Um sistema "faça você mesmo" para alimentação programada de roedores de laboratório em sua gaiola doméstica

Este artigo detalha o projeto, a montagem e o protocolo para um sistema de alimentação automatizado, juntamente com uma modificação alternativa de tampa e gaiola que pode ser implementada em gaiolas de roedores padrão com modificações mínimas para experimentos de fotometria optogenética ou de fibra amarrada. O sistema de alimentação oferece uma ferramenta econômica para alimentação cronometrada e/ou restrição calórica.

O jejum intermitente e a pesquisa em torno da influência da restrição calórica cronometrada na regulação do peso corporal e nos resultados do envelhecimento são tendências, tanto na sociedade quanto no laboratório. Para estudar a alimentação com restrição de tempo e/ou restrição calórica em laboratório, as quantidades alocadas de alimentos são dispersas em intervalos de tempo programados. A tecnologia atual para alimentação programada de roedores envolve gaiolas especializadas com portas de entrada de alimentos fechadas, funis digitais bloqueados por tempo ou entrega manual de alimentos. Equipamentos especializados para tais experimentos podem ser caros e a alimentação manual geralmente exige que os investigadores venham para pontos de tempo tarde da noite/manhã cedo, impedindo estudos prolongados. O sistema de alimentação automatizado descrito aqui fornece uma ferramenta econômica para alimentação cronometrada e/ou restrição calórica que pode ser implementada em gaiolas de roedores padrão com modificações mínimas. O protocolo usa um alimentador automático pronto para uso que é equipado com uma tampa de gaiola de microisolador padrão (tampas de gaiola de camundongo, hamster, rato ou porquinho-da-índia) e pode administrar as cotas de comida desejadas em intervalos de tempo programados na gaiola doméstica do animal. Nosso projeto pode ser modificado para aceitar vários alimentadores ou pequenas variações nas dimensões da gaiola. Fornecemos o projeto, a montagem e o protocolo para o sistema de alimentação, juntamente com uma modificação alternativa da tampa e da gaiola para experimentos de fotometria optogenética ou de fibra amarrada.

O jejum intermitente é uma área importante da pesquisa metabólica e do envelhecimento. O alinhamento adequado da alimentação e do ritmo circadiano pode alterar o efeito da dieta sobre o peso corporal 1,2,3,4. Além disso, o jejum intermitente prolongado está associado ao aumento da longevidade e à melhora dos distúrbios relacionados à idade 5,6,7,8. Estudos de pesquisa que implementam protocolos de jejum de longo prazo (>20 dias) geralmente requerem equipamentos especializados. Embora seja possível entregar alimentos manualmente para protocolos de alimentação programados, isso pode exigir que um investigador esteja presente em vários pontos fora do horário de expediente por um longo período. Por exemplo, três horários de alimentação com 4 h de intervalo exigiriam entrega manual às 20h00, 12h00 e 4h00; provavelmente um desafio de conformidade a ser sustentado por mais de alguns dias.

Alternativas à entrega manual de alimentos para roedores de laboratório são 1) gaiolas especializadas com acesso automatizado ao alimento ou 2) sistemas de tremonha digital que fornecem acesso automatizado e programado aos alimentos, como o FED3⁹. Os sistemas de gaiola com acesso fechado a alimentos são caros e alguns não fornecem um ambiente adequado para estudos de longo prazo. Por exemplo, as caixas de condicionamento operantes tradicionais são capazes de entrega automatizada de alimentos, mas têm um piso com grade de arame que não é propício para moradias de longo prazo. O sistema BioDAQ da Research Diets fornece comida e água por meio de portas externas fechadas. Portões automatizados programáveis permitem estudos programados de alimentação ou bebida de longo prazo, no entanto, o sistema é um investimento caro. Os sistemas de tremonha mecanizada são mais uma ferramenta para protocolos automatizados de alimentação programada ^9,10. Os dois funis mecanizados citados vêm com a ressalva de reduzir o espaço de vida da gaiola doméstica. Animais famintos com restrição alimentar podem mastigar os aparelhos de alimentação e/ou detritos da gaiola podem interferir na mecânica da tremonha para estudos de longo prazo. Finalmente, uma tremonha mecanizada desenvolvida pelo grupo de pesquisa Takahashi junto com a Phenome Technology foi projetada especificamente para estudos de alimentação programada de longo prazo³. Neste sistema, uma tremonha mecanizada é posicionada acima da grade de uma gaiola padrão com uma calha que entrega alimentos. O sistema Phenome, no entanto, não oferece flexibilidade para animais amarrados a um cabo de remendo (experimentos de optogenética/fotometria de fibra) e é relativamente caro em comparação com o aparelho de alimentação automática descrito aqui.

Em resposta aos desafios predominantes nos protocolos de alimentação programada, propomos um remédio econômico. Nosso sistema automatizado facilita a entrega precisa de alimentos em intervalos predeterminados. Com uma combinação de peças impressas em 3D junto com um alimentador automático de peixes disponível comercialmente, criamos um sistema de alimentação externa faça você mesmo (DIY) que pode ser equipado em gaiolas de roedores autônomas que usam tampas de microisoladores. O sistema de alimentação e as partes aqui descritas podem ser aplicados diretamente a qualquer uma das seguintes gaiolas de roedores: camundongo, rato, hamster ou porquinho-da-índia, desde que as gaiolas autônomas usem topos de microisoladores. Como as gaiolas variam em tamanho, as colocações podem variar um pouco, mas os suportes impressos em 3D, o sistema de alimentação e o design da garrafa de água externa são geralmente aplicáveis em gaiolas de roedores autônomas com tampas de microisoladores.

Apresentamos um exemplo de alimentador automático, mas muitos outros alimentadores automáticos prontos para uso estão disponíveis e podem ser instalados no sistema modular com pequenas alterações nas peças impressas em 3D. Para facilitar o ajuste do suporte impresso em 3D para alimentadores alternativos ou pequenas variações nas dimensões do enjaulamento, provamos um arquivo SolidWorks tridimensional modificável com um arquivo STL complementar.

A colocação externa do alimentador automático fornece espaço total dentro da gaiola doméstica e permite o desprendimento, esterilização e recarga ou substituição do alimentador sem interrupção do animal. O sistema de alimentação automatizado é eficiente para gravações de longo prazo, acessível e passível de vários protocolos de alimentação com restrição de tempo e/ou restrição calórica. Fornecemos desenhos técnicos detalhados dos conjuntos de gaiolas, design e protocolo para implementação do sistema de alimentação, juntamente com dados de amostra. Em segundo lugar, fornecemos um conjunto de instruções para modificar o enjaulamento padrão para o uso do alimentador automático com animais que estão presos a um cabo de conexão para experimentos optogenéticos ou de fotometria de fibra.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Amherst.

1. Montagem do alimentador automático em uma tampa de gaiola microisoladora padrão (Figura 1)

1. Usando uma ferramenta rotativa com um disco de corte de 1,5", corte um quadrado de 20 x 25 mm em uma tampa de gaiola de microisolador. Posicione a abertura a 2.75 cm da borda da tampa e centralizada acima da grade (Figura 1B, esquerda).
2. Imprima em 3D um suporte para acoplar o alimentador automático na tampa da gaiola (Figura 1A e Supplemental File 1). Encaixe o suporte no orifício da tampa da gaiola (passo 1.1; Figura 1B, centro) e deslize o alimentador automático na parte superior do suporte preso (Figura 1B [direita], C).

Figura 1: Modificação e montagem do suporte do alimentador automático e da tampa da gaiola. (A) Desenho técnico do suporte do alimentador automático (consulte os arquivos SolidWorks/STL no Arquivo Suplementar 1 para obter a escala em 3D). (B) Da esquerda para a direita, topo da gaiola com orifício de 20 x 25 mm; suporte instalado no topo da gaiola e montado com alimentador automático Petbank. (C) Alimentador automático Petbank montado na gaiola com pellets de comida deixados cair em uma gradinha padrão com garrafa de água. Barras de escala = 25 cm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Programação e uso do exemplo de alimentador automático pronto para uso

1. Para experimentos cronometrados, defina os tempos de alimentação primeiro e o relógio do alimentador sincronizado por último, pois os ajustes subsequentes mudarão a hora do relógio.
2. Certifique-se de que o alimentador esteja suficientemente carregado. Pressione e segure o botão Configurações até que a configuração da hora na tela comece a piscar.
3. Continue para a configuração de tempo . Usando as setas para cima e para baixo, ajuste o tempo para o primeiro período de alimentação programado desejado.
4. Defina o número de alocações para esse ponto de tempo (indicado pelo número de pontos ao lado da configuração do feed). Repita as etapas 2.2-2.4, para até mais dois pontos de tempo.
5. Carregue as câmaras de alimentação automática com as cotas de alimentos desejadas de ≤ 1,5 g de ração padrão para roedores. Se for necessário mais alimento, configure o alimentador para entregar várias cotas em um determinado momento. O alimentador de exemplo tem 16 câmaras.
   NOTA: Os alimentos podem ser encomendados no tamanho certo ou aparados com uma tesoura.
6. Rotule uma câmara com fita adesiva ou tinta para confirmar a rotação programada da câmara e a entrega de alimentos. Verifique diariamente durante a operação dos alimentadores.

3. Sistema de gaiola modificado para animais amarrados com o alimentador automático

1. Inserção de tampa de substituição opcional para animais amarrados a um cabo de conexão (Figura 2)
   1. Corte a laser um pedaço de acrílico transparente de 3 mm de espessura de acordo com as especificações da Figura 2A (consulte também o Arquivo Suplementar 2). A inserção de acrílico é projetada com abas para encaixar no topo da gaiola. A fenda central (190 x 5 mm) permite a passagem do patch cable. O orifício quadrado de 20 x 25 mm se encaixa no suporte do alimentador automático; 20 orifícios de ventilação permitem a circulação de ar fresco.
   2. Usando uma chave de fenda ou uma ferramenta de cunha, retire a tampa superior da gaiola perfurada de uma tampa microisolada padrão. Trabalhe para liberar as abas dos slots da aba e remova a inserção perfurada e o papel de filtro (Figura 2C, esquerda e centro).
   3. Sob a parte superior perfurada e o papel de filtro há uma grade de suporte interna com nervuras. Use uma ferramenta rotativa e um disco de corte de 1,5 polegadas para remover a grade de suporte; seguindo os indicadores de seta mostrados no centro da Figura 2C. Após o corte para remover a grade de suporte, lime para alisar a borda cortada.
   4. Encaixe a inserção da placa de acrílico de substituição (etapa 3.1) na parte superior da gaiola. Inicie a instalação deslizando as abas da placa nas ranhuras da aba ao longo de uma das bordas curtas e, em seguida, de uma das bordas longas e pressione suavemente até que a placa se encaixe no lugar (Figura 2C [direita] ,D).
2. Suporte externo opcional para garrafa de água para animais amarrados a um patch cord (Figura 3)
   1. Faça uma porta para o bebedor de garrafa de água: orifício de 11 mm de diâmetro, 50 mm do chão, centralizado na borda curta da gaiola (Figura 3B e Arquivo Suplementar 3).
   2. Em ambos os lados do orifício central (± 27,5 mm), faça dois furos de 6 mm de diâmetro. Opcionalmente, use uma ferramenta de punção quadrada de 8 mm para fazer furos quadrados (mostrado na Figura 3B).
   3. Imprima em 3D um suporte externo para garrafa de água (Figura 3A e Arquivo Suplementar 4). Monte o suporte da garrafa de água no fundo da gaiola com parafusos de transporte (2 cm de comprimento, 6 x 1 mm ou 0.75" de comprimento 1/4 x 20; Figura 2B, C).
   4. Para uma garrafa de água, coloque um tubo cônico padrão de 50 mL, tampado com um conjunto de sipper/rolha (#7 Stopper W/ 3-1/2" sipper curvo, consulte a Tabela de Materiais) no suporte externo. Reabasteça a água a cada 2-3 dias.

Figura 2: Montagem da placa de acrílico no topo da gaiola. (A, B) Desenhos técnicos da placa acrílica e do plugue da porta do alimentador. (C) Esquerda, topo de gaiola padrão com inserto perfurado e filtro. Centro, remoção do inserto perfurado e do filtro (a grade nervurada deve ser cortada ao longo das linhas indicadas pela seta). Direita, placa de acrílico encaixada no lugar. (D) Montagem completa da tampa. Barras de escala = 25 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Conjunto do suporte da garrafa de água. (A) Desenho técnico do suporte da garrafa de água impresso em 3D. (B) Modificações da gaiola e montagem do suporte da garrafa de água; (C) Suporte instalado; (D) Montagem completa da gaiola. Barras de escala = 10 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resumo da montagem completa da gaiola com o alimentador automático. (A) Gaiola padrão com grade de arame, (B) gaiola modificada para animais amarrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um estudo de restrição calórica (21 dias) para induzir infertilidade em camundongos fêmeas (autoalimentador e design de gaiola, Figura 4A)
A deficiência crônica de energia é suficiente para inibir a fertilidade em mamíferos, uma resposta que é conservada em roedores e humanos^11,12. Neste estudo, usamos a restrição calórica para induzir a perda de peso corporal a longo prazo. Camundongos C57BL/6 fêmeas adultas, de 15 a 18 semanas de idade, foram alojados individualmente e em um ciclo claro:escuro de 12:12 h, com luzes apagadas no Zeitgeber Time 12 (ZT12). A grelha contendo alimento foi pesada diariamente para cada animal durante um intervalo de uma semana para estabelecer o consumo alimentar inicial, 3,80 ± 0,64 g/dia (média ± EP). Em seguida, a alimentação foi restrita para induzir a perda de peso. A comida foi racionada em três porções e distribuída pelo alimentador automático em três intervalos: ZT 12, 16 e 20 (configuração da gaiola, Figura 4A). Nas 48 h iniciais, os animais ficaram restritos a 50% da ingestão alimentar basal. Em seguida, os animais foram restritos a ~ 70% do alimento basal nos próximos 19 dias, com pequenos ajustes na segunda metade da restrição para manter 80-90% do peso basal (Figura 5A, inferior).

Entre ZT 0 e ZT 1, os animais foram pesados e avaliados quanto ao estadiamento do ciclo ovulatório por caracterização histológica de células coletadas por lavagem vaginal com solução salina tamponada com fosfato 0,1 M. A duração do ciclo foi monitorada por pelo menos 11 dias antes e durante a perda de peso de 80-90%. A perda de peso sustentada superior a 10% foi suficiente para induzir infertilidade em camundongos fêmeas, conforme publicado anteriormente¹¹.

Os alimentadores automáticos foram pesquisados diariamente para rotação adequada e entrega de alimentos (etapa 3.1 do protocolo). Qualquer alimento deixado no chão ou restante na gradinha foi descartado. O alimentador de exemplo perfilado aqui tem 16 câmaras e pode ser configurado para entregar alimentos em três intervalos (consulte a Tabela de Materiais). Determinamos que o volume máximo de ração que cabe em uma câmara é de 2 g, que pode ser cortado ou encomendado no tamanho certo. Também determinamos que a entrega de alimentos leva ~ 10 s quando o tempo programado é atingido. Leva 7 s para o portão do piso abrir totalmente e depois mais 3 s para a câmara se mover sobre a abertura, dispensando o pellet de comida. Há ruídos que coincidem com a abertura do portão e o pellet de comida caindo em uma gradinha vazia (Vídeo 1, com gravação de som).

Ao longo de 21 dias, observamos a precisão completa das rotações e entrega de alimentos usando este alimentador específico da Petbank (Tabela de Materiais). No momento do teste, os alimentadores estavam entre 3 e 6 meses desde o uso inicial e as baterias recarregáveis internas mantiveram as indicações de carga total durante todo o teste de 21 dias. Como esta era uma amostra relativamente pequena de alimentadores (n = 4), posteriormente realizamos outro estudo de 21 dias com 10 alimentadores automáticos, configurados para distribuir alimentos a uma taxa correspondente. O estudo subsequente foi realizado 10 meses após o uso inicial dos comedouros. Durante o teste de 21 dias, um alimentador perdeu uma única barra de energia (~ 25% de perda de energia) no dia 15 e outro perdeu uma única barra no dia 17, enquanto os 8 alimentadores restantes tiveram indicações de carga completa durante os 21 dias inteiros. O nível de potência no alimentador de exemplo é indicado como quatro barras. Nossa quantificação assume que cada barra representa 25% de potência. Assim como em nosso teste inicial, os alimentadores do estudo subsequente realizaram novamente a rotação e a entrega de alimentos sem erros durante o estudo.

Figura 5: Trajetória de peso corporal com dados de ciclagem de estro sobrepostos em camundongos fêmeas durante uma restrição calórica usando o alimentador automático. (A) Trajetória média de perda de peso (inferior) usando o alimentador automático para fornecer 50-70% da ingestão de alimentos basal em três pontos de tempo (4 h de intervalo, começando com as luzes apagadas). Dados representativos do ciclo estral alinhados com a perda de peso (topo). O destaque cinza indica perda de peso superior a 10% do peso inicial. A seta indica o retorno ao acesso ad libitum aos alimentos enchendo a gradinha com alimentos e removendo o alimentador automático. (B) Ciclagem em estro durante a perda de peso; Comparação dentro do sujeito da % de tempo em diestro quando os animais estão entre 1% e 10% (barra aberta) de perda de peso versus >10% de perda de peso (barra cinza; nota: parar no diestro é um sinal de infertilidade) n = 4. (C) Gráfico em cascata de perda de peso versus ciclismo. Com até 8% de perda de peso, 100% dos animais eram férteis e cicláveis, enquanto com 20% de perda de peso, 100% dos animais eram acíclicos e inférteis. Abreviaturas: P = proestro; E = estro; D = diestro. As barras de erro representam o erro padrão da média Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Ruídos indicando a abertura do portão e o pellet de comida caindo em uma gradinha vazia. Clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo suplementar 1: Arquivo zip contendo o desenho técnico e os arquivos SolidWorks + STL para o suporte do alimentador automático. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: Desenho técnico da placa de acrílico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3: arquivo zip contendo o desenho técnico e os arquivos SolidWorks + STL para o plugue da porta. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 4: arquivo Zip contendo o desenho técnico, arquivos SolidWorks + STL para o suporte e suporte para garrafa de água. Clique aqui para baixar este arquivo.

Em modelos animais pré-clínicos, a restrição calórica é uma poderosa ferramenta experimental para manipular e estudar com precisão o metabolismo. A perda de peso sustentada tem implicações na obesidade, diabetes, envelhecimento, fertilidade e menopausa (um tipo de envelhecimento reprodutivo), todos os quais são importantes desfechos translacionais. Os paradigmas de restrição calórica, no entanto, podem ser difíceis de sustentar por um longo tempo. Neste manuscrito, oferecemos uma solução econômica para alcançar a restrição calórica de longo prazo em um ambiente de laboratório. São fornecidas instruções para acoplar um alimentador automático pronto para uso a uma gaiola de roedores com uma tampa de microisolador padrão. O comedouro é montado na gaiola doméstica do animal e é programado para entregar comida em horários programados. A entrega programada de alimentos controla a quantidade e o tempo de acesso aos alimentos e está livre de um manipulador entrar na sala. Além disso, o sistema econômico pode funcionar por um longo período (meses), melhorando a capacidade de atingir a restrição calórica de longo prazo em um ambiente de laboratório.

Avanços recentes na neurociência permitem que os pesquisadores manipulem ou registrem a partir de neurônios que promovem a alimentação em animais acordados e comportados. Especificamente, registros de fotometria de fibra (uma técnica de gravação in vivo) de neurônios de alimentação foram realizados com uma sequência de jejum, para promover a atividade neural e, em seguida, realimentação, para investigar mudanças na atividade neural 13,14,15. Embora seja melhor realizar gravações in vivo na gaiola doméstica do animal¹⁶, elas geralmente são conduzidas em uma arena externa para fornecer mobilidade enquanto estão amarradas a um cabo de conexão. Além disso, as gravações in vivo podem ser influenciadas por um manipulador que entra na sala sem um meio de acesso fechado aos alimentos. Para resolver ambos os problemas de confusão para registros de fotometria de neurônios nos circuitos de alimentação, projetamos uma modificação de gaiola doméstica para abrigar animais amarrados por um período prolongado, que é acoplado ao alimentador automático (seções de protocolo 3 e 4). Uma limitação dessa abordagem é que o design da inserção da tampa da gaiola requer um cortador a laser. Embora uma ferramenta rotativa e um dispositivo de pontuação possam ser usados para cortar a inserção de acrílico, as ferramentas provavelmente falhariam na geração de pequenas abas e uma fenda fina.

Existem limitações para o sistema de alimentação descrito aqui. Ou seja, a montagem requer peças impressas em 3D. Além disso, o relógio do alimentador automático de exemplo funciona em um ciclo de 24 horas, portanto, o tempo de entrega de alimentos para estudos circadianos deve ser alinhado manualmente ao período de corrida livre do animal¹⁷. Finalmente, o dispositivo é limitado a 16 câmaras e três intervalos de tempo programados. O comedouro distribui alimentos; não monitora o consumo. Os alimentos que não são consumidos durante um determinado período de tempo podem ser recuperados do chão da gaiola ou da gradinha, mas pode haver erros na contabilização e recuperação dos alimentos não consumidos.

Para destacar as vantagens de um alimentador automático comercial pronto para uso equipado com uma gaiola de roedor padrão, mostramos que o dispositivo é fácil de usar e fornece lotes precisos de comida em intervalos de tempo específicos. Este sistema não obstrui a área da gaiola doméstica. Como o comedouro está posicionado fora da gaiola do animal e pode ser facilmente removido do suporte impresso em 3D, manutenção regular, recargas de alimentos e limpeza podem ser realizadas com o mínimo de perturbação para o animal.

Como exemplo, usamos o alimentador automático para induzir restrição calórica e, em última análise, infertilidade. Demonstramos o uso do alimentador automático em um estudo de restrição calórica de 21 dias (Figura 5) e, posteriormente, usamos os alimentadores para vários experimentos em laboratório. Conforme descrito nos resultados, os comedouros eram confiáveis e entregavam alimentos com precisão. A bateria interna recarregável parece diminuir um pouco com o tempo, mas depois de quase um ano de uso dos alimentadores, eles funcionam por no mínimo 15 dias antes de registrar uma pequena perda de energia. Estima-se pelo fabricante que a bateria possa funcionar por 60 dias, a partir de uma carga completa. Para estudos prolongados (>30 dias), é aconselhável ter alimentadores de substituição totalmente carregados para girar quando a vida útil da bateria do alimentador estiver abaixo de 50% da carga máxima.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Jason Lê é apoiado pelo programa de educação em pesquisa pós-bacharelado financiado pelo National Institutes of Health.