Un sistema fai-da-te per l'alimentazione programmata dei roditori da laboratorio nella loro gabbia domestica

Questo documento descrive in dettaglio la progettazione, l'assemblaggio e il protocollo per un sistema di alimentazione automatizzato insieme a una modifica alternativa del coperchio e della gabbia che può essere implementata su gabbie standard per roditori con modifiche minime per esperimenti optogenetici o di fotometria delle fibre. Il sistema di alimentazione offre uno strumento economico per l'alimentazione temporizzata e/o la restrizione calorica.

Il digiuno intermittente e la ricerca sull'influenza della restrizione calorica temporizzata sulla regolazione del peso corporeo e sugli esiti dell'invecchiamento sono di tendenza, sia nella società che in laboratorio. Per studiare l'alimentazione a tempo limitato e/o la restrizione calorica in laboratorio, le quantità di cibo assegnate vengono distribuite a intervalli di tempo programmati. L'attuale tecnologia per l'alimentazione programmata dei roditori prevede gabbie specializzate con porte di ingresso del cibo recintate, tramogge digitali bloccate nel tempo o consegna manuale del cibo. Le attrezzature specializzate per tali esperimenti possono essere costose e l'alimentazione manuale spesso richiede agli investigatori di intervenire a tarda notte/mattina presto, precludendo studi prolungati. Il sistema di alimentazione automatizzato qui descritto fornisce uno strumento economico per l'alimentazione temporizzata e/o la restrizione calorica che può essere implementata su gabbie standard per roditori con modifiche minime. Il protocollo utilizza un alimentatore automatico standard dotato di un coperchio standard per gabbie di microisolatori (coperchi di gabbie per topi, criceti, ratti o porcellini d'India) e può somministrare le porzioni di cibo desiderate a intervalli di tempo programmati nella gabbia domestica dell'animale. Il nostro design può essere modificato per accettare vari alimentatori o lievi variazioni nelle dimensioni della gabbia. Forniamo la progettazione, l'assemblaggio e il protocollo per il sistema di alimentazione insieme a una modifica alternativa del coperchio e della gabbia per esperimenti optogenetici o di fotometria in fibra legata.

Il digiuno intermittente è un'area importante della ricerca metabolica e sull'invecchiamento. Il corretto allineamento dell'alimentazione e del ritmo circadiano può alterare l'effetto della dieta sul peso corporeo 1,2,3,4. Inoltre, il digiuno intermittente prolungato è associato a una maggiore longevità e a un miglioramento dei disturbi legati all'età 5,6,7,8. Gli studi di ricerca che implementano protocolli di digiuno a lungo termine (>20 giorni) richiedono in genere attrezzature specializzate. Sebbene sia possibile consegnare il cibo manualmente per i protocolli di alimentazione programmati, ciò potrebbe richiedere la presenza di un investigatore in numerosi punti orari fuori orario per un periodo prolungato. Ad esempio, tre orari di alimentazione a distanza di 4 ore richiederebbero la consegna manuale alle 20:00, alle 12:00 e alle 4:00; probabilmente una sfida di conformità da sostenere per più di qualche giorno.

Le alternative alla consegna manuale del cibo per i roditori da laboratorio sono 1) gabbie specializzate con accesso automatizzato al cibo o 2) sistemi di tramogge digitali che forniscono un accesso automatizzato e programmato al cibo, come FED3⁹. I sistemi di gabbia con accesso al cibo recintato sono costosi e alcuni non forniscono un ambiente domestico adatto per studi a lungo termine. Ad esempio, le tradizionali scatole di condizionamento operante sono in grado di eseguire la consegna automatizzata di cibo, ma hanno un pavimento in griglia metallica che non è favorevole per l'edilizia a lungo termine. Il sistema BioDAQ di Research Diets fornisce cibo e acqua tramite porte esterne gategate. I cancelli automatizzati programmabili consentono studi programmati a lungo termine sull'alimentazione o sull'abbeveraggio, tuttavia il sistema è un investimento costoso. I sistemi di tramoggia meccanizzati sono un altro strumento per i protocolli di alimentazione programmata automatizzata ^9,10. Le due tramogge meccanizzate citate vengono fornite con l'avvertenza di ridurre lo spazio abitativo della gabbia domestica. Gli animali affamati con cibo limitato possono masticare gli apparecchi di alimentazione e/o i detriti della gabbia possono interferire con la meccanica della tramoggia per studi a lungo termine. Infine, una tramoggia meccanizzata sviluppata dal gruppo di ricerca Takahashi insieme a Phenome Technology è stata specificamente progettata per studi di alimentazione programmata a lungo termine³. In questo sistema, una tramoggia meccanizzata è posizionata sopra la griglia di una gabbia standard con uno scivolo che eroga il cibo. Il sistema Phenome, tuttavia, non fornisce flessibilità per gli animali legati a un cavo patch (esperimenti di optogenetica/fotometria delle fibre), ed è relativamente costoso rispetto all'apparato di alimentazione automatica qui descritto.

In risposta alle sfide prevalenti nei protocolli di alimentazione programmata, proponiamo un rimedio economicamente vantaggioso. Il nostro sistema automatizzato facilita la consegna precisa del cibo a intervalli predeterminati. Con una combinazione di parti stampate in 3D insieme a una mangiatoia automatica per pesci disponibile in commercio, ideiamo un sistema di alimentazione esterno fai-da-te (fai-da-te) che può essere equipaggiato su gabbie per roditori autonome che utilizzano parti superiori di microisolatori. Il sistema di alimentazione e le parti qui descritte possono essere applicati direttamente a una qualsiasi delle seguenti gabbie per roditori: topo, ratto, criceto o porcellino d'India, a condizione che le gabbie autonome utilizzino parti superiori di microisolatori. Poiché le gabbie variano in dimensioni, i posizionamenti possono variare leggermente, ma le staffe stampate in 3D, il sistema di alimentazione e il design esterno della bottiglia d'acqua sono generalmente applicabili alle gabbie per roditori autonome con coperchi per microisolatori.

Presentiamo un esempio di alimentatore automatico, ma sono disponibili molti altri alimentatori automatici standard che possono essere montati sul sistema modulare con lievi modifiche alle parti stampate in 3D. Per facilitare la regolazione del supporto stampato in 3D su alimentatori alternativi o lievi variazioni nelle dimensioni dell'ingessatura, dimostriamo un file SolidWorks tridimensionale modificabile con un file STL complementare.

Il posizionamento esterno dell'alimentatore automatico offre uno spazio completo all'interno della gabbia domestica e consente il distacco, la sterilizzazione e la ricarica o la sostituzione dell'alimentatore senza interrompere l'animale. Il sistema di alimentazione automatizzato è efficiente per registrazioni a lungo termine, conveniente e suscettibile di vari protocolli di alimentazione a tempo limitato e/o di restrizione calorica. Forniamo disegni tecnici dettagliati degli assemblaggi della gabbia, la progettazione e il protocollo per l'implementazione del sistema di alimentazione, insieme a dati di esempio. In secondo luogo, forniamo una serie di istruzioni per modificare la gabbia standard per l'uso dell'alimentatore automatico con animali che sono legati a un cavo patch per esperimenti optogenetici o di fotometria in fibra.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Massachusetts Amherst.

1. Montaggio dell'alimentatore automatico su un coperchio standard della gabbia del microisolatore (Figura 1)

1. Utilizzando un utensile rotante con una rotella da 1,5", ritagliare un quadrato di 20 x 25 mm in un coperchio a gabbia per microisolatori. Posizionare l'apertura a 2,75 cm dal bordo del coperchio e centrata sopra la griglia (Figura 1B, a sinistra).
2. Stampa in 3D una staffa per accoppiare l'alimentatore automatico sul coperchio della gabbia (Figura 1A e File supplementare 1). Agganciare la staffa al foro del coperchio della gabbia (passaggio 1.1; Figura 1B, al centro) e far scorrere l'alimentatore automatico sulla parte superiore della staffa fissata (Figura 1B [a destra], C).

Figura 1: Modifica e assemblaggio della staffa dell'alimentatore automatico e del coperchio della gabbia. (A) Disegno tecnico della staffa dell'alimentatore automatico (vedere i file SolidWorks/STL nel file supplementare 1 per la scala in 3D). (B) Da sinistra a destra, gabbia-top con foro 20 x 25 mm; staffa installata sulla parte superiore della gabbia e montata con alimentatore automatico Petbank. (C) Alimentatore automatico Petbank assemblato su gabbia con pellet di cibo lasciato cadere su una griglia standard con bottiglia d'acqua. Barre della scala = 25 cm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Programmazione e utilizzo dell'esempio di alimentatore automatico standard

1. Per gli esperimenti a tempo, impostare prima i tempi di alimentazione e per ultimo l'orologio dell'alimentatore sincronizzato, poiché le regolazioni successive sposteranno l'ora dell'orologio.
2. Assicurarsi che l'alimentatore sia sufficientemente carico. Tenere premuto il pulsante Impostazioni finché l'impostazione dell'ora sullo schermo non lampeggia.
3. Continuare con l'impostazione dell'ora . Utilizzando le frecce su e giù, regolare l'ora sul primo periodo di alimentazione programmato desiderato.
4. Impostare il numero di assegnazioni per questo punto temporale (indicato dal numero di punti accanto all'impostazione del feed). Ripetere i passaggi 2.2-2.4, per un massimo di altri due punti temporali.
5. Caricare le camere dell'alimentatore automatico con le porzioni di cibo desiderate di ≤1,5 g di cibo standard per roditori. Se è necessario più cibo, impostare l'alimentatore in modo che fornisca più lotti in un determinato momento. L'alimentatore di esempio ha 16 camere.
   NOTA: Il cibo può essere ordinato a misura o tagliato con le forbici.
6. Etichettare una camera con nastro adesivo o vernice per confermare la rotazione programmata della camera e l'erogazione del cibo. Controllare quotidianamente durante il funzionamento degli alimentatori.

3. Sistema di gabbia modificato per animali legati con l'alimentatore automatico

1. Inserto di ricambio opzionale per animali legati a un cavo patch (Figura 2)
   1. Taglio laser di un pezzo di acrilico trasparente di 3 mm di spessore secondo le specifiche della Figura 2A (vedere anche il file supplementare 2). L'inserto in acrilico è progettato con linguette per agganciarsi alla parte superiore della gabbia. La fessura centrale (190 x 5 mm) consente il passaggio del cavo patch. Il foro quadrato da 20 x 25 mm si adatta alla staffa dell'alimentatore automatico; 20 fori di ventilazione consentono la circolazione dell'aria fresca.
   2. Utilizzando un cacciavite a testa piatta o uno strumento a cuneo, sollevare il coperchio superiore della gabbia perforata di un coperchio per microisolatore standard. Lavorare per sganciare le linguette dalle fessure delle linguette e rimuovere sia l'inserto perforato che la carta da filtro (Figura 2C, a sinistra e al centro).
   3. Sotto il piano forato e la carta da filtro è presente una griglia di supporto interna a coste. Utilizzare un utensile rotante e un disco da taglio da 1,5 pollici per rimuovere la griglia di supporto; seguendo gli indicatori a freccia mostrati al centro della Figura 2C. Dopo aver tagliato per rimuovere la griglia di supporto, limare per levigare il bordo tagliato.
   4. Inserire l'inserto della piastra acrilica di ricambio (passaggio 3.1) nella parte superiore della gabbia. Iniziare l'installazione facendo scorrere le linguette della piastra nelle fessure delle linguette lungo uno dei bordi corti e poi uno dei bordi lunghi e premere delicatamente finché la piastra non scatta in posizione (Figura 2C [a destra], D).
2. Staffa esterna opzionale per bottiglia d'acqua per animali legata a un cavo patch (Figura 3)
   1. Praticare una porta per il sorseggiatore della bottiglia d'acqua: foro di 11 mm di diametro, a 50 mm dal pavimento, centrato sul bordo corto della gabbia (Figura 3B e File supplementare 3).
   2. Su entrambi i lati del foro centrale (± 27,5 mm), praticare due fori di 6 mm di diametro. Facoltativamente, utilizzare un punzone quadrato da 8 mm per praticare fori quadrati (mostrato nella Figura 3B).
   3. Stampa in 3D una staffa esterna per borraccia (Figura 3A e File supplementare 4). Montare la staffa della bottiglia d'acqua sul fondo della gabbia con i bulloni a testa tonda (2 cm di lunghezza, 6 x 1 mm o 0.75" di lunghezza 1/4 x 20; Figura 2B, C).
   4. Per una bottiglia d'acqua, montare una provetta conica standard da 50 ml, tappata con un gruppo sipper/tappo (tappo #7 con sipper curvo da 3-1/2", vedere la tabella dei materiali) sulla staffa esterna. Rabboccare l'acqua ogni 2-3 giorni.

Figura 2: Montaggio della piastra acrilica sulla parte superiore della gabbia. (A,B) Disegni tecnici della piastra acrilica e del tappo della porta di alimentazione. (C) Sinistra, parte superiore della gabbia standard con inserto forato e filtro. Centratura, rimozione dell'inserto forato e del filtro (la griglia rigata deve essere ritagliata lungo le linee indicate con la freccia). A destra, la lastra acrilica è scattata in posizione. (D) Montaggio completo del coperchio. Barre della scala = 25 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Assemblaggio della staffa della bottiglia d'acqua. (A) Disegno tecnico della staffa della bottiglia d'acqua stampata in 3D. (B) Modifiche alla gabbia e montaggio della staffa della bottiglia d'acqua; (C) Staffa installata; (D) Assemblaggio completo della gabbia. Barre della scala = 10 cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Riepilogo dell'assemblaggio completo della gabbia con l'alimentatore automatico. (A) Gabbia standard con griglia metallica, (B) gabbia modificata per animali legati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Uno studio di restrizione calorica (21 giorni) per indurre l'infertilità in topi femmina (design dell'alimentatore automatico e della gabbia, Figura 4A)
La carenza cronica di energia è sufficiente a inibire la fertilità nei mammiferi, una risposta che si conserva sia nei roditori che nell'uomo ^11,12. In questo studio, utilizziamo la restrizione calorica per indurre la perdita di peso corporeo a lungo termine. Topi femmina adulta C57BL/6, di età compresa tra 15 e 18 settimane, erano alloggiati da soli e seguivano un ciclo luce/buio di 12:12 ore, con luci spente all'ora Zeitgeber 12 (ZT12). La griglia contenente il cibo è stata pesata giornalmente per ciascun animale a intervalli di una settimana per stabilire l'assunzione di cibo di base, 3,80 ± 0,64 g/giorno (media ± SE). Successivamente, il cibo è stato limitato per indurre la perdita di peso. Il cibo è stato razionato in tre porzioni e distribuito dall'alimentatore automatico su tre intervalli: ZT 12, 16 e 20 (configurazione a gabbia, Figura 4A). Per le prime 48 ore, gli animali sono stati limitati al 50% dell'assunzione di cibo di base. Quindi, gli animali sono stati limitati a ~70% del cibo di base nei successivi 19 giorni, con lievi aggiustamenti nella seconda metà della restrizione per mantenere l'80-90% del peso di base (Figura 5A, in basso).

Tra ZT 0 e ZT 1, gli animali sono stati pesati e valutati per la stadiazione del ciclo ovulatorio mediante caratterizzazione istologica delle cellule raccolte mediante lavaggio vaginale con soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M. La durata del ciclo è stata monitorata per almeno 11 giorni prima e durante la perdita di peso dell'80-90%. Una perdita di peso sostenuta superiore al 10% è stata sufficiente per indurre l'infertilità nei topi femmine, come precedentemente pubblicato¹¹.

Gli autofeeder sono stati esaminati quotidianamente per verificarne la corretta rotazione e la consegna del cibo (fase 3.1 del protocollo). Il cibo rimasto a terra o rimasto nella griglia è stato scartato. L'esempio di alimentatore qui profilato ha 16 camere e può essere impostato per erogare cibo a tre intervalli (vedi Tabella dei materiali). Abbiamo stabilito che il volume massimo di cibo che entra in una camera è di 2 g, che può essere tagliato o ordinato a misura. Abbiamo anche stabilito che la consegna del cibo richiede ~10 secondi una volta raggiunto il tempo programmato. Occorrono 7 s perché il cancello del pavimento si apra completamente e poi altri 3 s perché la camera si muova sopra l'apertura, erogando il pellet di cibo. Ci sono rumori che coincidono con l'apertura del cancello e il pellet di cibo che cade su una griglia vuota (Video 1, con registrazione audio).

Nel corso di 21 giorni, abbiamo osservato la completa precisione delle rotazioni e della consegna del cibo utilizzando questo specifico alimentatore di Petbank (Table of Materials). Al momento del test, gli alimentatori erano tra i 3 e i 6 mesi dal loro utilizzo iniziale e le batterie ricaricabili interne hanno mantenuto le indicazioni di carica completa per l'intera durata dei 21 giorni di prova. Poiché si trattava di un campione relativamente piccolo di alimentatori (n = 4), abbiamo successivamente condotto un altro studio di 21 giorni con 10 alimentatori automatici, impostati per distribuire il cibo a una velocità corrispondente. Lo studio successivo è stato condotto 10 mesi dopo l'uso iniziale delle mangiatoie. Durante i 21 giorni di prova, un alimentatore ha perso una singola barra di potenza (~25% di perdita di potenza) al giorno 15 e un altro ha perso una singola barra al giorno 17, mentre i restanti 8 alimentatori hanno avuto indicazioni di carica completa per tutti i 21 giorni. Il livello di potenza sull'alimentatore di esempio è indicato come quattro barre. La nostra quantificazione presuppone che ogni barra rappresenti il 25% di potenza. Come per il nostro test iniziale, gli alimentatori nello studio successivo hanno nuovamente eseguito la rotazione e l'erogazione del cibo senza errori per tutta la durata dello studio.

Figura 5: Traiettoria del peso corporeo con dati sovrapposti sul ciclo estrale in topi femmina durante una restrizione calorica utilizzando l'alimentatore automatico. (A) Traiettoria media di perdita di peso (in basso) utilizzando l'alimentatore automatico per fornire il 50-70% dell'assunzione di cibo al basale in tre punti temporali (4 ore di distanza, a partire da luci spente). Dati rappresentativi del ciclo estrale allineati con la perdita di peso (in alto). L'evidenziazione grigia indica una perdita di peso superiore al 10% del peso iniziale. La freccia indica il ritorno all'accesso al cibo ad libitum riempiendo la griglia con il cibo e rimuovendo l'alimentatore automatico. (B) Ciclo estrale durante la perdita di peso; Confronto all'interno del soggetto della % di tempo nel diestro quando gli animali sono compresi tra l'1% e il 10% (barra aperta) di perdita di peso rispetto al >10% di perdita di peso (barra grigia; nota: l'arresto nel diestro è un segno di infertilità) n = 4. (C) Grafico a cascata della perdita di peso rispetto al ciclismo. Con una perdita di peso fino all'8%, il 100% degli animali era fertile e ciclico, mentre con una perdita di peso del 20%, il 100% degli animali era aciclico e sterile. Abbreviazioni: P = proestro; E = estro; D = diestro. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Rumori che indicano l'apertura del cancello e il pellet di cibo che cade su una griglia vuota. Clicca qui per scaricare questo video.

File supplementare 1: file zip contenente il disegno tecnico e i file SolidWorks + STL per la staffa dell'alimentatore automatico. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Disegno tecnico della lastra acrilica. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: file zip contenente il disegno tecnico e i file SolidWorks + STL per il connettore della porta. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: file zip contenente il disegno tecnico, i file SolidWorks + STL per la staffa della borraccia e il portaborraccia. Clicca qui per scaricare questo file.

Nei modelli animali preclinici, la restrizione calorica è un potente strumento sperimentale per manipolare e studiare con precisione il metabolismo. La perdita di peso sostenuta ha implicazioni nell'obesità, nel diabete, nell'invecchiamento, nella fertilità e nella menopausa (un tipo di invecchiamento riproduttivo), tutti importanti endpoint traslazionali. I paradigmi di restrizione calorica, tuttavia, possono essere difficili da sostenere per un tempo prolungato. In questo manoscritto, offriamo una soluzione economica per ottenere una restrizione calorica a lungo termine in un ambiente di laboratorio. Vengono fornite le istruzioni per accoppiare un alimentatore automatico standard a una gabbia per roditori con un coperchio per microisolatore standard. La mangiatoia è montata sulla gabbia di casa dell'animale ed è programmata per erogare il cibo ad orari prestabiliti. La consegna programmata del cibo controlla la quantità e i tempi di accesso al cibo ed è gratuita per l'ingresso di un addetto nella stanza. Inoltre, il sistema economico può funzionare per un periodo prolungato (mesi), migliorando la capacità di ottenere una restrizione calorica a lungo termine in un ambiente di laboratorio.

I recenti progressi nelle neuroscienze consentono ai ricercatori di manipolare o registrare i neuroni che promuovono l'alimentazione negli animali svegli e in comportamento. In particolare, le registrazioni di fotometria delle fibre (una tecnica di registrazione in vivo) dei neuroni di alimentazione sono state eseguite con una sequenza di digiuno, per promuovere l'attività neurale, e quindi di rialimentazione, per indagare il cambiamento nell'attività neurale 13,14,15. Sebbene sia meglio eseguire registrazioni in vivo nella gabbia domestica dell'animale¹⁶, sono spesso condotte in un'arena esterna per garantire la mobilità mentre sono legati a un cavo patch. Inoltre, le registrazioni in vivo possono essere influenzate da un gestore che entra nella stanza senza un mezzo di accesso al cibo recintato. Per affrontare entrambi i problemi di confusione per le registrazioni fotometriche dei neuroni nei circuiti di alimentazione, abbiamo progettato una modifica della gabbia domestica per ospitare gli animali legati per un periodo prolungato, che è accoppiata all'alimentatore automatico (sezioni del protocollo 3 e 4). Una limitazione di questo approccio è che il design dell'inserto del coperchio della gabbia richiede una taglierina laser. Mentre un utensile rotante e un dispositivo di incisione potrebbero essere utilizzati per tagliare l'inserto acrilico, gli strumenti probabilmente non riuscirebbero a generare piccole linguette e una fessura sottile.

Ci sono limitazioni al sistema di alimentazione qui descritto. Vale a dire, l'assemblaggio richiede parti stampate in 3D. Inoltre, l'orologio dell'alimentatore automatico di esempio funziona su un ciclo di 24 ore, quindi i tempi di consegna del cibo per gli studi circadiani devono essere allineati manualmente al periodo di funzionamento libero dell'animale¹⁷. Infine, il dispositivo è limitato a 16 camere e tre intervalli di tempo programmati. La mangiatoia distribuisce il cibo; Non monitora i consumi. Il cibo che non viene consumato entro un determinato periodo di tempo può essere recuperato dal pavimento della gabbia o dalla griglia, ma potrebbero esserci errori nella contabilizzazione e nel recupero del cibo non consumato.

Per evidenziare i vantaggi di un alimentatore automatico commerciale pronto all'uso equipaggiato con una gabbia per roditori standard, dimostriamo che il dispositivo è facile da usare e fornisce porzioni precise di cibo a intervalli di tempo specifici. Questo sistema non ostruisce l'area della gabbia domestica. Poiché l'alimentatore è posizionato all'esterno della gabbia dell'animale e può essere facilmente staccato dal supporto stampato in 3D, la manutenzione regolare, le ricariche di cibo e la pulizia possono essere eseguite con il minimo disturbo per l'animale.

Ad esempio, abbiamo utilizzato l'alimentatore automatico per indurre la restrizione calorica e, in ultima analisi, l'infertilità. Dimostriamo l'uso dell'alimentatore automatico in uno studio di restrizione calorica di 21 giorni (Figura 5) e successivamente abbiamo utilizzato gli alimentatori per numerosi esperimenti in laboratorio. Come descritto nei risultati, gli alimentatori erano affidabili e consegnavano cibo con precisione. La batteria interna ricaricabile sembra diminuire un po' nel tempo, ma dopo quasi un anno di utilizzo degli alimentatori, funzionano per un minimo di 15 giorni prima di registrare anche una leggera perdita di potenza. Il produttore stima che la batteria possa funzionare per 60 giorni, a partire da una carica completa. Per studi prolungati (>30 giorni), si consiglia di avere alimentatori di ricambio completamente carichi per ruotarli quando la durata della batteria dell'alimentatore è inferiore al 50% della carica massima.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Jason Lê è supportato dal programma di formazione alla ricerca post-diploma di maturità finanziato dal National Institutes of Health.