Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu makale, bağlı optogenetik veya fiber fotometri deneyleri için minimum modifikasyonlarla standart kemirgen kafeslerine uygulanabilecek alternatif bir kapak ve kafes modifikasyonu ile birlikte otomatik bir besleme sistemi için tasarım, montaj ve protokolü detaylandırmaktadır. Yemleme sistemi, zamanlanmış yemleme ve/veya kalori kısıtlaması için uygun maliyetli bir araç sunar.
Aralıklı oruç ve zamanlanmış kalori kısıtlamasının vücut ağırlığı düzenlemesi ve yaşlanma sonuçları üzerindeki etkisini çevreleyen araştırmalar hem toplumda hem de laboratuvarda trend olmaktadır. Laboratuvarda zaman kısıtlı besleme ve/veya kalori kısıtlamasını incelemek için, tahsis edilen miktarlarda yiyecek planlanan zaman aralıklarında dağıtılır. Kemirgenlerin programlı beslenmesi için mevcut teknoloji, kapılı gıda giriş portlarına sahip özel kafesleri, zaman kilitli dijital hazneleri veya manuel gıda dağıtımını içerir. Bu tür deneyler için özel ekipman maliyetli olabilir ve manuel besleme genellikle araştırmacıların gece geç saatlerde / sabahın erken saatlerinde zaman noktaları için gelmesini gerektirir ve bu da uzun süreli çalışmaları engeller. Burada açıklanan otomatik yemleme sistemi, standart kemirgen kafeslerinde minimum değişiklikle uygulanabilen, zamanlanmış besleme ve/veya kalori kısıtlaması için uygun maliyetli bir araç sağlar. Protokol, standart bir mikroizolatör kafes kapağına (fare, hamster, sıçan veya kobay kafes kapakları) takılmış ve hayvanın ev kafesinde programlanan zaman aralıklarında istenen yiyecek tahsislerini uygulayabilen, kullanıma hazır bir otomatik besleyici kullanır. Tasarımımız, çeşitli besleyicileri veya kafes boyutlarındaki küçük değişiklikleri kabul edecek şekilde değiştirilebilir. Bağlı optogenetik veya fiber fotometri deneyleri için alternatif bir kapak ve kafes modifikasyonu ile birlikte besleme sistemi için tasarım, montaj ve protokol sağlıyoruz.
Aralıklı oruç, metabolik ve yaşlanma araştırmalarının önemli bir alanıdır. Beslenme ve sirkadiyen ritmin uygun şekilde hizalanması, diyetin vücut ağırlığı üzerindeki etkisini değiştirebilir 1,2,3,4. Ayrıca, uzun süreli aralıklı oruç, uzun ömürlülüğün artması ve yaşa bağlı bozuklukların iyileşmesi ile ilişkilidir 5,6,7,8. Uzun süreli oruç protokollerini (>20 gün) uygulayan araştırma çalışmaları tipik olarak özel ekipman gerektirir. Planlanmış besleme protokolleri için yiyecekleri manuel olarak teslim etmek mümkün olsa da, bu, bir araştırmacının uzun bir süre boyunca çok sayıda mesai dışı zaman noktasında bulunmasını gerektirebilir. Örneğin, 4 saat arayla üç besleme saati, saat 8:00, 12:00 ve 04:00'te manuel teslimat gerektirir; Muhtemelen birkaç günden fazla sürmesi gereken bir uyumluluk sorunu.
Laboratuvar kemirgenleri için manuel gıda dağıtımına alternatifler şunlardır: 1) gıdaya otomatik kapı erişimi olan özel kafesler veya 2) FED39 gibi gıdaya otomatik ve programlanmış erişim sağlayan dijital hazne sistemleri. Kapılı gıda erişimi olan kafes sistemleri maliyetlidir ve bazıları uzun süreli çalışmalar için uygun bir ev-kafes ortamı sağlamaz. Örneğin, geleneksel edimsel şartlandırma kutuları, otomatik gıda dağıtımı yeteneğine sahiptir, ancak uzun süreli barınma için elverişli olmayan tel ızgaralı bir zemine sahiptir. Research Diets'in BioDAQ sistemi, kapılı harici bağlantı noktaları aracılığıyla yiyecek ve su sağlar. Programlanabilir otomatik kapılar, uzun vadeli planlı besleme veya içme çalışmalarına izin verir, ancak sistem maliyetli bir yatırımdır. Mekanize hazne sistemleri, otomatik programlı besleme protokolleri için başka bir araçtır 9,10. Bahsedilen iki mekanize hazne, ev kafesi yaşam alanını azaltma uyarısı ile birlikte gelir. Yiyecek kısıtlaması olan aç hayvanlar, besleme cihazlarını çiğneyebilir ve/veya kafes artıkları, uzun süreli çalışmalar için hazne mekaniğine müdahale edebilir. Son olarak, Takahashi araştırma grubu tarafından Phenome Technology ile birlikte geliştirilen mekanize bir hazne, uzun vadeli planlı besleme çalışmaları için özel olarak tasarlanmıştır3. Bu sistemde, mekanize bir hazne, yiyecek sağlayan bir oluk ile standart bir kafesin tel rafının üzerine yerleştirilmiştir. Bununla birlikte, Phenome sistemi, bir yama kablosuna bağlı hayvanlar için esneklik sağlamaz (optogenetik/fiber fotometri deneyleri) ve burada açıklanan otomatik besleme aparatına kıyasla nispeten pahalıdır.
Planlı besleme protokollerinde hakim olan zorluklara yanıt olarak, uygun maliyetli bir çözüm öneriyoruz. Otomatik sistemimiz, önceden belirlenmiş aralıklarla hassas gıda teslimatını kolaylaştırır. Piyasada bulunan otomatik balık besleyici ile birlikte 3D baskılı parçaların bir kombinasyonuyla, mikroizolatör üstleri kullanan bağımsız kemirgen kafeslerine takılabilen bir kendin yap (DIY) harici besleme sistemi tasarlıyoruz. Burada açıklanan besleme sistemi ve parçaları, aşağıdaki kemirgen kafeslerinden herhangi birine doğrudan uygulanabilir: fare, sıçan, hamster veya kobay, bağımsız kafeslerin mikroizolatör üstleri kullanması şartıyla. Kafeslerin boyutları değiştiğinden, yerleşimler biraz değişebilir, ancak 3D baskılı braketler, besleme sistemi ve harici su şişesi tasarımı genellikle mikroizolatör kapaklı bağımsız kemirgen kafesleri arasında uygulanabilir.
Örnek bir otomatik besleyicinin profilini çıkarıyoruz, ancak diğer birçok kullanıma hazır otomatik besleyici mevcuttur ve 3D baskılı parçalarda küçük değişikliklerle modüler sisteme takılabilir. 3D baskılı tutucuyu alternatif besleyicilere veya kafes boyutlarındaki küçük değişikliklere ayarlamayı kolaylaştırmak için, değiştirilebilir, 3 boyutlu bir SolidWorks dosyasını eşlik eden bir STL dosyasıyla kanıtlıyoruz.
Otomatik besleyicinin harici yerleşimi, ev kafesi içinde tam alan sağlar ve hayvanı rahatsız etmeden yemliğin ayrılmasına, sterilize edilmesine ve yeniden yüklenmesine veya değiştirilmesine olanak tanır. Otomatik yemleme sistemi, uzun süreli kayıtlar için verimlidir, uygun maliyetlidir ve çeşitli zaman kısıtlamalı besleme ve/veya kalori kısıtlama protokollerine uygundur. Örnek verilerle birlikte kafes montajlarının, besleme sisteminin uygulanması için tasarımın ve protokolün ayrıntılı teknik çizimlerini sağlıyoruz. İkinci olarak, optogenetik veya fiber fotometri deneyleri için bir yama kablosuna bağlı hayvanlarla otomatik besleyicinin kullanımı için standart kafesi değiştirmek için bir dizi talimat sunuyoruz.
Tüm prosedürler Massachusetts Üniversitesi Amherst Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Otomatik besleyicinin standart bir mikroizolatör kafes kapağına montajı (Şekil 1)
Şekil 1: Otomatik besleyici braketi ve kafes kapağı modifikasyonu ve montajı. (A) Otomatik besleyici braketinin teknik çizimi (3D ölçek için Ek Dosya 1'deki SolidWorks/STL dosyalarına bakın). (B) Soldan sağa, 20 x 25 mm delikli kafes üstü; Kafes üstüne monte edilmiş ve Petbank otomatik besleyici ile monte edilmiş braket. (C) Su şişesi ile standart bir tel rafa bırakılan yiyecek peleti ile kafes üzerine monte edilmiş Petbank Otomatik Besleyici. Ölçek çubukları = 25 cm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Örnek kullanıma hazır otomatik besleyicinin programlanması ve kullanımı
3. Otomatik besleyici ile bağlı hayvanlar için modifiye edilmiş kafes sistemi
Şekil 2: Akrilik plakanın kafes üstüne montajı. (A,B) Akrilik levha ve besleyici port tapasının teknik çizimleri. (C) Sol, delikli ek parça ve filtreli standart kafes üstü. Orta, delikli ek parçanın ve filtrenin çıkarılması (nervürlü ızgara okla gösterilen çizgiler boyunca kesilmelidir). Doğru, akrilik plaka yerine oturdu. (D) Komple kapak montajı. Ölçek çubukları = 25 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Su şişesi braketi tertibatı. (A) 3D baskılı su şişesi braketinin teknik çizimi. (B) Kafes modifikasyonları ve su şişesi braketi tertibatı; (C) Braket takılı; (D) Komple kafes montajı. Ölçek çubukları = 10 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Otomatik besleyici ile komple kafes montajının özeti. (A) Tel ızgaralı standart kafes, (B) bağlı hayvanlar için modifiye edilmiş kafes. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Dişi farelerde infertiliteyi indüklemek için bir kalori kısıtlama çalışması (21 gün) (otomatik besleyici ve kafes tasarımı, Şekil 4A)
Kronik enerji eksikliği, memelilerde doğurganlığı engellemek için yeterlidir, bu da hem kemirgenlerde hem de insanlarda korunan bir tepkidir11,12. Bu çalışmada, uzun süreli vücut ağırlığı kaybını indüklemek için kalori kısıtlaması kullanıyoruz. 15-18 haftalık yetişkin dişi C57BL/6 fareleri, Zeitgeber Time 12'de (ZT12) ışıklar kapalıyken, tek evli ve 12:12 saat ışık:karanlık döngüsündeydi. Yiyecek içeren tel raf, temel gıda alımını belirlemek için bir haftalık aralık boyunca her hayvan için günlük olarak tartıldı, 3.80 ± 0.64 g / gün (ortalama ± SE). Daha sonra, kilo kaybına neden olmak için yiyecekler kısıtlandı. Yiyecekler üç porsiyona bölündü ve otomatik besleyici tarafından üç aralıkta dağıtıldı: ZT 12, 16 ve 20 (kafes konfigürasyonu, Şekil 4A). İlk 48 saat boyunca, hayvanlar temel gıda alımının% 50'si ile sınırlandırıldı. Daha sonra, hayvanlar önümüzdeki 19 gün boyunca temel gıdanın ~% 70'i ile sınırlandırıldı ve kısıtlamanın ikinci yarısında temel ağırlığın% 80-90'ını korumak için küçük ayarlamalar yapıldı (Şekil 5A, alt).
ZT 0 ve ZT 1 arasında, hayvanlar, 0.1 M fosfat tamponlu salin ile vajinal lavaj tarafından toplanan hücrelerin histolojik karakterizasyonu ile yumurtlama döngüsünü evrelemek için tartıldı ve değerlendirildi. Döngü uzunluğu, kilo kaybından en az 11 gün önce ve % 80-90 kilo kaybı sırasında izlendi. % 10'dan fazla sürekli kilo kaybı, dişi farelerde kısırlığa neden olmak için yeterliydi,çünkü 11.
Otomatik besleyiciler, uygun rotasyon ve gıda dağıtımı için günlük olarak incelendi (protokol adımı 3.1). Yerde kalan veya tel rafta kalan yiyecekler atıldı. Burada profili verilen örnek besleyici 16 hazneye sahiptir ve yiyecekleri üç aralıkta teslim edecek şekilde ayarlanabilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bir hazneye sığan maksimum yemek hacminin 2 g olduğunu belirledik, bu da kesilebilir veya boyuta göre sipariş edilebilir. Ayrıca, programlanan süreye ulaşıldığında yemek teslimatının ~ 10 saniye sürdüğünü belirledik. Zemin kapısının tamamen açılması 7 saniye sürer ve ardından haznenin açıklığın üzerinden hareket ederek yiyecek peletini dağıtması için 3 saniye daha sürer. Kapının açılması ve yiyecek topağının boş bir tel rafa düşmesiyle aynı zamana denk gelen sesler var (Video 1, ses kaydı ile).
21 gün boyunca, Petbank'ın bu özel besleyicisini kullanarak rotasyonların ve gıda teslimatının tam doğruluğunu gözlemledik (Malzeme Tablosu). Test sırasında, besleyiciler ilk kullanımlarından itibaren 3 ila 6 ay arasındaydı ve dahili şarj edilebilir piller, 21 günlük denemenin tamamı boyunca tam şarj göstergelerini korudu. Bu nispeten küçük bir besleyici örneği (n = 4) olduğu için, daha sonra yiyecekleri eşleşen bir oranda dağıtmak üzere ayarlanmış 21 otomatik besleyici ile 10 günlük başka bir çalışma yürüttük. Sonraki çalışma, besleyicilerin ilk kullanımından 10 ay sonra gerçekleştirildi. 21 günlük deneme süresi boyunca, bir besleyici 15. günde tek bir çubuk güç kaybetti (~%25 güç kaybı) ve diğeri 17. günde tek bir çubuk kaybetti, kalan 8 besleyici ise 21 günün tamamı için tam şarj göstergelerine sahipti. Örnek besleyicideki güç seviyesi dört çubuk olarak belirtilmiştir. Ölçümümüz, her çubuğun %25 gücü temsil ettiğini varsayar. İlk testimizde olduğu gibi, sonraki çalışmadaki besleyiciler, çalışma süresince hatasız olarak rotasyon ve gıda dağıtımını tekrar gerçekleştirdiler.
Şekil 5: Otomatik besleyici kullanılarak bir kalori kısıtlaması sırasında dişi farelerde üst üste bindirilmiş östrus döngü verileri ile vücut ağırlığı yörüngesi. (A) Üç zaman noktasında (4 saat aralıkla, ışıklar söndüğünde başlayarak) temel gıda alımının %50-70'ini sağlamak için otomatik besleyiciyi kullanan ortalama ağırlık kaybı yörüngesi (altta). Kilo kaybı ile uyumlu temsili östrus döngüsü verileri (üstte). Gri vurgu, başlangıç ağırlığının %10'undan daha fazla kilo kaybını gösterir. Ok, tel ızgarayı yiyecekle doldurarak ve otomatik besleyiciyi çıkararak ad libitum gıda erişimine geri dönüşü gösterir. (B) Kilo kaybı sırasında eströz döngü; Hayvanlar %1 ile %10 arasında olduğunda (açık çubuk) kilo kaybına karşı %>10 kilo kaybı (gri çubuk; not: Diestrus'ta durgunluk kısırlık belirtisidir) Diestrus'ta geçen % sürenin denek içi karşılaştırması N = 4. (C) Bisiklete karşı kilo kaybının şelale grafiği. %8'e varan kilo kaybı ile hayvanların %100'ü doğurgan ve döngüsel iken, %20 kilo kaybıyla hayvanların %100'ü asiklik ve kısırdı. Kısaltmalar: P = proöstrus; E = kızgınlık; D = diestrus. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Kapının açıldığını ve yiyecek peletinin boş bir tel rafa düştüğünü gösteren sesler. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Teknik çizimi ve otomatik besleyici braketi için SolidWorks + STL dosyalarını içeren zip dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Akrilik plakanın teknik çizimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: Teknik çizimi içeren zip dosyası ve port fişi için SolidWorks + STL dosyaları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 4: Teknik çizimi, su şişesi braketi ve şişe tutucusu için SolidWorks + STL dosyalarını içeren zip dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Klinik öncesi hayvan modellerinde, kalori kısıtlaması, metabolizmayı hassas bir şekilde manipüle etmek ve incelemek için güçlü bir deneysel araçtır. Sürekli kilo kaybının obezite, diyabet, yaşlanma, doğurganlık ve menopoz (bir tür üreme yaşlanması) üzerinde etkileri vardır ve bunların tümü önemli translasyonel son noktalardır. Bununla birlikte, kalori kısıtlama paradigmalarının uzun süre sürdürülmesi zor olabilir. Bu yazıda, laboratuvar ortamında uzun süreli kalori kısıtlaması elde etmek için uygun maliyetli bir çözüm sunuyoruz. Kullanıma hazır bir otomatik besleyiciyi standart bir mikroizolatör kapaklı bir kemirgen kafesine bağlamak için talimatlar verilmiştir. Yemlik, hayvanın ev kafesine monte edilir ve yiyecekleri planlanan zamanlarda teslim edecek şekilde programlanır. Planlı yemek teslimatı, yiyecek erişiminin miktarını ve zamanlamasını kontrol eder ve odaya bir işleyicinin girmesine izin verilmez. Ayrıca, uygun maliyetli sistem uzun bir süre (aylar) boyunca çalışabilir ve laboratuvar ortamında uzun süreli kalori kısıtlaması elde etme yeteneğini geliştirir.
Sinirbilimdeki son gelişmeler, araştırmacıların uyanık ve davranan hayvanlarda beslenmeyi teşvik eden nöronları manipüle etmelerine veya kaydetmelerine izin veriyor. Spesifik olarak, besleme nöronlarının fiber fotometri kayıtları (in vivo bir kayıt tekniği), nöral aktiviteyi teşvik etmek için bir dizi açlık ve ardından nöral aktivitedeki değişikliği araştırmak için yeniden besleme ile gerçekleştirilmiştir 13,14,15. Hayvanın ev kafesinde16 in vivo kayıtlar yapmak en iyisi olsa da, bunlar genellikle bir yama kablosuna bağlıyken hareketlilik sağlamak için harici bir alanda gerçekleştirilir. Ayrıca, in vivo kayıtlar, kapılı gıda erişimi olmadan odaya giren bir işleyici tarafından etkilenebilir. Besleme devrelerindeki nöronların fotometri kayıtları için her iki kafa karıştırıcı sorunu da ele almak için, otomatik besleyiciye bağlı olan bağlı hayvanları uzun bir süre boyunca barındırmak için bir ev kafesi modifikasyonu tasarladık (protokol bölüm 3 ve 4). Bu yaklaşımın bir sınırlaması, kafes kapağı ek tasarımının bir lazer kesici gerektirmesidir. Akrilik eki kesmek için döner bir alet ve çentikleme cihazı kullanılabilse de, aletler muhtemelen küçük tırnaklar ve ince bir yarık oluşturmada başarısız olacaktır.
Burada açıklanan besleme sisteminde sınırlamalar vardır. Yani, montaj 3D baskılı parçalar gerektirir. Ayrıca, örnek otomatik besleyicinin saati 24 saatlik bir döngüde çalışır, bu nedenle sirkadiyen çalışmalar için gıda dağıtımının zamanlaması, hayvanın17 serbest çalışma periyoduna manuel olarak hizalanmalıdır. Son olarak, cihaz 16 oda ve programlanmış üç zaman aralığı ile sınırlıdır. Besleyici yiyecekleri dağıtır; Tüketimi izlemez. Belirli bir süre boyunca tüketilmeyen yiyecekler kafes tabanından veya tel raftan alınabilir, ancak yenmemiş yiyeceklerin hesaplanmasında ve alınmasında hatalar olabilir.
Standart bir kemirgen kafesine takılan ticari bir kullanıma hazır otomatik yemleyicinin avantajlarını vurgulamak için, cihazın kullanıcı dostu olduğunu ve belirli zaman aralıklarında hassas yiyecek tahsisatları sağladığını gösteriyoruz. Bu sistem ev kafesi alanını engellemez. Yemlik, hayvanın kafesinin dışına yerleştirildiğinden ve 3D baskılı tutucudan kolayca çıkarılabildiğinden, düzenli bakım, yiyecek doldurma ve temizlik, hayvana en az rahatsızlık verecek şekilde gerçekleştirilebilir.
Örnek olarak, kalori kısıtlamasını ve nihayetinde kısırlığı indüklemek için otomatik besleyiciyi kullandık. Otomatik besleyicinin kullanımını 21 günlük bir kalori kısıtlama çalışmasında gösterdik (Şekil 5) ve daha sonra besleyicileri laboratuvarda çok sayıda deney için kullandık. Sonuçlarda açıklandığı gibi, besleyiciler güvenilirdi ve doğru bir şekilde teslim edilen yiyeceklerdi. Dahili, şarj edilebilir pil zamanla biraz azalıyor gibi görünüyor, ancak besleyicileri yaklaşık bir yıl kullandıktan sonra, hafif bir güç kaybı bile kaydetmeden önce en az 15 gün çalışıyorlar. Üretici tarafından pilin tam şarjdan başlayarak 60 gün boyunca çalışabileceği tahmin edilmektedir. Uzun süreli çalışmalar için (>30 gün), besleyicinin pil ömrü maksimum şarjın %50'sinin altına düştüğünde döndürmek için tam şarjlı yedek besleyicilerin olması önerilir.
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Jason Lê, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilen bakalorya sonrası araştırma eğitim programı tarafından desteklenmektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#7 Stopper W/ 3-1/2" curved sipper tube no ball | Labex | 2067 | |
AN75 mouse cage bottom | Ancare | AN75HT | |
Automatic Fish Feeder for Aquarium | Petbank-tek.com | Amazon distribution (#B0BRCWP16K) | |
Rodent Micro-filter Tops | Ancare | N10MBTPLF | |
Rubber Stoppers, One Hole | United Scientific | S24009 | |
standard rodent chow | Prolab IsoPro 3000 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır