Система «сделай сам» для регулярного кормления лабораторных грызунов в их домашней клетке

В этой статье подробно описывается конструкция, сборка и протокол автоматизированной системы кормления, а также альтернативная модификация крышки и клетки, которая может быть реализована на стандартных клетках для грызунов с минимальными изменениями для экспериментов по привязной оптогенетике или фотометрии волокон. Система кормления представляет собой экономичный инструмент для временного кормления и/или ограничения калорий.

Прерывистое голодание и исследования, посвященные влиянию временного ограничения калорий на регуляцию массы тела и результаты старения, имеют тенденцию как в обществе, так и в лаборатории. Для изучения ограниченного по времени кормления и/или ограничения калорий в лабораторных условиях отведенное количество пищи распределяется через запланированные промежутки времени. Современные технологии запланированного кормления грызунов включают в себя либо специализированные клетки с закрытыми входными отверстиями для корма, цифровые бункеры с временной блокировкой, либо ручную доставку корма. Специализированное оборудование для таких экспериментов может быть дорогостоящим, а ручная подача часто требует, чтобы исследователи приходили поздно ночью / ранним утром, что исключает длительные исследования. Описанная здесь автоматизированная система кормления представляет собой экономичный инструмент для временного кормления и/или ограничения калорий, который может быть реализован в стандартных клетках для грызунов с минимальными модификациями. В протоколе используется готовая автоматическая кормушка, которая устанавливается на стандартную крышку микроизолятора клетки (крышка клетки для мыши, хомяка, крысы или морской свинки) и может давать желаемую порцию пищи через запрограммированные промежутки времени в домашней клетке животного. Наша конструкция может быть изменена для работы с различными кормушками или небольшими изменениями в размерах клетки. Мы обеспечиваем проектирование, сборку и протокол для системы кормления, а также альтернативную модификацию крышки и клетки для экспериментов с привязной оптогенетической или фотометрией волокон.

Прерывистое голодание является важной областью исследований в области метаболизма и старения. Правильное выравнивание кормления и циркадного ритма может изменить влияние диеты на массу тела 1,2,3,4. Кроме того, длительное прерывистое голодание связано с увеличением продолжительности жизни и улучшением возрастных расстройств 5,6,7,8. Научные исследования, проводящие долгосрочные протоколы голодания (>20 дней), обычно требуют специализированного оборудования. Несмотря на то, что можно доставлять еду вручную в соответствии с запланированными протоколами кормления, для этого может потребоваться присутствие следователя в течение длительного периода времени в нерабочее время. Например, для трех кормлений с интервалом в 4 часа потребуется ручная доставка в 8:00 вечера, 12:00 и 4:00 утра; Вероятно, проблема с соблюдением нормативных требований будет сохраняться более нескольких дней.

Альтернативой ручной доставке пищи для лабораторных грызунов являются: 1) специализированные клетки с автоматическим доступом к пище или 2) цифровые системы бункеров, обеспечивающие автоматизированный и программируемый доступ к пище, такие как FED3⁹. Клеточные системы с закрытым доступом к пище стоят дорого, и некоторые из них не обеспечивают подходящих домашних условий для долгосрочных исследований. Например, традиционные футляры для оперантного кондиционирования способны автоматизировать доставку еды, но имеют пол с проволочной решеткой, который не способствует долгосрочному содержанию. Система BioDAQ от Research Diets обеспечивает подачу пищи и воды через закрытые внешние порты. Программируемые автоматические ворота позволяют проводить долгосрочные исследования кормления или питья по расписанию, однако эта система является дорогостоящей инвестицией. Механизированные бункерные системы являются еще одним инструментом для автоматизации протоколов плановой подачи ^9,10. Два упомянутых механизированных бункера поставляются с оговоркой об уменьшении жилой площади в домашней клетке. Голодные животные, ограниченные в пище, могут жевать устройства для кормления и/или мусор клетки может мешать механике бункера при длительных исследованиях. Наконец, механизированный бункер, разработанный исследовательской группой Такахаси совместно с компанией Phenome Technology, был специально разработан для^{долгосрочных исследований по} планированию кормления. В этой системе механизированный бункер расположен над решеткой стандартной клетки с желобом, который подает пищу. Система Phenome, однако, не обеспечивает гибкости для животных, привязанных к патч-кабелю (эксперименты по оптогенетике/фотометрии волокон), и она относительно дорога по сравнению с описанным здесь устройством автоматической подачи.

В ответ на преобладающие проблемы, связанные с протоколами запланированного кормления, мы предлагаем экономически эффективное решение. Наша автоматизированная система обеспечивает точную доставку еды через заданные промежутки времени. С помощью комбинации деталей, напечатанных на 3D-принтере, вместе с коммерчески доступной автоматической кормушкой для рыб, мы разрабатываем внешнюю систему кормления «сделай сам» (DIY), которая может быть установлена на отдельных клетках для грызунов с микроизоляторами. Описанная здесь система кормления и детали могут быть непосредственно применены к любой из следующих клеток для грызунов: мыши, крысы, хомяка или морской свинки, при условии, что в отдельно стоящих клетках используются микроизоляторы. Поскольку клетки различаются по размеру, их размещение может немного отличаться, но напечатанные на 3D-принтере кронштейны, система кормления и конструкция внешней бутылки для воды обычно применимы к автономным клеткам для грызунов с крышками микроизоляторов.

Мы описываем один пример автоподачи, но доступно множество других готовых автоподачи, которые могут быть установлены в модульную систему с небольшими изменениями в деталях, напечатанных на 3D-принтере. Чтобы упростить настройку напечатанного на 3D-принтере держателя в соответствии с альтернативными устройствами подачи или небольшими изменениями размеров клетки, мы проверяем изменяемый трехмерный файл SolidWorks с сопутствующим STL-файлом.

Внешнее расположение автоматической кормушки обеспечивает полное пространство в домашней клетке и позволяет отсоединять, стерилизовать, а также перезагружать или заменять кормушку без нарушения работы животного. Автоматизированная система кормления эффективна для долговременных записей, доступна по цене и поддается различным протоколам ограниченного по времени кормления и/или ограничению калорий. Мы предоставляем подробные технические чертежи клеточных сборок, дизайн и протокол реализации системы кормления, а также данные образцов. Во-вторых, мы предоставляем набор инструкций по модификации стандартной клетки для использования автокормушки с животными, привязанными к патч-кабелю для экспериментов по оптогенетике или оптоволоконной фотометрии.

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях Массачусетского университета в Амхерсте.

1. Установка автопитателя на стандартную крышку клетки микроизолятора (Рисунок 1)

1. С помощью вращающегося инструмента с отрезным кругом 1,5 дюйма вырежьте квадрат размером 20 x 25 мм в крышку микроизолятора. Расположите отверстие на расстоянии 2,75 см от края крышки и по центру над решеткой (рис. 1B, слева).
2. Напечатайте на 3D-принтере кронштейн для соединения автоподающего устройства с крышкой клетки (Рисунок 1A и Дополнительный файл 1). Защелкните кронштейн на отверстии крышки клетки (шаг 1.1; Рисунок 1B, в центре) и сдвиньте автоподатчик на верхнюю часть закрепленного кронштейна (Рисунок 1B [справа], C).

Рисунок 1: Модификация и сборка кронштейна автоподачи-автокорма и крышки клетки. (A) Технический чертеж кронштейна автоподачи-автокорма (масштаб в 3D см. в файлах SolidWorks/STL в Дополнительном файле 1 ). (B) Слева направо крышка клетки с отверстием 20 x 25 мм; кронштейн установлен на верхней части клетки и смонтирован с автокормушкой Petbank. (В) Собранный автокормушка Petbank на клетку с пищевой гранулой опускается на штатную решетку с бутылкой с водой. Масштабные линейки = 25 см). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Программирование и использование примера готового автопитателя

1. Для экспериментов с ограничением по времени сначала установите время кормления, а синхронизированные часы питателя — последними, так как последующие корректировки сместят время.
2. Убедитесь, что кормушка достаточно заряжена. Нажмите и удерживайте кнопку «Настройки », пока часовая настройка на экране не начнет мигать.
3. Перейдите к настройке времени . С помощью стрелок вверх и вниз отрегулируйте время до первого желаемого запланированного периода кормления.
4. Задайте количество выделений для этого момента времени (указывается количеством точек рядом с настройкой ленты). Повторите шаги 2.2-2.4, еще до двух временных точек.
5. Загрузите в камеры автокормушки желаемое количество пищи в количестве ≤1,5 г стандартного корма для грызунов. Если требуется больше корма, настройте кормушку на доставку нескольких участков в определенный момент времени. Пример питателя имеет 16 камер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Еду можно заказать по размеру или обрезать ножницами.
6. Пометьте одну камеру скотчем или краской для подтверждения запрограммированного вращения камеры и подачи пищи. Проверяйте ежедневно во время работы кормушек.

3. Модифицированная система посадки в клетку для привязанных животных с автокормушкой

1. Дополнительная сменная вставка крышки для животных, привязанных к патч-корду (Рисунок 2)
   1. Вырежьте лазером кусок прозрачного акрила толщиной 3 мм в соответствии со спецификациями, приведенными на рисунке 2A (см. также Дополнительный файл 2). Акриловая вставка имеет выступы для защелкивания в верхней части клетки. Центральная щель (190 x 5 мм) позволяет пропустить патч-кабель. Квадратное отверстие 20 x 25 мм подходит для кронштейна автоподачи; 20 вентиляционных отверстий обеспечивают циркуляцию свежего воздуха.
   2. С помощью отвертки с плоской головкой или клинового инструмента подденьте верхнюю крышку с перфорированной клеткой стандартной крышки микроизолятора. Освободите язычки из пазов для вкладок и снимите перфорированный вкладыш и фильтровальную бумагу (рисунок 2C, слева и в центре).
   3. Под перфорированной верхушкой и фильтровальной бумагой находится внутренняя ребристая опорная сетка. Используйте вращающийся инструмент и режущий круг 1,5 дюйма, чтобы снять опорную решетку; следуя стрелочным индикаторам, показанным в центре рисунка 2C. После резки снять опорную сетку, подпилить сглаженный край среза.
   4. Защелкните сменную вставку из акриловой пластины (шаг 3.1) в верхнюю часть клетки. Начните установку, вставив выступы пластины в пазы по одному из коротких краев, а затем по одному из длинных краев и осторожно надавите, пока пластина не встанет на место (рисунок 2C [справа], D).
2. Дополнительный внешний кронштейн для бутылки с водой для животных, привязанных к патч-корду (Рисунок 3)
   1. Просверлите отверстие для сипла для бутылки с водой: отверстие диаметром 11 мм, на высоте 50 мм от пола, по центру короткого края клетки (Рисунок 3B и Дополнительный файл 3).
   2. По обе стороны от центрального отверстия (± 27,5 мм) просверлите два отверстия диаметром 6 мм. При необходимости используйте инструмент для сверления квадратных отверстий диаметром 8 мм (показано на рисунке 3B).
   3. 3D-печать внешнего кронштейна для бутылки с водой (Рисунок 3A и Дополнительный файл 4). Закрепите кронштейн для бутылки с водой на дне клетки с помощью болтов каретки (длина 2 см, 6 x 1 мм или длина 0,75 дюйма 1/4 x 20; Рисунок 2B, C).
   4. Для бутылки с водой установите стандартную коническую трубку объемом 50 мл, закрытую узлом сиппер/пробка (#7 Стоппер с изогнутым сиппером 3-1/2 дюйма, см. Таблицу материалов) на внешнем кронштейне. Пополняйте воду каждые 2-3 дня.

Рисунок 2: Монтаж акриловой пластины на верхнюю часть клетки. (А,Б) Технические чертежи акриловой пластины и заглушки порта подачи. (C) Левая, стандартная верхняя часть каркаса с перфорированной вставкой и фильтром. По центру, удаление перфорированной вставки и фильтра (ребристая сетка должна быть вырезана по линиям, указанным стрелками). Справа, акриловая пластина встала на место. (D) Полная сборка крышки. Масштабные линейки = 25 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Сборка кронштейна для бутылки с водой. (A) Технический чертеж кронштейна для бутылки с водой, напечатанного на 3D-принтере. (B) Модификации клетки и сборка кронштейна для бутылки с водой; (C) Установлен кронштейн; (D) Сборка клетка в сборе. Масштабные линейки = 10 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Краткое описание полной сборки клетки с автоматической кормушкой. (A) Стандартная клетка с решеткой, (B) модифицированная клетка для привязанных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Исследование по ограничению калорий (21 день) для индуцирования бесплодия у самок мышей (конструкция автокормушки и клетки, рисунок 4A)
Хронический дефицит энергии достаточен для подавления фертильности у млекопитающих, реакция, которая сохраняется как у грызунов, так и у человека^11,12. В этом исследовании мы использовали ограничение калорий, чтобы вызвать долгосрочную потерю массы тела. Взрослые самки мышей C57BL/6 в возрасте 15-18 недель содержались в одиночном помещении и работали по циклу 12:12 ч свет:темнота, с выключением света в 12 часов по времени Zeitgeber (ZT12). Решетка с кормом взвешивалась ежедневно для каждого животного с интервалом в неделю для установления исходного уровня потребления пищи, 3,80 ± 0,64 г/день (в среднем ± SE). Затем еда была ограничена, чтобы вызвать потерю веса. Корм был разделен на три порции и распределен автоматической кормушкой через три интервала: ZT 12, 16 и 20 (конфигурация клетки, рисунок 4A). В течение первых 48 ч животные были ограничены до 50% от исходного потребления пищи. Затем животные были ограничены до ~70% от исходного уровня корма в течение следующих 19 дней, с небольшими корректировками во второй половине ограничения для поддержания 80-90% от исходного веса (Рисунок 5A, внизу).

Между ZT 0 и ZT 1 животных взвешивали и оценивали стадию овуляторного цикла путем гистологической характеристики клеток, собранных с помощью вагинального лаважа с 0,1 М фосфат-буферным раствором. Продолжительность цикла контролировалась в течение не менее 11 дней до и во время потери 80-90% веса. Устойчивая потеря веса более чем на 10% была достаточной для того, чтобы вызвать бесплодие у самок мышей, как было опубликовано^{ранее 11}.

Автоматические кормушки ежедневно осматривались на предмет правильного вращения и доставки пищи (шаг протокола 3.1). Любая еда, оставленная на земле или на решетке, была выброшена. Пример питателя, показанный здесь, имеет 16 камер и может быть настроен на подачу пищи через три интервала (см. Таблицу материалов). Мы определили, что максимальный объем чау-чау, который помещается в камеру, составляет 2 г, которые можно нарезать или заказать по размеру. Мы также определили, что доставка еды занимает ~10 секунд после достижения запрограммированного времени. Требуется 7 секунд, чтобы затвор пола полностью открылся, а затем еще 3 секунды для того, чтобы камера переместилась через отверстие, выдавая пищевую гранулу. Есть шумы, которые совпадают с открытием ворот и падением гранул еды на пустую решетку (Видео 1, со звукозаписью).

В течение 21 дня мы наблюдали полную точность вращений и подачи корма с помощью этой конкретной кормушки от Petbank (Table of Materials). На момент тестирования устройства питания находились в диапазоне от 3 до 6 месяцев с момента их первоначального использования, а внутренние аккумуляторные батареи сохраняли полные показания заряда в течение всего 21-дневного испытания. Поскольку это была относительно небольшая выборка кормильцев (n = 4), мы впоследствии провели еще одно 21-дневное исследование с 10 автоматическими кормушками, настроенными на раздачу пищи с одинаковой скоростью. Последующее исследование проводилось через 10 месяцев после первоначального использования кормушек. В течение 21-дневного испытания один фидер потерял одну штангу мощности (~25% потери мощности) на 15-й день, а другой потерял одну штангу на 17-й день, в то время как остальные 8 питателей имели показания полной зарядки в течение всего 21 дня. Уровень мощности на примере фидера указан как четыре деления. Наша количественная оценка предполагает, что каждый стержень представляет 25% мощности. Как и в нашем первоначальном тесте, кормушки в последующем исследовании снова безошибочно выполняли вращение и подачу пищи на протяжении всего исследования.

Рисунок 5: Траектория массы тела с наложенными данными о цикле течки у самок мышей во время ограничения калорий с использованием автокорма. (A) Средняя траектория потери веса (внизу) с использованием автокормушки для доставки 50-70% от исходного уровня потребления пищи в течение трех временных точек (с интервалом 4 часа, начиная с выключения света). Репрезентативные данные об эстральном цикле, совмещенные с потерей веса (вверху). Серый цвет указывает на потерю веса более чем на 10% от начального веса. Стрелка указывает на возврат к доступу к пище ad libitum путем заполнения решетки кормом и снятия автоматической подачи. (Б) Эстральный цикл во время похудения; Внутрисубъектное сравнение % времени пребывания в диэструсе при потере веса животными от 1% до 10% (открытый бар) против >10% потери веса (серая полоса; примечание: остановка в диэструсе является признаком бесплодия) n = 4. (C) Каскадный график потери веса в сравнении с ездой на велосипеде. При потере веса до 8% 100% животных были фертильными и цикличными, в то время как при потере веса до 20% 100% животных были ацикличными и бесплодными. Сокращения: P = proestrus; E = течка; D = диэструс. Полосы погрешностей представляют собой стандартную погрешность среднего значения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Шумы, указывающие на открытие ворот и падение гранул с едой на пустую решетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительный файл 1: Zip-файл, содержащий технический чертеж и файлы SolidWorks + STL для кронштейна автоподачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Технический чертеж акриловой пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Zip-файл, содержащий технический чертеж и файлы SolidWorks + STL для разъема порта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Zip-файл, содержащий технический чертеж, файлы SolidWorks + STL для кронштейна для бутылки с водой и держателя для бутылок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

В доклинических моделях на животных ограничение калорий является мощным экспериментальным инструментом для точного манипулирования и изучения метаболизма. Устойчивая потеря веса имеет последствия для ожирения, диабета, старения, фертильности и менопаузы (тип репродуктивного старения), которые являются важными трансляционными конечными точками. Однако парадигмы ограничения калорий может быть трудно поддерживать в течение длительного времени. В этой рукописи мы предлагаем экономически эффективное решение для достижения долгосрочного ограничения калорий в лабораторных условиях. В комплект входят инструкции по подключению готовой автоматической кормушки к клетке для грызунов со стандартной крышкой микроизолятора. Кормушка собирается в домашней клетке животного и запрограммирована на доставку корма в запланированное время. Запланированная доставка еды контролирует количество и время доступа к еде и не требует входа обработчика в помещение. Кроме того, экономически эффективная система может работать в течение длительного периода времени (месяцев), улучшая возможность достижения долгосрочного ограничения калорий в лабораторных условиях.

Последние достижения в области нейробиологии позволяют исследователям либо манипулировать, либо записывать нейроны, которые способствуют питанию бодрствующих животных. В частности, запись волоконной фотометрии (метод записи in vivo) питающихся нейронов была выполнена с последовательностью голодания, чтобы стимулировать нейронную активность, а затем повторного кормления, чтобы исследовать изменение нейронной активности 13,14,15. Хотя лучше всего проводить записи in vivo в домашней клетке^{животного 16}, они часто проводятся на внешней арене, чтобы обеспечить подвижность, будучи привязанной к патч-кабелю. Более того, на записи in vivo может влиять человек, входящий в комнату без возможности закрытого доступа к пище. Чтобы решить обе проблемы, связанные с фотометрической регистрацией нейронов в цепях кормления, мы разработали модификацию домашней клетки для содержания привязанных животных в течение длительного периода времени, которая подключена к автокормушке (разделы 3 и 4 протокола). Ограничением этого подхода является то, что для конструкции вставки крышки клетки требуется лазерный резак. В то время как для резки акриловой вставки можно использовать вращающийся инструмент и биговочное устройство, инструменты, скорее всего, не смогут создать небольшие выступы и тонкую щель.

Существуют ограничения описанной здесь системы кормления. А именно, для сборки требуются детали, напечатанные на 3D-принтере. Кроме того, часы в примере автокормушки работают по 24-часовому циклу, поэтому время доставки пищи для циркадных исследований должно быть вручную согласовано с периодом свободного бега животного¹⁷. Наконец, устройство ограничено 16 камерами и тремя запрограммированными временными интервалами. Кормушка раздает корм; Он не следит за потреблением. Пища, которая не употребляется в пищу в течение установленного времени, может быть извлечена с пола клетки или проволочной решетки, но могут быть ошибки при учете и извлечении несъеденной пищи.

Чтобы подчеркнуть преимущества коммерческой готовой автоматической кормушки, оснащенной стандартной клеткой для грызунов, мы показываем, что устройство удобно в использовании и выдает точную порцию корма через определенные промежутки времени. Эта система не загораживает зону домашней клетки. Поскольку кормушка расположена за пределами клетки животного и может быть легко отделена от напечатанного на 3D-принтере держателя, регулярное техническое обслуживание, пополнение корма и чистка могут выполняться с минимальными неудобствами для животного.

В качестве примера мы использовали автокормушку, чтобы вызвать ограничение калорий и, в конечном итоге, бесплодие. Мы продемонстрировали использование автоматической кормушки в 21-дневном исследовании по ограничению калорий (Рисунок 5) и впоследствии использовали кормушки для многочисленных экспериментов в лаборатории. Как видно из результатов, кормушки были надежными и точно доставляли пищу. Внутренняя аккумуляторная батарея, по-видимому, несколько уменьшается со временем, но после почти года использования питателей они работают не менее 15 дней, прежде чем регистрируют даже незначительную потерю мощности. По оценкам производителя, батарея может работать в течение 60 дней, начиная с полного заряда. Для длительных исследований (>30 дней) рекомендуется иметь полностью заряженные сменные питатели, которые будут вращаться, когда срок службы батареи питателя составляет менее 50% от максимального заряда.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Джейсон Ле получает поддержку в рамках программы научного образования после бакалавриата, финансируемой Национальным институтом здравоохранения.