Поляризация и характеризация макрофагов, полученных из моноцитов человека M1 и M2, на поверхностях имплантатов

В данной статье мы представляем подробный протокол оценки иммуномодулирующего потенциала поверхностей имплантатов in vitro, направленный на повышение надежности и воспроизводимости существующих протоколов и содействие дальнейшим исследованиям. Профили секреторных цитокинов, экспрессия мРНК и маркеры клеточной поверхности контролировались с использованием макрофагов, полученных из моноцитов крови, для изучения поляризации макрофагов, культивируемых на титане.

Реакция инородного тела (FBR), иммуноопосредованный сложный процесс заживления, играет решающую роль в интеграции имплантатов в организм. Макрофаги, являясь первой линией взаимодействия иммунной системы с поверхностями имплантатов, играют двунаправленную роль в модуляции баланса воспаления и регенерации. Для глубокого понимания и оценки реакций между материалами имплантатов и иммунными реакциями решающее значение имеют надежные методы и протоколы in vitro . Среди различных моделей in vitro первичные моноцитарные макрофаги (МДМ) представляют собой отличную модель для исследования взаимодействий макрофагов и имплантатов. Мы реализовали экспериментальный протокол для оценки поляризации МДМ на макрофаги М1 (классически активируемые) и М2 (альтернативно активируемые) на поверхностях имплантатов. Мы выделили моноциты крови от здоровых доноров и дифференцировали их в макрофаги с помощью макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF). Дифференцированные макрофаги культивировали на поверхностях имплантатов и поляризовали на подтипы M1 и M2. Поляризация М1 достигалась в присутствии интерферона (ИФН)-γ и липополисахарида (ЛПС), в то время как поляризация М2 проводилась в среде, содержащей интерлейкин (ИЛ)-4 и ИЛ-13. Мы оценивали фенотипы макрофагов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) на основе панелей секретируемых цитокинов, маркеров клеточной поверхности и экспрессированных генов. Извлеченную РНК трансформировали в комплементарную ДНК (кДНК), а для количественного определения мРНК, относящихся к макрофагам М1 и М2, использовали кОТ-ПЦР. Соответственно, макрофаги M1 характеризовались более высокой экспрессией цитокина провоспалительного фактора некроза опухоли (TNF-α) и поверхностного маркера CCR7 по сравнению с макрофагами M2, которые демонстрировали более высокие уровни CD209 и CCL13. Следовательно, CCR7 и CD209 были идентифицированы как специфические и надежные маркеры подтипов макрофагов M1 и M2 путем иммуноокрашивания и визуализации с помощью CLSM. Дальнейшее подтверждение было получено с помощью ИФА, обнаруживающего повышенный уровень TNF-ɑ в M1 и повышенный CCL13 в клетках M2. Предложенные маркеры и экспериментальная установка могут быть эффективно использованы для оценки иммуномодулирующего потенциала имплантатов.

Имплантируемые биоматериалы стали традиционным решением для лечения различных заболеваний человека и играют большую роль в биомедицинских исследованиях, включая тканевую инженерию, системы доставки лекарств и^{имплантаты.} Существует широкий ассортимент имплантатов, изготовленных из различных материалов с различной структурой и функциональностью, таких как протезы тазобедренного сустава, стенты, сетки, сердечные клапаны или зубные имплантаты. После имплантации контакт ткани с имплантатом вызывает иммунный ответ, за которым следует разрешение, ремоделирование тканей и гомеостаз. На эти процессы влияют физические, химические и биологически активные характеристики используемых биоматериалов. Эти характеристики могут влиять на интенсивность и спектр про- и противовоспалительных реакций, образование фиброзных капсул, деградацию тканей и фазу заживления ^3,4. Для поддержки и оптимизации процесса заживления и долгосрочной интеграции имплантатов одним из новых аспектов современных исследований является изучение и посредничество взаимодействия между поверхностями имплантатов и иммунными клетками.

Среди других иммунных клеток макрофаги, которые обнаруживаются по всему организму, являются ключевыми игроками в воспалении и антипатогенной защите, а также в процессах заживления и поддержании гомеостаза тканей ^5,6. Основываясь на своей пластичности и местных стимулах микроокружения тканей, макрофаги способны поляризоваться в различные функциональные фенотипы, которые демонстрируют большие различия в клеточном метаболизме, клеточных функциях и профилях секреции цитокинов. Классически активированный фенотип М1 можно отличить по секреции провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, IL-6 и TNF-α, и он участвует в начальной и хронической воспалительной реакции на травму и чужеродные биоматериалы. Напротив, активированные М2-макрофаги, которые запускаются цитокинами, такими как IL-4 и IL-13, имеют характерные особенности, такие как разрешение воспаления и содействие заживлению тканей. M2-поляризованные макрофаги могут быть идентифицированы по экспрессии маркеров клеточной поверхности, таких как CD206, и продукции цитокинов, таких как IL-10 и IL-4⁷. Точно так же макрофаги, которые уже были поляризованы, могут перепрограммировать себя в новом микроокружении.

Многие исследования клеточных взаимодействий с биоматериалом показали важность макрофагов в каскаде иммунологических реакций на имплантируемые биоматериалы и в организации процессов, участвующих в заживлении осложнений, связанных с имплантатами ^8,9,10. Несмотря на то, что биомедицинская инженерия достигла значительного прогресса в последние годы, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как имплантаты модулируют поведение макрофагов и поляризацию 11,12,13.

В клеточной культуре мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные из моноцитов, могут быть дифференцированы в адгезивные макрофаги M0 с последующей индуцированной поляризацией в сторону фенотипов M1 или M2 с использованием ЛПС и ИФН-γ или IL-4 соответственно. После инкубации in vitro с новыми образцами биоматериала можно использовать различные рецепторы клеточной поверхности и цитокиновые профили макрофагов М1 и М2 для выявления иммуномодулирующего потенциала биоматериалов in vitro ^14,15. Это исследование было направлено на разработку протокола in vitro, который может быть использован для изучения поляризации МДМ в ответ на различные поверхности имплантатов. Анализ экспрессии генов, методы микроскопии и ИФА могут быть использованы для определения фенотипических маркеров и специфических цитокиновых профилей макрофагов М1 и М2, модулированных биоматериалом. Следовательно, можно прояснить сложные взаимодействия между макрофагами и поверхностями биоматериала, а также получить ценную информацию для лучшего понимания взаимодействий макрофагов и биоматериала. Наконец, стандартизированный протокол in vitro обеспечивает воспроизводимость, надежность и сопоставимость экспериментальных результатов за счет минимизации вариабельности в экспериментальной установке.

Периферическая кровь человека была получена от здоровых доноров крови в соответствии с протоколом, утвержденным Этическим комитетом медицинского факультета Тюбингенского университета (этическое одобрение: 286/2021 BO). Человеческие PBMC выделяли с помощью центрифугирования с градиентом плотности, как описано ранее¹⁶. Ниже приведен протокол для ПМЦ, выделенных из 24 мл крови. Схематическое изображение протокола показано на рисунке 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Объем крови следует корректировать в зависимости от количества используемых макрофагов М0.

Всего из 24 мл крови было получено 35,46 ± 9,1 млн ПБМК, в результате чего получено 1,97 ± 0,46 млн М0 макрофагов (n = 5). Все реагенты, расходные материалы и устройства перечислены в Таблице материалов. Буферы перечислены в таблице 1.

1. Дифференцировка моноцитов крови человека к макрофагам

1. Ресуспендируйте выделенные PBMC в 15 мл предварительно подогретой среды для присоединения моноцитов и перенесите их в одну колбу для клеточной культуры T75.
2. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 в течение 90 минут, чтобы обеспечить адгезию.
3. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки предварительно подогретой готовой средой с легким наклоном, чтобы удалить неадгезивные или слабо прилипшие клетки.
   Примечание: Прикрепленные клетки представляют собой моноциты, которые составляют около 10% от общего количества PBMC, первоначально добавленных в колбу.
4. Добавьте 15 мл готовой среды, содержащей 10 нг/мл макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), к адгезивным клеткам и инкубируйте в течение 6 дней для стимуляции дифференцировки.
5. Заменяйте среду на свежую, полноценную среду, содержащую 10 нг/мл M-CSF, каждые 2 дня.

2. Культивирование и поляризация МДМ на поверхности титанового имплантата

Примечание: На 6-е сутки дифференцировки макрофаги M0 засеивали на поверхности биоматериала различными стимулами в течение 48 ч для получения полностью поляризованных макрофагов M1 или M2. Для каждой исследованной поверхности использовали три диска для посева макрофагов M0, M1 и M2. В качестве контрольных поверхностей использовались обработанные клеточными культурами пластиковые покровные стекла.

1. Извлеките питательную среду из колб Т75 и промойте клетки 10 мл PBS в течение 5 минут.
2. Отсоедините адгезивные клетки, инкубируя их с 10 мл предварительно подогретого раствора для отсоединения клеток в течение 30 минут.
3. Легкими постукивающими движениями постучите по клеткам и переложите их в пробирку объемом 50 мл. Отделите оставшиеся клетки, аккуратно соскоблив их в 10 мл PBS.
4. Перенесите отделенные клетки в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте их при давлении 300 x g в течение 10 минут.
5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 5 мл предварительно подогретой полной среды.
6. Подсчитайте клетки с помощью окрашивания трипановым синим цветом и гемоцитометра, чтобы определить количество клеток и жизнеспособность.
7. Приготовьте клеточную суспензию, доведя количество клеток до 160 000 клеток на 1 мл готовой среды.
8. Очистите диски биоматериала ультразвуком в 70% этаноле в течение 5 минут, а затем стерилизуйте в 70% этаноле в течение 30 минут.
9. Титановые диски просушить в течение 1-2 ч, затем поместить их в необработанные 24-луночные планшеты и добавить в каждую лунку по 1 мл приготовленной клеточной суспензии.
10. Для получения М1 поляризованных макрофагов добавляют ИФН-γ и ЛПС в концентрации 50 нг/мл и 10 нг/мл соответственно. Для поляризации М2 добавьте ИЛ-4 и ИЛ-13 в концентрации 20 нг/мл каждый. Убедитесь, что клетки M0 выращены без каких-либо поляризационных агентов. Инкубируйте клетки еще 48 ч при 37 °C и 5%_CO2 , чтобы вызвать поляризацию.

3. Характеристика поляризованных макрофагов с помощью ИФА

ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день поляризации образцы были подготовлены для характеризационного анализа. Цитокин TNF-ɑ и хемокин CCL13 были измерены для характеристики поляризованных макрофагов M1 и M2 соответственно. Концентрацию секретируемых белков нормализовали до общей концентрации секретируемых белков в соответствующей надосадочной жидкости.

1. Соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
2. Перенесите диски на новую 24-луночную пластину для дальнейших экспериментов. Цель состоит в том, чтобы устранить мертвые или слабо прикрепленные клетки в необработанных 24-луночных планшетах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна быть проверена на поверхностях перед проведением любого анализа. Жизнеспособность клеток может быть определена с помощью анализов жизнеспособности живых/мертвых клеток или косвенно с помощью тестов на пролиферацию клеток и цитотоксичность.
3. Измеряйте цитокины и хемокины в соответствии с конкретными инструкциями, предоставленными производителем. Измерьте цитокины либо сразу, либо сохраните образцы при температуре -80 °C для будущих измерений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого типа набора (с учетом чувствительности и пределов обнаружения набора ELISA) следует определить соответствующее разведение пробы. Для анализа бицинхониновой кислоты (БЦА) образцы разбавляли в соотношении 1:5. Образцы M1 для TNF-ɑ были разбавлены в соотношении 1:10, а образцы M2 для CCL13 были разбавлены в соотношении 1:12.
4. Рассчитайте концентрацию секретируемых цитокинов/хемокинов с помощью стандартной кривой, следуя инструкциям производителя.
5. Измерьте общее количество белка с помощью набора для анализа белка BCA.
6. Нормализуют концентрацию секретируемых белков до мг общего белка.

4. Характеристика поляризованных макрофагов с помощью CLSM

Примечание: Поляризованные макрофаги дополнительно характеризовали путем окрашивания их антителами к маркерам клеточной поверхности CD209 и CCR7. Ядра окрашивали с помощью DRAQ5. CD68 или другие маркеры могут быть использованы в качестве панмакрофагальных маркеров.

1. Промойте ячейки 2 раза в 800 мкл PBS. Инкубируйте диски в течение 20 минут при комнатной температуре (RT) в 400 мкл фиксирующего буфера.
2. После снятия фиксирующего буфера промойте три раза в 400 мкл PBS. Немедленно окрасьте образцы или храните при температуре 4 °C в 1 мл буфера для хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого протокола фиксации и хранения образцы были успешно окрашены и визуализированы в течение 1-6 недель после фиксации.
3. Перед следующим этапом дважды промойте диски 800 мкл PBS после хранения.
4. Инкубируйте диски с 400 мкл блокирующего буфера в течение 30 минут при РТ для блокировки неспецифических сайтов связывания.
5. Выбросьте блокирующий буфер и инкубируйте диски при ОТ в течение 1 ч с первичными антителами, разведенными в 400 мкл окрашивающего буфера.
   1. Проведите процедуру иммунофлюоресценции с использованием двойного окрашивания для изучения экспрессии CCR7 и CD209 в одном образце. Для этого объедините первичные антитела, полученные от разных видов (мышей и кроликов) на одной стадии окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить сильный сигнал с минимальным фоном, оптимизируйте концентрацию антител. Антитело CCR7 использовали в конечной концентрации 10 мкг/мл, а антитело CD209 разбавляли в 1/400.
6. Удалите первичные антитела и промойте 3 раза 400 мкл буфера для промывки.
7. Добавьте меченные флуорофорами вторичные антитела, разведенные в окрашивающем буфере, и инкубируйте в течение 1 ч при ЛТ в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация вторичных антител должна быть оптимизирована для получения максимальных специфических сигналов с минимальным фоном. В данном исследовании для окрашивания использовали вторичные антитела в концентрации 5 мкг/мл.
8. После удаления надосадочной жидкости промойте образцы три раза в буфере для промывки по 3 мин каждый.
9. Добавьте 10 μM DRAQ5 в PBS и инкубируйте в течение 15 минут при RT в защищенном от света месте.
10. Удалите надосадочную жидкость и промойте диски один раз в PBS.
11. Удалите оставшуюся PBS и добавьте 1 каплю монтажной среды.
12. Через 5 минут наденьте покровные стекла и дайте образцам высохнуть в течение 1 часа.
13. После высыхания образцов заклейте края прозрачным лаком для ногтей и храните их при температуре 4 °C в темноте до создания образа.
14. Чтобы получить обзор клеток, визуализируйте образцы с 25-кратным увеличением. Для дальнейшего определения структуры и локализации поверхностных маркеров получите изображения с 63-кратным увеличением.
15. Количественно оцените интенсивность флуоресценции CCR7 и CD209 с помощью программного обеспечения ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображения было выполнено с помощью фотоумножителя (ФЭУ) с использованием системы CLSM, которая была оснащена аргоновым лазером (488 нм), лазером DPSS (561 нм) и гелий-неоновым лазером (633 нм).

5. Характеристика поляризованных макрофагов с помощью qRT-PCR

Примечание: Для выделения РНК использовали два диска на образец, чтобы получить достаточное количество РНК для синтеза кДНК.

1. Промойте диски 2 раза 800 мкл PBS.
2. Добавьте 350 мкл буфера для лизиса в первый диск и лизируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз.
3. Перенесите лизат на второй диск и повторите процесс лизирования.
4. Добавьте в лизат 350 μл 70% этанола и пипеткой вверх и вниз до однородности.
5. Перенесите лизат в спиновую колонку и следуйте инструкциям производителя по выделению РНК.
6. Количественно определите количество РНК с помощью нанокапли или другого устройства.
7. Нормализуйте концентрации РНК для различных образцов и синтезируйте кДНК в соответствии с инструкциями производителя с помощью системы ОТ-ПЦР для синтеза кДНК первой цепи.
8. Синтезируйте кДНК с использованием 350 нг РНК в соответствии с протоколом производителя и храните ее при температуре -20 °C до проведения анализа qRT-PCR.
   Примечание: Здесь для синтеза кДНК использовали 350 нг очищенной РНК с использованием 4 мкл RT Mix (5x) в 20 мкл.
9. Проведите qRT-PCR на системе ПЦР в реальном времени в 96-луночных планшетах и отдельных реакциях объемом 15 мкл (1x Syber green master mix, 0,2 мкМ прямых и обратных праймеров и 4,5 мкл 1:10 разбавленной кДНК).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программа ПЦР начинается с нагрева крышки (105 °C), за которой следуют три этапа: первоначальная денатурация при 95 °C в течение 3 минут, затем 15 с при 95 °C и 30 с при 55 °C в течение 40 циклов.
10. Нормализуйте уровни экспрессии различных генов хозяйственного гена GAPDH (или других хозяйственных генов, таких как β-актин).
11. Рассчитайте относительную экспрессию генов с помощью метода 2^−ΔΔCt , взяв за образец клетки M0, культивируемые на покровных стеклах для тканевых культур. В таблице 2 перечислены все праймеры, использованные в данном исследовании.

6. Статистический анализ

1. Представьте все данные в виде среднего значения ± SEM. Повторите все анализы (в этом исследовании анализы повторялись пять раз) для обеспечения воспроизводимости. Оцените статистически значимые различия между нормально распределенными данными с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим множественным тестом Тьюки.
2. Используйте тест Фридмана и тест множественного сравнения Данна для анализа непараметрических наборов данных. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных для анализа данных и определите статистическую значимость как p-значение менее 0,05.

Результаты данного исследования демонстрируют успешную дифференцировку и поляризацию МДМ на титановых поверхностях с последующей характеризацией поляризованных макрофагов М1 или М2. На первом этапе мы охарактеризовали поляризованные МДМ с помощью CLSM. Основываясь ?...

Глубокое понимание поведения макрофагов имеет важное значение для понимания иммуномодулирующих свойств имплантируемых материалов. В нескольких исследованиях сообщалось о гетерогенных маркерах, различных моделях клеток и протоколах для характеристики поляризаци?...

Авторам нечего раскрывать.

Диски были любезно предоставлены компанией Medentis Medical, Бад-Нойенар-Арвайлер, Германия. Авторы выражают признательность за поддержку со стороны отделения челюстно-лицевой хирургии (университетская клиника Тюбингена).