インプラント表面上のM1およびM2ヒト単球由来マクロファージの分極と特性評価

ここでは、 in vitroでのインプラント表面の免疫調節能力を評価するための詳細なプロトコルを提示し、現在のプロトコルの信頼性と再現性を向上させ、さらなる研究を促進することを目的としています。血中単球由来マクロファージを用いて分泌性サイトカインプロファイル、mRNA発現、細胞表面マーカーをモニターし、チタン上に培養されたマクロファージの分極を調べました。

免疫介在性の複雑な治癒プロセスである異物反応(FBR)は、インプラントを体内に統合する上で重要な役割を果たします。マクロファージは、免疫系とインプラント表面との相互作用の第一線として、炎症と再生のバランスを調節する上で双方向の役割を果たします。インプラント材料と免疫応答との間の反応を深く理解し、評価するためには、信頼性の高い in vitro の方法とプロトコールが極めて重要です。さまざまな in vitro モデルの中で、初代単球由来マクロファージ(MDM)は、マクロファージとインプラントの相互作用を調べるための優れたモデルです。私たちは、インプラント表面上のMDMのM1(古典的に活性化された)およびM2(代替的に活性化された)マクロファージへの分極を評価するための実験プロトコルを実装しました。健康なドナーから血液単球を単離し、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を用いてマクロファージに分化させた。分化したマクロファージをインプラント表面で培養し、M1およびM2サブタイプに分極しました。M1分極はインターフェロン(IFN)-γおよびリポ多糖(LPS)の存在下で達成され、M2分極はインターロイキン(IL)-4およびIL-13を含む媒体で行われました。分泌サイトカイン、細胞表面マーカー、発現遺伝子のパネルに基づくEnzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)、および定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)により、マクロファージの表現型を評価しました。抽出したRNAを相補的DNA(cDNA)に変換し、qRT-PCRを使用してM1およびM2マクロファージに関連するmRNAを定量しました。したがって、M1マクロファージは、CD209およびCCL13のレベルが高いM2マクロファージと比較して、炎症誘発性腫瘍壊死因子(TNF-α)サイトカインおよびCCR7表面マーカーの発現が高いことを特徴としています。その結果、CCR7およびCD209は、CLSMによる免疫染色および可視化により、M1およびM2マクロファージサブタイプの特異的かつ信頼性の高いマーカーとして同定されました。ELISAがM1細胞のTNF-ɑレベルの上昇とM2細胞のCCL13の増加を検出したことにより、さらなる確認が達成されました。提案されたマーカーと実験装置は、インプラントの免疫調節能力を評価するために効果的に使用できます。

埋め込み型生体材料は、さまざまなヒト疾患に対する従来のソリューションとなり、組織工学、薬物送達システム、インプラント^1,2などの生物医学研究において大きな役割を果たしています。人工股関節、ステント、メッシュ、心臓弁、歯科インプラントなど、構造や機能が異なるさまざまな材料から作られたインプラントは豊富に取り揃えられています。移植されると、組織とインプラントの接触は免疫応答を引き起こし、続いて解決、組織リモデリング、および恒常性が引き起こされます。これらのプロセスは、使用される生体材料の物理的、化学的、および生物活性特性の影響を受けます。これらの特性は、炎症誘発性および抗炎症反応、線維性カプセルの形成、組織分解、および治癒期^の強度とスペクトルに影響を与える可能性があります^3,4。治癒過程と長期的なインプラント統合をサポートおよび最適化するために、現在の研究の新たな側面の1つは、インプラント表面と免疫細胞との間の相互作用を調査し、仲介することです。

他の免疫細胞の中でも、全身に見られるマクロファージは、炎症や抗病原性防御、治癒過程、組織の恒常性の維持において重要な役割を果たしています^5,6。マクロファージは、その可塑性と局所的な組織微小環境刺激に基づいて、細胞代謝、細胞機能、およびサイトカイン分泌プロファイルに大きな違いを示す明確な機能表現型に分極することができます。古典的に活性化されたM1表現型は、IL-1β、IL-6、およびTNF-αなどの炎症誘発性サイトカインの分泌によって区別でき、外傷および外来生体材料に対する初期および慢性の炎症反応に関与しています。一方、IL-4やIL-13などのサイトカインをトリガーする活性化M2マクロファージは、炎症の解消や組織治癒の促進などの特徴的な特徴を持っています。M2分極マクロファージは、CD206などの細胞表面マーカーの発現と、IL-10やIL-4⁷などのサイトカインの産生によって同定できます。同様に、すでに分極されたマクロファージは、新しい微小環境で自分自身を再プログラムできます。

細胞と生体材料の相互作用に関する多くの研究は、埋め込み型生体材料に対する免疫学的応答のカスケードにおけるマクロファージの重要性、およびインプラント関連合併症の治癒に関与するプロセスの調整におけるマクロファージの重要性を示している^8,9,10。近年、生物医学工学は大きな進歩を遂げていますが、インプラントがマクロファージの振る舞いと分極をどのように調節するかを理解するためには、さらなる研究が必要です11,12,13。

細胞培養では、単球由来の末梢血単核細胞(PBMC)を接着性M0マクロファージに分化させ、続いてLPSとIFN-γまたはIL-4をそれぞれ使用してM1またはM2表現型への分極を誘導することができます。新しい生体材料試料を用いたin vitroインキュベーション後、M1およびM2マクロファージの異なる細胞表面受容体およびサイトカインプロファイルを利用して、生体材料の免疫調節能をin vitroで検出することが可能です^14,15。この研究は、さまざまなインプラント表面に応答したMDMの分極を調査するために使用できるin vitroプロトコルを開発することを目的としています。遺伝子発現解析、顕微鏡法、およびELISAを使用して、生体材料によって調節されたM1およびM2マクロファージの表現型マーカーと特異的サイトカインプロファイルを決定できます。したがって、マクロファージと生体材料表面との間の複雑な相互作用を解明し、マクロファージと生体材料の相互作用をよりよく理解するための貴重な情報を得ることができます。最後に、標準化されたin vitroプロトコルは、実験セットアップのばらつきを最小限に抑えることにより、実験結果の再現性、信頼性、および比較可能性を保証します。

ヒト末梢血は、テュービンゲン大学医学部の倫理委員会によって承認されたプロトコル(倫理承認:286/2021 BO)に従って、健康な献血者から採取されました。ヒトPBMCは、前述のように、密度勾配遠心分離法を用いて単離した¹⁶。以下のプロトコルは、24mLの血液から単離されたPBMCについて概説されています。プロトコルの概略図を 図1に示します。

注:血液量は、使用するM0マクロファージの数に応じて調整する必要があります。.

24mLの血液から合計35.46個±910万個のPBMCが得られ、1.97個±46万個のM0マクロファージが得られました(n=5)。すべての試薬、消耗品、およびデバイスは、 材料表に記載されています。バッファを 表 1 に示します。

1. ヒトの血液単球からマクロファージへの分化

1. 単離したPBMCを予熱した単球付着培地15 mLに再懸濁し、1つのT75細胞培養フラスコに移します。
2. 細胞を37°Cおよび5%CO₂ で90分間インキュベートし、接着可能にします。
3. 上清を捨て、あらかじめ温めた完全な培地で細胞を一度洗浄し、穏やかに傾けて、非接着性または緩く付着した細胞を取り除きます。
   注:付着した細胞は単球であり、フラスコに最初に追加されたPBMC全体の約10%を占めています。
4. 10 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を含む15 mLの完全培地を接着細胞に加え、6日間インキュベートして分化を促進します。
5. 培地は、2日ごとに10 ng/mlのM-CSFを含む新鮮で完全な培地と交換してください。

2. チタンインプラント表面におけるMDMの培養と分極

注:分化の6日目に、M0マクロファージを生体材料表面に異なる刺激で48時間播種し、完全に分極したM1またはM2マクロファージを得ました。調査した各表面について、3つのディスクを使用してM0、M1、およびM2マクロファージを播種しました。細胞培養処理されたプラスチック製のカバースリップをコントロールサーフェスとして使用しました。

1. T75フラスコから培地を取り出し、10 mLのPBSで細胞を5分間洗浄します。
2. 接着細胞を10 mLの温めた細胞剥離溶液と30分間インキュベートして、接着細胞を分離します。
3. 細胞を軽くたたいて、50 mLチューブに移します。残りの細胞を10mLのPBSで優しくこすり落とします。
4. 分離した細胞を50 mLチューブに移し、300 x g で10分間遠心分離します。
5. 上清を捨て、細胞を予熱した完全培地5 mLに再懸濁します。
6. トリパンブルー染色と血球計算盤を使用して細胞をカウントし、細胞数と生存率を決定します。
7. 細胞数を完全培地1 mLあたり160,000細胞に調整して、細胞懸濁液を調製します。
8. 生体材料ディスクを70%エタノールで5分間超音波で洗浄し、続いて70%エタノールで30分間滅菌します。
9. チタンディスクを1〜2時間乾燥させた後、未処理の24ウェルプレートに入れ、調製した細胞懸濁液1mLを各ウェルに加えます。
10. M1分極マクロファージを得るには、IFN-γとLPSをそれぞれ50 ng/mLと10 ng/mLの濃度で添加します。M2分極には、IL-4とIL-13をそれぞれ20 ng/mLの濃度で添加します。M0細胞が分極剤なしで増殖していることを確認してください。細胞を37°Cおよび5%CO₂ でさらに48時間インキュベートして、分極を誘導します。

3. ELISAを用いた分極マクロファージのキャラクタリゼーション

注:偏光の2日目に、サンプルは特性評価分析のために調製されました。TNF-ɑサイトカインとCCL13ケモカインを測定して、それぞれM1とM2の分極マクロファージを特徴付けました。分泌されたタンパク質の濃度は、対応する上清中の分泌されたタンパク質の全濃度に正規化されました。

1. 上清を1.5 mLチューブに集め、300 x g で5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。
2. ディスクを新しい24ウェルプレートに移し、さらなる実験を行います。目的は、未処理の24ウェルプレートで死んだ細胞や緩く付着した細胞を排除することです。
   注:細胞の生存率は、分析を行う前に表面上で検証する必要があります。細胞の生存率は、生細胞/死細胞生存率アッセイによって、または細胞増殖および細胞毒性試験を通じて間接的に決定できます。
3. サイトカインとケモカインは、製造元が提供する特定の指示に従って測定します。サイトカインをすぐに測定するか、将来の測定のためにサンプルを-80°Cで保存します。
   注:各タイプのキットについて(ELISAキットの感度と検出限界を考慮)、適切なサンプル希釈を決定する必要があります。ビシンコニン酸(BCA)アッセイでは、サンプルを1:5に希釈しました。TNF-ɑのM1サンプルは1:10に希釈し、CCL13のM2サンプルは1:12に希釈しました。
4. 分泌されたサイトカイン/ケモカインの濃度を、製造元の指示に従って標準曲線を使用して計算します。
5. BCAタンパク質アッセイキットを使用して総タンパク質量を測定します。
6. 分泌されたタンパク質の濃度を総タンパク質のmgに正規化します。.

4. CLSMを用いた分極マクロファージのキャラクタリゼーション

注:分極されたマクロファージは、CD209およびCCR7細胞表面マーカーに対する抗体で染色することにより、さらに特徴付けられました。核はDRAQ5で対比染色しました。CD68または他のマーカーは、汎マクロファージマーカーとして用いることができる。

1. 細胞を800μLのPBSで2回洗浄します。ディスクを室温(RT)で20分間、400 μLの固定バッファーでインキュベートします。
2. 固定バッファーを取り外した後、400μLのPBSで3回洗浄します。サンプルをすぐに染色するか、1 mLの保存バッファーに4°Cで保存してください。
   注:この固定および保存プロトコルにより、サンプルは固定後1〜6週間以内に正常に染色および画像化されました。
3. 次のステップに進む前に、保存後、ディスクを800μLのPBSで2回洗浄します。
4. ディスクを400 μLのブロッキングバッファーと室温で30分間インキュベートし、非特異的な結合部位をブロックします。
5. ブロッキングバッファーを廃棄し、400 μLの染色バッファーで希釈した一次抗体と室温で1時間ディスクをインキュベートします。
   1. 二重染色を用いた免疫蛍光染色法を実施し、1つのサンプル中のCCR7とCD209の発現を調べます。この目的のために、異なる動物種(マウスとウサギ)から産生した一次抗体を同じ染色ステップで組み合わせます。
      注:最小限のバックグラウンドで強力なシグナルを得るには、抗体濃度を最適化してください。CCR7抗体を最終濃度10 μg/mLで使用し、CD209抗体を1/400に希釈しました。
6. 一次抗体を取り出し、400 μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。
7. 染色バッファーで希釈した蛍光色素標識二次抗体を添加し、暗所でRTで1時間インキュベートします。
   注:二次抗体の濃度は、最小限のバックグラウンドで最大の特異的シグナルが得られるように最適化する必要があります。この研究では、二次抗体を5 μg/mLの濃度で染色に使用しました。
8. 上清を取り除いた後、サンプルを洗浄バッファーで3回ずつ3分間洗浄します。
9. 10 μM DRAQ5をPBSに添加し、光から保護された室温で15分間インキュベートします。
10. 上清を取り除き、ディスクをPBSで一度洗います。
11. 残りのPBSを取り出し、封入剤を1滴追加します。
12. 5分後、カバーグラスを塗布し、サンプルを1時間乾燥させます。
13. サンプルを乾燥させた後、透明なマニキュアで端を密封し、イメージングするまで暗所で4°Cで保存します。
14. 細胞の概要を把握するには、25倍の倍率でサンプルをイメージングします。表面マーカーの構造と局在をさらに決定するには、63倍の倍率で画像を取得します。
15. ImageJソフトウェアを使用して、CCR7およびCD209の蛍光強度を定量化します。
    注:画像取得は、アルゴンレーザー(488 nm)、DPSSレーザー(561 nm)、およびHeNeレーザー(633 nm)を搭載したCLSMシステムを使用して、光電子増倍管(PMT)で行いました。

5. qRT-PCR法による分極マクロファージのキャラクタリゼーション

注:RNA単離については、cDNA合成に十分なRNAを得るために、サンプルあたり2枚のディスクを使用しました。

1. ディスクを800μLのPBSで2回洗浄します。
2. 350 μLの溶解バッファーを最初のディスクに加え、ピペッティングで上下させて細胞を溶解します。
3. ライセートを2枚目のディスクに移し、ライシングプロセスを繰り返します。
4. 350 μLの70%エタノールをライセートに加え、均一になるまで上下にピペットで動かします。
5. ライセートをスピンカラムに移し、RNA単離について製造元の指示に従ってください。
6. ナノドロップまたは他のデバイスを使用してRNA量を定量します。
7. さまざまなサンプルのRNA濃度を正規化し、ファーストストランドcDNA合成用のRT-PCRシステムを使用して、製造元の指示に従ってcDNAを合成します。
8. メーカーのプロトコールに従って350 ngのRNAを使用してcDNAを合成し、qRT-PCR分析が実行されるまで-20°Cで保存します。
   注:ここでは、350 ngの精製RNAを使用して、20 μL中の4 μLのRT Mix(5x)を使用してcDNAを合成しました。
9. 96ウェルプレートおよび個々の15 μL反応(1x Syber greenマスターミックス、0.2 μMのフォワードおよびリバースプライマー、および4.5 μLの1:10希釈cDNA)のリアルタイムPCRシステムでqRT-PCRを実施します。
   注:PCRプログラムは、加熱された蓋(105°C)から始まり、その後、95°Cで3分間の初期変性、続いて95°Cで15秒、55°Cで30秒で40サイクルの3つのステップが続きます。
10. さまざまな遺伝子の発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDH(またはβ-アクチンなどの他のハウスキーピング遺伝子)に正規化します。
11. 組織培養カバースリップで培養したM0細胞を基準として、2^−ΔΔCt 法を用いて相対的な遺伝子発現を計算します。 表2 に、この試験で使用したすべてのプライマーを示します。

6. 統計分析

1. すべてのデータをSEM±平均値として提示し、再現性を確保するためにすべてのアッセイを繰り返します(この研究では、アッセイを5回繰り返しました)。一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの多重検定を使用して、正規分布データ間の統計的に有意な差を評価します。
2. フリードマン検定とダンの多重比較検定を使用して、ノンパラメトリックデータセットを分析します。適切なデータ分析ソフトウェアを使用してデータを分析し、統計的有意性を0.05未満のp値として定義します。

この研究の結果は、チタン表面上のMDMの分化と分極に成功し、続いてM1またはM2分極マクロファージの特性評価が行われたことを示しています。最初のステップでは、CLSMを使用して分極MDMを特徴付けました。私たちの予備研究に基づいて、CD209とCCR7は、M1とM2分極MDMを区別するための特異的マーカーとして使用されました。 図2A、Bに...

マクロファージの挙動を完全に理解することは、埋め込み型材料の免疫調節特性を理解するために不可欠です。いくつかの研究で、インビトロ^17,18,19,20でマクロファージの分極を特徴付けるための不均一なマーカー、さまざまな細胞モデル、およびプロトコルが報告されています。<...

著者は何も開示していません。

ディスクは、ドイツのBad-Neuenahr-AhrweilerにあるMedentis Medicalから提供されました。著者らは、口腔顎顔面外科(テュービンゲン大学病院)からの支援に感謝しています。