확장하는 것이 포함됩니다. 전반적으로 이 연구는 식품 산업을 위한 실용적인 도구를 제시하여 가금류 제품의 살모넬라 오염 을 신뢰할 수 있는 정량화로 하여 식품 안전 및 공중 보건 개선에 기여합니다.

미국에서 식품 매개 질병, 입원 및 사망의 주요 원인인 살모넬라균은 공중 보건 및 경제적 영향에 상당한 영향을 미칩니다. 2013년 한 해에만 이 병원균의 경제적 부담으로 추정된 경제적 부담은 36억 7,000만 달러였다¹. 최근의 규제 이니셔티브는 2030년까지 살모넬라증을 25% 줄이는 것을 목표로 하고^{있지만, 현재} 탐지 및 완화 전략의 격차는 여전히 분명하며, 특히 가공 공장 감시를 공중 보건 결과와 연계하는 데 있어^{3 .}

여러 차례의 살모넬라 발 병과 관련된 즉석 조리 가능한 냉동 가금류 제품은 공중 보건에 대한 중요한 우려 사항입니다. 이에 대응하여 FSIS(Food Safety and Inspection Service)는 이러한 제품에서 살모넬라 균을 불순물로 분류했습니다. 현재 FSIS Microbiology Laboratory Guidebook(MLG) 4.15는 가금류 제품에서 살모넬라균 의 유병률을 결정하는 데에만 초점을 맞추고 있습니다⁴. 이 지침에 따라 수집된 샘플은 18-24시간 동안 농축된 다음 살모넬라균 의 유무를 식별하지만 오염 수준에 대한 통찰력을 제공하지 않는 분자 검출 시스템(MDS)을 사용하여 스크리닝합니다. 이 접근 방식은 병원체의 존재를 감지하는 데 유용하지만 식품 가공업체가 오염 위험을 보다 정확하게 평가하고 표적화된 시정 조치를 취하는 데 도움이 될 수 있는 정량적 정보를 제공하지 못합니다.

이 연구에서는 미생물 병원체의 유병률에서 정량화까지 검출을 강화하는 방법을 개발했습니다. 기존 공정에 원활하게 통합되어 현재 FSIS 프로토콜에 대한 중단을 최소화하면서 가금류 제품에서 살모넬라균을 검출할 수 있도록 설계되었습니다. 단순히 벌크 샘플을 농축하는 대신 이 방법은 현재 FSIS 방법과 일치하는 매체를 사용하여 가금류 제품을 세척하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 헹굼은 48 깊이의 웰 블록의 첫 번째 컬럼으로 분배됩니다. 나머지 5개 컬럼에 걸쳐 연속 희석을 수행하고, 블록은 MLG 4.15 프로토콜에 따라 18-24시간 동안 배양됩니다. 배양 후 웰에서 살모넬라균을 테스트하고 결과를 사용하여 가장 가능성이 높은 수(MPN)^5,6을 계산합니다. 이 접근 방식을 사용하면 현재 FSIS 프로세스와 동일한 기간 내에 오염을 정량화할 수 있으므로 산업 및 규제 용도 모두에 실용적인 옵션이 됩니다. 그림 1은 수정된 MPN 분석을 요약한 블록 다이어그램을 보여줍니다. 이 그림에는 특정 단계에서 촬영한 사진, 복제물의 희석 및 성장에 사용되는 48웰 블록, 다진 닭에 존재하는 살모넬라균의 가장 가능성 있는 수를 평가하기 위한 벤치마크로 사용되는 세 가지 기술이 포함됩니다. 이 연구의 첫 번째 단계에서는 방사선 조사되지 않은 닭 샘플에 프로토콜을 적용하기 전에 확인된 접종물에 비해 배경 미생물군의 영향과 측정의 불확실성을 최소화하기 위해 방사선 조사된 다진 닭을 사용했습니다.

참고: 이 프로토콜과 관련된 모든 작업은 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행해야 합니다. 적절한 경우, 이 프로토콜은 무균 상태를 유지하고 시료 오염 또는 미생물 병원체에 대한 작업자의 노출 위험을 최소화하기 위해 생물 안전 작업대(BSC) 내에서 수행되어야 합니다. BSC 외부로 시료를 옮길 때는 밀봉된 용기를 사용하여 시료 무결성을 유지하고 우발적인 낙하 시 유출을 방지하십시오. 가급적이면 교차 오염의 가능성을 완화하기 위해 절차 전반에 걸쳐 일회용 구성 요소를 사용해야 합니다. 일회용품을 사용할 수 없는 경우 사용하기 전에 모든 장비와 재료가 멸균되었는지 확인하십시오. 적절한 폐기물 관리가 중요합니다. 사용한 모든 일회용 부품은 생물학적 유해 폐기물로 폐기해야 합니다. 재사용 가능한 재료를 재사용하기 전에 오토클레이브하여 잠재적으로 위험한 물질의 적절한 멸균 및 봉쇄를 보장합니다. 이러한 예방 조치를 준수하면 시료 무결성을 보호할 뿐만 아니라 작업자가 미생물 병원체에 노출될 위험을 최소화할 수 있습니다.

1. 육류 샘플의 준비

1. 육류 샘플의 입수 및 가공
   1. 신선한 고기
      1. 지역 소매점의 신선 육류 부서에서 간 닭고기를 구입하십시오. 모든 샘플을 4°C의 저장소로 옮기고 수령 후 24시간 이내에 처리합니다. 고기를 무균 상태로 25g 샘플로 나눕니다.
      2. 진공 밀봉하고 샘플을 조사합니다. 여기, Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research는 ~25kGy의 선량에 노출된 고기를 조사했습니다.
         참고: 이 연구에서는 배경 미생물군의 제거를 보장하기 위해 방사선 조사가 제어 수단으로 사용되었지만, 후속 섹션에서 사용된 방사선 조사되지 않은 즉석 조리 제품에서 볼 수 있듯이 실제 적용에서 프로토콜의 전제 조건은 아닙니다. 현장 환경에서는 선택적 배지 또는 분자 진단의 특이성과 같은 대체 방법을 통해 비표적 미생물의 잠재적인 간섭을 해결할 수 있습니다.
   2. 바로 조리할 수 있는 닭고기 제품
      1. 지역 소매점의 냉동 식품 섹션에서 바로 조리할 수 있는 닭고기 제품을 구입하십시오. 무균 상태로 25g 샘플로 나눕니다.
      2. 모든 재료(예: 빵가루 입히기 및 치즈)가 포함되어 있는지 확인하기 위해 개별 조각의 중앙에서 샘플을 수집합니다.
2. 배지 준비
   1. 1L의 나노퓨어 H₂O에 BPW 분말 25g을 용해시켜 완충 펩톤 워터(BPW)를 준비합니다.
   2. 뇌 심장 주입(BHI) 플레이트를 준비합니다. 이렇게하려면 37g의 BHI 분말을 1L의 나노 순수 H₂O에 용해시키고 15g의 한천을 BHI 용액에 첨가하십시오. 121°C에서 15분 동안 고압증기멸균하여 모든 매체를 살균합니다. 20-25mL의 매체를 투명 뚜껑(100mm x 15mm)이 있는 페트리 접시에 붓습니다.
      알림: 무균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛 안에 플레이트를 붓는 것이 가장 좋습니다.

2. 세포 배양

1. BHI 한천 플레이트에 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028을 줄무늬를 두어 초기 배양을 준비하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 25mL의 BHI 육수에 갓 자란 살모넬라균 한 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비합니다. 100rpm으로 진탕하면서 37°C에서 밤새 배양물을 호기적으로 성장시킵니다.

3. 가금류 샘플의 접종

1. 배양 희석 및 도금
   1. BPW에서 익일 배양을 일련의 10배 희석액으로 준비하여 약 1 x 10⁸ - 1 x 10¹ CFU/mL의 최종 농도를 달성합니다. Salmonella 야간 배양의 농도가 1 x 10⁹ CFU/mL라고 가정합니다.
   2. 하룻밤 배양 용액 0.5mL를 BPW 4.5mL로 옮기고, 혼합한 다음, 추가 희석할 때마다 0.5mL의 희석액을 BPW 4.5mL로 옮깁니다.
      1. 1 x 10³ CFU/mL 희석액 10 μL를 BHI 한천 플레이트에 3회 농도로 펴서 세포 계수를 계산하여 야간 배양 농도를 계산합니다.
2. 육류 샘플의 접종
   1. 방사선 조사된 다진 닭고기 25g을 무균 상태로 멸균 위장 백에 복제하여 옮깁니다. 가방은 7.5 x 12인치이며 1.63L로 표시되어 있습니다. 백에는 구멍 직경이 330μm인 필터 파티션이 포함되어 있으며 제곱센티미터당 285개가 있습니다.
   2. 각 샘플에 목표 농도 희석 1mL를 접종합니다. 예를 들어, 1 x 10³ CFU/mL 희석액에서 1mL의 배양액을 추가하면 약 1,000개 세포/닭고기 25g의 오염 수준을 얻을 수 있습니다. 멸균 세포 스프레더를 사용하여 닭고기 샘플의 표면에 액체 접종물을 부드럽게 분배하고 4°C에서 1시간 동안 그대로 둡니다.
   3. 1mL의 멸균 BPW를 첨가하여 음성 대조군 샘플을 준비합니다.

4. 샘플 처리

1. 각 샘플에 BPW 225mL를 추가합니다. 볼륨과 미디어의 비율은 FSIS MLG 4.15⁴에 맞게 선택되었습니다.
2. Stomacher⁷ 을 사용하여 정상 속도와 120초 동안 샘플을 균질화합니다.
3. 원심분리 및 재부유
   1. 50mL 피펫을 사용하여 백의 여과된 면에서 액체를 조심스럽게 제거합니다. 액체를 두 개의 멸균 원심분리기 병으로 나눕니다.
   2. 동일한 무게를 보장하기 위해 멸균 BPW로 병의 균형을 맞춥니다. 10,000 x g 에서 10분 동안 시료를 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 멸균 주걱으로 BPW 육수 3mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
   3. BPW 육수 27mL를 더 넣고 주걱으로 저어 잘 섞습니다. 두 원심분리기 병의 내용물을 각 샘플에 대해 하나의 병으로 결합합니다.

5. MPN 블록 설정

참고: 표 1 은 48웰 블록의 희석액 개략도를 보여줍니다.

1. 재현탁된 샘플 3mL를 48웰 블록의 컬럼 1에 있는 각 웰에 추가합니다(8회 반복).
2. 8채널 피펫을 사용하여 블록 내 1-6열에 걸쳐 일련의 10배 희석액을 준비합니다.
3. 2.7mL의 BPW 피펫에 0.3mL의 샘플을 추가하여 혼합합니다. 각 희석에 대해 반복합니다. ~100rpm으로 진탕하면서 37°C에서 밤새(~18시간) 블록을 배양합니다.

6. 도금 및 열거

1. 수정된 드롭 플레이트 열거
   1. 다중 채널 피펫을 사용하여 한천 플레이트의 4 x 6 그리드에서 각 희석액의 하룻밤 동안 성장한 샘플 7μL를 플레이트에 넣습니다(그림 2). 두 개의 플레이트에 4 x 6 그리드를 사용하면 일반적인 6 x 6 그리드의 액적⁸과 달리 8개의 샘플을 더 잘 수용할 수 있습니다.
   2. 배양 전에 플레이트를 10분 동안 자연 건조시키십시오. 37 ° C에서 밤새 (~ 24-24 h) 한천 플레이트를 배양합니다. 배양 후 각 플레이트의 식민지 수를 세십시오.

7. 살모넬라균의 qPCR 검출

1. 상용 키트를 사용한 DNA 추출
   1. 48웰 블록에서 위아래로 여러 번 피펫팅하여 배양물을 혼합합니다. 각 배양액 200μL를 96웰 PCR 플레이트에 피펫팅합니다.
   2. 플레이트를 밀봉한 다음 6,600 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 키트 시약 20μL를 펠릿에 추가합니다.
   3. 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 플레이트를 밀봉하고 99°C에서 10분 동안 가열한 다음 20°C로 냉각합니다.
   4. 6,600 x g 에서 10분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다. qPCR 분석을 위해 2μL의 상층액을 사용합니다.
2. 플레이트 설정
   1. 확립된 프로토콜⁹ 에 따라 qPCR 반응 혼합물을 다음과 같이 준비합니다: 10 μL의 2x 마스터 믹스; 각 프라이머 및 프로브의 0.4 μL (10 μM 작업 용액) : invA 정방향 : 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA 역방향 : 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', invA 프로브 : Cal Fluor Orange 560 플루오렌 염료로 표지 된 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3'; 0.2μL의 IAC(internal amplification control) 템플릿(6 x 10,⁴ copy/μL)⁹; 각 IAC 프라이머 및 프로브의 0.4 μL (10 μM) : IAC 정방향 : 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC 역방향 : 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTA-3', IAC 프로브 : TAMRA 염료로 표지 된 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3'. ddH₂O를 사용하여 부피를 총 20 μL로 조정합니다.
   2. 다음 사이클링 조건⁹: 95°C에서 10분(DNA의 초기 변성 및 핫스타트 중합효소 활성화), 95°C에서 15초, 60°C에서 1분의 40사이클로 Real-Time PCR을 수행하고, 기본 Ct 설정을 사용하여 분석을 위해 결과를 내보냅니다.

8. 3M MDS 분석을 이용한 검출

1. 분자 검출 분석 Salmonella kit protocol을 따릅니다. 48웰 블록에서 위아래로 여러 번 피펫팅하여 배양물을 혼합합니다. 각 시료 20μL를 키트에서 제공하는 lysis tube에 피펫팅합니다.
2. 샘플을 100°C에서 15분 동안 가열합니다. 용액이 분홍색에서 노란색으로 바뀝니다. 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 솔루션이 노란색에서 분홍색으로 바뀝니다.
3. 20μL의 용해물을 시약 튜브로 옮기고 시약 튜브를 홀더에 로드합니다.
4. MDS 기기에 홀더를 추가하고 키트와 샘플에 대한 정보를 전달하도록 소프트웨어를 구성합니다. 이 기기에서는 각 웰에 분석의 로트 번호와 샘플 이름이 표시되어 있어야 합니다. MDS 소프트웨어를 실행하고 보고서를 내보냅니다.

9. 데이터 분석

1. 긍정적 및 부정적 결과의 분류.
   1. 4 x 6 드롭 도금의 경우, 최소 1개의 콜로니가 있는 한천 플레이트의 반점을 양성으로, 성장이 없는 한천 플레이트의 반점을 음성으로 평가합니다.
   2. qPCR의 경우, Ct가 30보다 작거나 같은 웰을 양수로 평가하고 Ct가 30보다 큰 웰을 음수로 평가합니다.
   3. MDS의 경우, 양성 또는 음성으로 보고된 MDS 시스템의 결과를 사용합니다.
2. MPN 계산
   1. 앞서^{설명한 6} 또는 검증된 대체 MPN 계산기를 사용하여 SMPR(Simple Maximum Probability Resolution) 방법을 사용하여 주석이 달린 긍정과 음수를 분석합니다. ¹⁰분

방사선 조사된 고기
회귀 분석에서 기울기 1은 독립 변수(x축)의 단위가 증가할 때마다 종속 변수(y축)가 정확히 1단위씩 증가한다는 것을 나타냅니다. 이는 두 변수 간의 비례 관계를 시사하며, 이는 종속 변수의 변화가 독립 변수의 변화를 반영한다는 것을 의미합니다. 절편이 0이면 독립 변수가 0일 때 종속 변수도 0임을 의미합니다. 이는 두 변수 간의 관?...

프로토콜의 중요성
살모넬라균은 식품 안전, 특히 가금류 제품 내에서 주요 관심사로 남아 있으며, 이는 종종 식품 매개 질병 발병과 관련이 있습니다^13,14. 미국에서 세균성 식인성 질병의 주요 원인인 신선 가금류 및 즉석 조리 가금류 제품 모두에서 살모넬라균을 검출하는 신뢰할 수 있는 방법은 ...

모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 연구는 미국 농무부, 농업 연구 서비스(USDA-ARS), 국가 프로그램 108, 현재 연구 정보 시스템 번호 8072-42000-093-000-D 및 8072-42000-094-000-D의 지원을 받았습니다. 이 기사에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 권장 또는 보증을 의미하지 않습니다. USDA는 기회 균등 제공자이자 고용주입니다.