İmplant Yüzeylerinde M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Makrofajların Polarizasyonu ve Karakterizasyonu

Burada, mevcut protokollerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmeyi ve daha fazla araştırmayı teşvik etmeyi amaçlayan, in vitro implant yüzeylerinin immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Salgı sitokin profilleri, mRNA ekspresyonu ve hücre yüzey belirteçleri, titanyum üzerinde yetiştirilen makrofaj polarizasyonunu araştırmak için kan monositinden türetilmiş makrofajlar kullanılarak izlendi.

Bağışıklık aracılı karmaşık bir iyileşme süreci olan yabancı cisim reaksiyonu (FBR), implantların vücuda entegre edilmesinde çok önemli bir rol oynar. Makrofajlar, immün sistemin implant yüzeyleri ile etkileşiminin ilk hattı olarak, inflamasyon-rejenerasyon dengesinin modüle edilmesinde çift yönlü bir rol oynarlar. İmplant materyalleri ile immün yanıtlar arasındaki reaksiyonların derinlemesine anlaşılması ve değerlendirilmesi için güvenilir in vitro yöntemler ve protokoller çok önemlidir. Farklı in vitro modeller arasında, primer monosit kaynaklı makrofajlar (MDM'ler), makrofaj-implant etkileşimlerini araştırmak için mükemmel bir model sunar. MDM'lerin implant yüzeylerinde M1 (klasik olarak aktive edilmiş) ve M2 (alternatif olarak aktive edilmiş) makrofajlara polarizasyonunu değerlendirmek için deneysel bir protokol uyguladık. Sağlıklı donörlerden kan monositlerini izole ettik ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kullanarak makrofajlara ayırdık. Diferansiye makrofajlar implant yüzeylerinde kültürlendi ve M1 ve M2 alt tiplerine polarize edildi. M1 polarizasyonu interferon (IFN)-γ ve lipopolisakkarit (LPS) varlığında elde edilirken, M2 polarizasyonu interlökin (IL)-4 ve IL-13 içeren bir ortamda gerçekleştirildi. Makrofaj fenotiplerini, salgılanan sitokin panellerine, hücre yüzeyi belirteçlerine ve eksprese edilen genlere dayalı olarak Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA), konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ile değerlendirdik. Ekstrakte edilen RNA, tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürüldü ve M1 ve M2 makrofajları ile ilgili mRNA'yı ölçmek için qRT-PCR kullanıldı. Buna göre, M1 makrofajları, daha yüksek CD209 ve CCL13 seviyeleri sergileyen M2 makrofajlarına kıyasla daha yüksek proinflamatuar Tümör nekroz faktörü (TNF-α) sitokin ekspresyonu ve CCR7 yüzey belirteci ile karakterize edilmiştir. Sonuç olarak, CCR7 ve CD209, CLSM ile immün boyama ve görüntüleme yoluyla M1 ve M2 makrofaj alt tiplerinin spesifik ve güvenilir belirteçleri olarak tanımlandı. ELISA'nın M1'de yüksek TNF-ɑ seviyesini ve M2 hücrelerinde artmış CCL13'ü tespit etmesiyle daha fazla doğrulama sağlandı. Önerilen belirteçler ve deney düzeneği, implantların immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için etkili bir şekilde kullanılabilir.

İmplante edilebilir biyomalzemeler, çeşitli insan hastalıkları için geleneksel bir çözüm haline gelmiştir ve doku mühendisliği, ilaç dağıtım sistemleri ve implantlar dahil olmak üzere biyomedikal araştırmalarda büyük rol oynamaktadır ^1,2. Kalça protezleri, stentler, meshler, kalp kapakçıkları veya diş implantları gibi farklı yapı ve işlevlere sahip çeşitli malzemelerden yapılmış çok çeşitli implantlar vardır. İmplantasyon üzerine, doku-implant teması bir bağışıklık tepkisine neden olur, ardından çözünürlük, doku yeniden şekillenmesi ve homeostaz gelir. Bu süreçler, kullanılan biyomalzemelerin fiziksel, kimyasal ve biyoaktif özelliklerinden etkilenir. Bu özellikler, pro- ve anti-inflamatuar yanıtların yoğunluğunu ve spektrumunu, fibrotik kapsül oluşumunu, doku bozulmasını ve iyileşme fazını etkileyebilir ^3,4. İyileşme sürecini ve uzun vadeli implant entegrasyonunu desteklemek ve optimize etmek için, mevcut araştırmanın ortaya çıkan bir yönü, implant yüzeyleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi araştırmak ve aracılık etmektir.

Diğer bağışıklık hücrelerinin yanı sıra, vücudun her yerinde bulunan makrofajlar, iltihaplanma ve anti-patojenik savunmanın yanı sıra iyileşme süreçlerinde ve doku homeostazının korunmasında kilit oyunculardır ^5,6. Makrofajlar, plastisitelerine ve yerel doku mikroçevresel uyaranlarına dayanarak, hücre metabolizması, hücresel fonksiyonlar ve sitokin sekresyon profillerinde büyük farklılıklar gösteren farklı fonksiyonel fenotiplere polarize olabilirler. Klasik olarak aktive olan M1 fenotipi, IL-1β, IL-6 ve TNF-α gibi proinflamatuar sitokinlerin salgılanması ile ayırt edilebilir ve travma ve yabancı biyomateryallere karşı ilk ve kronik inflamatuar yanıtta rol oynar. Buna karşılık, alternatif olarak, IL-4 ve IL-13 gibi sitokinler tarafından tetiklenen aktive edilmiş M2 makrofajları, inflamasyonun çözülmesi ve doku iyileşmesinin desteklenmesi gibi karakteristik özelliklere sahiptir. M2-polarize makrofajlar, CD206 gibi hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonu ve IL-10 ve IL-4⁷ gibi sitokinlerin üretimi ile tanımlanabilir. Benzer şekilde, zaten polarize olmuş makrofajlar kendilerini yeni bir mikro ortamda yeniden programlayabilirler.

Hücre-biyomateryal etkileşimleri üzerine yapılan birçok çalışma, implante edilebilir biyomalzemelere yönelik immünolojik yanıtlar dizisinde ve implantla ilişkili komplikasyonların iyileşmesinde yer alan süreçlerin düzenlenmesinde makrofajların önemini göstermiştir ^8,9,10. Biyomedikal mühendisliği son yıllarda önemli ilerlemeler kaydetmiş olsa da, implantların makrofaj davranışını ve polarizasyonu nasıl modüle ettiğini anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır 11,12,13.

Hücre kültüründe, monosit kaynaklı periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), sırasıyla LPS ve IFN-γ veya IL-4 kullanılarak M1 veya M2 fenotiplerine doğru indüklenmiş polarizasyonu takiben yapışık M0 makrofajlarına farklılaştırılabilir. Yeni biyomateryal örnekleriyle in vitro inkübasyondan sonra, in vitro^14,15 biyomalzemelerin immünomodülatör potansiyelini tespit etmek için M1 ve M2 makrofajlarının farklı hücre yüzeyi reseptörlerini ve sitokin profillerini kullanmak mümkündür. Bu çalışma, farklı implant yüzeylerine yanıt olarak MDM'lerin polarizasyonunu araştırmak için kullanılabilecek bir in vitro protokol geliştirmeyi amaçladı. Gen ekspresyon analizleri, mikroskopi teknikleri ve ELISA, biyomateryal tarafından modüle edilen M1 ve M2 makrofajlarının fenotipik belirteçlerini ve spesifik sitokin profillerini belirlemek için kullanılabilir. Bu nedenle, makrofajlar ve biyomateryal yüzeyler arasındaki karmaşık etkileşimler aydınlatılabilir ve makrofaj-biyomateryal etkileşimlerini daha iyi anlamak için değerli bilgiler elde edilebilir. Son olarak, standartlaştırılmış bir in vitro protokol, deney düzeneğindeki değişkenliği en aza indirerek deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini sağlar.

İnsan periferik kanı, Tübingen Üniversitesi tıp fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylanan protokole uygun olarak sağlıklı kan bağışçılarından elde edildi (etik onay: 286/2021 BO). İnsan PBMC'leri, daha önce tarif edildiği gibi Yoğunluk Gradyan Santrifüjü kullanılarak izole edildi¹⁶. 24 mL kandan izole edilen PBMC'ler için aşağıdaki protokol özetlenmiştir. Protokolün şematik bir gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

NOT: Kan hacmi, kullanılan M0 makrofajlarının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır.

24 mL kandan toplam 35.46 ± 9.1 milyon PBMC elde edildi, bu da 1.97 ± 0.46 milyon M0 makrofaj ile sonuçlandı (n = 5). Tüm reaktifler, sarf malzemeleri ve cihazlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Arabellekler Tablo 1'de listelenmiştir.

1. İnsan kan monositlerinin makrofajlara farklılaşması

1. İzole edilmiş PBMC'leri 15 mL önceden ısıtılmış monosit bağlanma ortamında yeniden süspanse edin ve bunları bir T75 hücre kültürü şişesine aktarın.
2. Yapışmayı sağlamak için hücreleri 37 ° C ve% 5 CO_2'de 90 dakika inkübe edin.
3. Süpernatanı atın ve hücreleri, yapışmayan veya gevşek bir şekilde yapışmış hücreleri çıkarmak için hafifçe eğilerek önceden ısıtılmış tam ortamla bir kez yıkayın.
   NOT: Bağlı hücreler, orijinal olarak şişeye eklenen toplam PBMC'lerin yaklaşık %10'unu oluşturan monositlerdir.
4. Yapışık hücrelere 10 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) içeren 15 mL tam ortam ekleyin ve farklılaşmayı teşvik etmek için 6 gün inkübe edin.
5. Besiyerini her 2 günde bir 10 ng/mL M-CSF içeren taze, tam besiyeri ile değiştirin.

2. MDM'lerin titanyum implant yüzeyinde yetiştirilmesi ve polarizasyonu

NOT: Farklılaşmanın 6. gününde, M0 makrofajları, tamamen polarize M1 veya M2 makrofajları elde etmek için 48 saat boyunca farklı uyaranlarla biyomateryal yüzeylere ekildi. İncelenen her yüzey için, M0, M1 ve M2 makrofajlarını tohumlamak için üç disk kullanıldı. Kontrol yüzeyleri olarak hücre kültürü ile muamele edilmiş plastik lameller kullanıldı.

1. Kültür ortamını T75 şişelerinden çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 10 mL PBS ile yıkayın.
2. Yapışık hücreleri, 10 mL önceden ısıtılmış hücre ayırma solüsyonu ile 30 dakika inkübe ederek ayırın.
3. Hücrelere hafifçe vurun ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri 10 mL PBS'de nazikçe kazıyarak ayırın.
4. Ayrılan hücreleri 50 mL'lik tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanı atın ve hücreleri 5 mL önceden ısıtılmış tam ortamda yeniden süspanse edin.
6. Hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için tripan mavisi boyama ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
7. Hücre sayısını 1 mL tam ortam başına 160.000 hücreye ayarlayarak hücre süspansiyonunu hazırlayın.
8. Biyomateryal diskleri ultrasonik olarak 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde temizleyin, ardından 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde sterilizasyon yapın.
9. Titanyum diskleri 1-2 saat kurutun, daha sonra işlenmemiş 24 oyuklu plakalara yerleştirin ve her oyuğa 1 mL hazırlanmış hücre süspansiyonu ekleyin.
10. M1 polarize makrofajlar elde etmek için, sırasıyla 50 ng / mL ve 10 ng / mL konsantrasyonunda IFN-γ ve LPS ekleyin. M2 polarizasyonu için, her biri 20 ng/mL'lik bir konsantrasyonda IL-4 ve IL-13 ekleyin. M0 hücrelerinin herhangi bir polarizasyon maddesi olmadan büyütüldüğünden emin olun. Polarizasyonu indüklemek için hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 48 saat daha inkübe edin.

3. ELISA kullanılarak polarize makrofajların karakterizasyonu

NOT: Polarizasyonun 2. gününde, karakterizasyon analizleri için numuneler hazırlanmıştır. TNF-ɑ sitokin ve CCL13 kemokin, sırasıyla M1 ve M2 polarize makrofajları karakterize etmek için ölçüldü. Salgılanan proteinlerin konsantrasyonu, karşılık gelen süpernatantta salgılanan proteinlerin toplam konsantrasyonuna normalize edildi.

1. Süpernatanı 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
2. Daha fazla deney için diskleri yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın. Amaç, işlenmemiş 24 oyuklu plakalarda ölü veya gevşek bir şekilde bağlanmış hücreleri ortadan kaldırmaktır.
   NOT: Herhangi bir analiz yapılmadan önce hücre canlılığı yüzeyler üzerinde doğrulanmalıdır. Hücrelerin canlılığı, canlı/ölü hücre canlılık testleri ile veya dolaylı olarak hücre proliferasyonu ve sitotoksisite testleri ile belirlenebilir.
3. Sitokinleri ve kemokinleri üretici tarafından sağlanan özel talimatlara göre ölçün. Sitokinleri hemen ölçün veya ileride ölçüm yapmak üzere numuneleri -80 °C'de saklayın.
   NOT: Her kit tipi için (ELISA kitinin hassasiyet ve tespit limitleri dikkate alınarak) uygun numune seyreltmesi belirlenmelidir. Bikinkoninik asit (BCA) testi için numuneler 1:5 oranında seyreltildi. TNF-ɑ için M1 numuneleri 1:10 oranında seyreltildi ve CCL13 için M2 numuneleri 1:12 oranında seyreltildi.
4. Salgılanan sitokinlerin/kemokinlerin konsantrasyonunu üretici talimatlarını izleyerek standart eğriyi kullanarak hesaplayın.
5. BCA protein tahlil Kitini kullanarak toplam protein miktarını ölçün.
6. Salgılanan proteinlerin konsantrasyonunu mg toplam proteine normalleştirin.

4. CLSM kullanılarak polarize makrofajların karakterizasyonu

NOT: Polarize makrofajlar, CD209 ve CCR7 hücre yüzey belirteçlerine karşı antikorlarla boyanarak daha da karakterize edildi. Çekirdekler DRAQ5 ile karşı boyandı. CD68 veya diğer belirteçler pan-makrofaj belirteçleri olarak kullanılabilir.

1. Hücreleri 800 μL PBS'de 2 kez yıkayın. Diskleri oda sıcaklığında (RT) 400 μL fiksasyon tamponunda 20 dakika inkübe edin.
2. Fiksasyon tamponunu çıkardıktan sonra, 400 μL PBS'de üç kez yıkayın. Numuneleri hemen boyayın veya 4 °C'de 1 mL saklama tamponunda saklayın.
   NOT: Bu fiksasyon ve saklama protokolü ile numuneler, fiksasyondan sonraki 1-6 hafta içinde başarıyla boyandı ve görüntülendi.
3. Bir sonraki adımdan önce, sakladıktan sonra diskleri 800 μL PBS ile iki kez yıkayın.
4. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için diskleri RT'de 30 dakika boyunca 400 μL bloke edici tampon ile inkübe edin.
5. Bloke edici tamponu atın ve diskleri 400 μL boyama tamponunda seyreltilmiş primer antikorlarla 1 saat RT'de inkübe edin.
   1. Bir numunede CCR7 ve CD209 ekspresyonunu incelemek için çift boyama kullanarak bir immünofloresan prosedürü gerçekleştirin. Bu amaçla, farklı türlerden (fare ve tavşan) elde edilen birincil antikorları aynı boyama adımında birleştirin.
      NOT: Minimum arka plana sahip güçlü bir sinyal elde etmek için antikor konsantrasyonunu optimize edin. CCR7 antikoru 10 μg/mL'lik bir son konsantrasyonda kullanıldı ve CD209 antikoru 1/400 seyreltildi.
6. Birincil antikorları çıkarın ve 3x'i 400 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
7. Boyama tamponunda seyreltilmiş florofor işaretli ikincil antikorları ekleyin ve karanlıkta RT'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: İkincil antikorların konsantrasyonu, minimum arka plan ile maksimum spesifik sinyaller elde etmek için optimize edilmelidir. Bu çalışmada boyama için 5 μg/mL konsantrasyonda sekonder antikorlar kullanılmıştır.
8. Süpernatanı çıkardıktan sonra, numuneleri her biri 3 dakika boyunca yıkama tamponunda üç kez yıkayın.
9. PBS'ye 10 μM DRAQ5 ekleyin ve RT'de ışıktan korunarak 15 dakika inkübe edin.
10. Süpernatanı çıkarın ve diskleri PBS'de bir kez yıkayın.
11. Kalan PBS'yi çıkarın ve 1 damla montaj ortamı ekleyin.
12. 5 dakika sonra kapak camlarını uygulayın ve numuneleri 1 saat kurumaya bırakın.
13. Numuneleri kuruttuktan sonra kenarlarını şeffaf oje ile kapatın ve görüntülemeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
14. Hücrelere genel bir bakış elde etmek için örnekleri 25x büyütme ile görüntüleyin. Yüzey işaretleyicilerinin yapısını ve lokalizasyonunu daha fazla belirlemek için 63x büyütmeli görüntüler elde edin.
15. ImageJ yazılımını kullanarak CCR7 ve CD209'un floresan yoğunluğunu ölçün.
    NOT: Görüntü alımı, bir argon lazer (488 nm), DPSS lazer (561 nm) ve HeNe lazer (633 nm) ile donatılmış bir CLSM sistemi kullanılarak bir fotoçoğaltıcı (PMT) ile gerçekleştirildi.

5. Polarize makrofajların qRT-PCR kullanılarak karakterizasyonu

NOT: RNA izolasyonu için, cDNA sentezi için yeterli RNA elde etmek amacıyla numune başına iki disk kullanıldı.

1. Diskleri 2x 800 μL PBS ile yıkayın.
2. İlk diske 350 μL lizis tamponu ekleyin ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek parçalayın.
3. Lizatı ikinci diske aktarın ve parçalama işlemini tekrarlayın.
4. Lizata 350 μL %70 etanol ekleyin ve homojen olana kadar yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Lizatı döndürme kolonuna aktarın ve RNA izolasyonu için üreticinin talimatlarını izleyin.
6. Bir nanodamla veya başka bir cihaz kullanarak RNA miktarını ölçün.
7. Farklı numuneler için RNA konsantrasyonlarını normalleştirin ve Birinci İplikli cDNA Sentezi için RT-PCR sistemini kullanarak üreticinin talimatlarına göre cDNA'yı sentezleyin.
8. Üreticinin protokolünü takip ederek 350 ng RNA kullanarak cDNA'yı sentezleyin ve qRT-PCR analizi yapılana kadar -20 °C'de saklayın.
   NOT: Burada, 20 μL'de 4 μL RT Karışımı (5x) kullanılarak cDNA'yı sentezlemek için 350 ng saflaştırılmış RNA kullanıldı.
9. 96 oyuklu plakalarda ve ayrı ayrı 15 μL reaksiyonlarda (1x Syber green ana karışımı, 0.2 μM ileri ve geri primerler ve 4.5 μL 1:10 seyreltilmiş cDNA) gerçek zamanlı bir PCR sisteminde qRT-PCR gerçekleştirin.
   NOT: PCR programı ısıtılmış bir kapakla (105 °C) başlar ve ardından üç adım gelir: 95 °C'de 3 dakika ilk denatürasyon, ardından 95 °C'de 15 saniye ve 40 döngü için 55 °C'de 30 saniye.
10. Çeşitli genlerin ekspresyon seviyelerini temizlik geni GAPDH'ye (veya β-aktin gibi diğer temizlik genlerine) normalleştirin.
11. Doku kültürü lameller üzerinde kültürlenen M0 hücrelerini referans alarak 2^−ΔΔCt yöntemini kullanarak bağıl gen ekspresyonunu hesaplayın. Tablo 2 , bu çalışmada kullanılan tüm primerleri listeler.

6. İstatistiksel analiz

1. Tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm verileri ortalama ± SEM olarak sunun. Tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm tahlilleri tekrarlayın (bu çalışmada tahliller beş kez tekrarlanmıştır). Normal dağılımlı veriler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları, tek yönlü bir varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in çoklu testini kullanarak değerlendirin.
2. Parametrik olmayan veri kümelerini analiz etmek için Friedman testini ve Dunn'ın çoklu karşılaştırma testini kullanın. Verileri analiz etmek için uygun veri analiz yazılımı kullanın ve istatistiksel anlamlılığı 0,05'ten küçük bir p değeri olarak tanımlayın.

Bu çalışmanın sonuçları, MDM'lerin titanyum yüzeylerde başarılı bir şekilde farklılaşmasını ve polarizasyonunu ve ardından M1 veya M2 polarize makrofajların karakterizasyonunu göstermektedir. İlk adımda, CLSM kullanarak polarize MDM'leri karakterize ettik. Ön çalışmalarımıza dayanarak, CD209 ve CCR7, M1'i M2 polarize MDM'lerden ayırt etmek için spesifik belirteçler olarak kullanıldı. Şekil 2A,B'de gösterildi?...

İmplante edilebilir materyallerin immünomodülatör özelliklerini anlamak için makrofaj davranışının kapsamlı bir şekilde anlaşılması esastır. Birkaç çalışma, in vitro^17,18,19,20 makrofaj polarizasyonunu karakterize etmek için heterojen belirteçler, çeşitli hücre modelleri ve protokoller bildirmiştir. Deneysel sonuçların tekr...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Diskler Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Almanya tarafından sağlandı. Yazarlar, Ağız Diş ve Çene Cerrahisi Anabilim Dalı'nın (Tuebingen Üniversite Hastanesi) desteğini kabul eder.