Farelerde İnsitülin Klerensinin Yerinde Karaciğer Perfüzyonu ile Değerlendirilmesi

Hepatik insülin klerensi, glikoz homeostazını düzenlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, farelerde yerinde karaciğer insülin klerens oranını doğrudan değerlendirmek için kullanıcı dostu bir hepatik perfüzyon prosedürünü açıklamaktadır.

Hepatik insülin klerensi, glikoz homeostazını korumak için gereklidir ve obezite, insülin direnci ve diyabet gibi metabolik bozukluklarla yakından bağlantılıdır. İnsülin klerensinin doğru ölçümü, bu koşulların altında yatan mekanizmaları anlamak için hayati önem taşır. Bu protokol, farelerde hepatik insülin klerens oranını doğrudan değerlendirmek için özel olarak tasarlanmış basit ve kullanıcı dostu bir hepatik perfüzyon prosedürü sunar. Yöntem, fizyolojik koşulları taklit eden bir in situ perfüzyon sistemi oluşturmak için portal ven ve suprahepatik inferior vena kava'nın hassas kanülasyonunu içerir. Protokol, araştırmacılara cerrahi hazırlık ve perfüzyon sisteminin kurulumundan numune toplama ve analizine kadar prosedürün her aşamasında rehberlik eder. Ayrıntılı talimatların yanı sıra, temsili sonuçlar ve prosedürü optimize etmek için önemli ipuçları verilmiştir. Yazılı protokole eşlik eden, görsel olarak derinlemesine talimatlar ve çizimler sunan bir video eğitimi, onu hepatik insülin metabolizması ve klerensinin arkasındaki moleküler mekanizmaları araştıran bilim adamları için erişilebilir ve kapsamlı bir referans haline getirir.

İnsülinin keşfi, geçen yüzyılın kilometre taşlarından biri haline geldi. Metabolik dokularda insülin sentezinin, sekresyonunun ve fizyolojik fonksiyonlarının düzenlenmesi hakkında çok şey bilinmektedir. Bununla birlikte, insülin bozulması ve düzenleyici mekanizmalarına daha az odaklanılmıştır. İnsülin metabolizması, beta hücre fonksiyonu, insülin direnci (IR) veya duyarlılık ve insülin klerensi arasındaki etkileşim olarak anlaşılabilir. İnsülin sekresyonunun yanı sıra, hepatik insülin klerensi, periferik hedef dokulara ulaşmak için gerekli olan homeostatik insülin seviyesinin korunmasında ve uygun insülin etkisinin kolaylaştırılmasında çok önemli bir rol oynar¹. Çok sayıda çalışma, metabolik sendromda ve ayrıca tip 2 diyabet ^2,3, alkolsüz steatohepatit⁴ ve polikistik over sendromu⁵ gibi diğer durumlarda hiperinsülinemi patogenezinde önemli bir faktör olarak bozulmuş insülin klerensini tanımlamıştır. Bu nedenle, azalmış klerense sekonder hiperinsülinemi metabolik hastalığın patogenezinde rol oynayabilir. İnsülin klerensini iyileştiren stratejiler, bu bireylerde hiperinsülineminin olumsuz etkilerini tersine çevirme potansiyeline sahiptir.

İnsülinin kendine özgü bir dağılım şekli vardır. Dolaşımdaki plazma insülin seviyesi, insülinin sekresyonu ve uzaklaştırılması arasındaki dengeye bağlıdır. Pankreas, portal ven içine pulsatil bir şekilde insülin salgılar ve onu hepatositlere yönlendirir. İnsülin salgısı ile ilk karşılaşan organ olan karaciğer, ilk geçişi sırasında insülinin çoğunu bozar ve toplam insülinin %60-70'ini oluşturur⁶. Kalan insülin, karaciğerden hepatik ven yoluyla çıkar ve sistemik dolaşıma girer, burada kısmen periferik dokular (öncelikle kas, yağ dokusu ve böbrekler) tarafından kullanılır ve hepatik arterden ikinci geçişi sırasında karaciğer tarafından daha fazla ekstrakte edilir⁷.

İnsülin klerensinin hassas ölçümü çok önemlidir. İnsan çalışmalarında hepatik insülin klerensini doğrudan ölçmek zordur çünkü portaldan ve hepatik damarlardan kan örnekleri almak zordur. İnsanlarda ve hayvan modellerinde insülin klerensini tahmin etmek için hem doğrudan hem de dolaylı yöntemler kullanılır. İnsülin klerensini dolaylı olarak ölçmek için yaklaşık üç strateji kullanılır. Klinik uygulamada en sık kullanılan değerlendirmeler, C-peptid / insülin molar oranına dayanan yöntemleri içerir⁸. Bu yaklaşım, her iki peptitin eşmolar salgılanmasına ve karaciğer⁹ tarafından C-peptit ekstraksiyonunun olmamasına dayanır. İkinci grup yöntemler, hormonun dolaşıma bilinen ve spesifik bir girişinden sonra insülinin plazma bozunma eğrilerinin matematiksel analizine dayanır ^2,10,11. Üçüncü yöntem, insülinin sabit bir oranda infüzyonunun, kandaki hormonun stabil seviyelerine yol açması ve çıkarma oranının uygulama oranıyla¹² eşleşmesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu dolaylı yöntemler öncelikle vücuttaki genel insülin klerensini yansıtır. Karaciğerin insülin klerensinin birincil bölgesi olduğu ve bu süreçte çok önemli bir rol oynadığı göz önüne alındığında, hepatik insülin klerensinin doğrudan değerlendirilmesi önemlidir.

Önceki çalışmalar, sağlıklı köpeklerde hepatik insülin ekstraksiyonunu doğrudan ölçmüştür^13,14. Çalışmalar ayrıca karaciğerden insülin ekstraksiyonunu değerlendirmek için izole edilmiş bir perfüze sıçan karaciğeri modeli kullanmıştır^15,16. Genetik olarak değiştirilmiş suşların yüksek mevcudiyeti nedeniyle, fareler moleküler yolları araştırmak için değerli modeller olarak hizmet eder. Birkaç çalışma¹⁷, bir fare modelinde hepatik insülin klerensini doğrudan değerlendirmek için karaciğer perfüzyonunu kullanmıştır. Bu çalışmalarda, insan insülini içeren bir perfüzat portal ven içine infüze edilir ve inferior vena kavadan toplanır. Karaciğer tarafından emilen insülin oranı, klirensini gösterir. Karaciğer perfüzyon tekniği, karaciğer damar sistemi boyunca ılık, oksijenli ve besin açısından zenginleştirilmiş bir perfüzat dolaştırarak karaciğeri fizyolojik koşullara yakın koşullar altında tutar. Bununla birlikte, bu tekniği ilerletmek ve yaymak için yeterli pratik rehberlik ve temel ipuçları yoktur.

Bu nedenle, hepatik insülin klerensi artan bir ilgi görürken, bozukluklardaki rolü ve moleküler mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır¹⁸. Bu nedenle, bilimsel araştırma alanında ileri tekniklere büyük ölçüde ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, hepatik insülin klerensini değerlendirmek için farelerde ayrıntılı bir modifiye hepatik perfüzyon prosedürü oluşturur. Ek olarak, bu yöntem, ilk geçiş etkisi, ilaç taşıma süreçleri ve diğer çeşitli yönler dahil olmak üzere ilaçların karaciğer üzerindeki etkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Bu protokol Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC-2105018) tarafından onaylandı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini takip etti. Tüm C57BL / 6N fareleri, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu. Altı haftalık fareler rastgele bir Chow diyeti (CD) grubuna ve bir Yüksek yağlı diyet (HFD) grubuna ayrıldı. HFD grubu %60 oranında yüksek yağlı bir diyetle beslendi ve bu diyete 10 haftalık olana kadar devam etti. Ortalama vücut ağırlığı HFD grubu için 28.55 g ± 1.2 g ve kontrol grubu için 24.3 g ± 0.48 g idi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hazırlık

1. Otoklavlama yoluyla cerrahi aletlerin ve sarf malzemelerinin gerekli sterilizasyonunu gerçekleştirin.
2. Cerrahi aletleri, 6-0 ipek dikiş, steril küçük pamuk aplikatörü, sodyum klorür enjeksiyonu (500 mL), pamuklu çubukları ve süngerleri ameliyat masasına uygun şekilde yerleştirin.
3. Nihai konsantrasyon 200 IU / mL olan 30 mL heparinize salin hazırlayın.
4. İç çapı 0,31 mm ve dış çapı 0,64 mm olan iki silikon tüp hazırlayın; Biri portal ven kateteri olarak kullanım için 4 cm uzunluğunda, diğeri inferior vena kava kateteri olarak kullanım için 10 cm uzunluğundadır.
5. 5.0 mmol/L glikoz ve %0.25 BSA içeren Krebs-Henseleit (KRBH) perfüzyon tamponunu hazırlayın.
6. 5.0 mmol/L glikoz, %0.25 BSA ve 4.0 ng/mL insan insülini içeren Krebs-Henseleit (KRBH) perfüzyon tamponunu hazırlayın.
7. Karaciğer perfüzyon sistemini kurun. Şekil 1 , karaciğer perfüzyon sisteminin ana bileşenlerini göstermektedir.

2. Cerrahi kateterizasyon

1. Aşağıdaki adımları izleyerek anestezik karışımı hazırlayın:
   1. Zoletil 50'yi (250 mg / 5 mL)% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile 10 kez seyreltin.
   2. Ksilazin hidroklorürü (200 mg / 2 mL)% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile 10 kez seyreltin.
   3. % 0.5 Zoletil 50 çözeltisini% 1 Ksilazin hidroklorür çözeltisi ile 1: 1 oranında karıştırın.
2. Fareleri uyuşturun.
   1. Farenin vücut ağırlığını kontrol edin ve kaydedin. Anestezik karışımı, 5 mL / kg vücut ağırlığı (2.5 mg / mL Zoletil 50; 5 mg / mL Ksilazin hidroklorür) dozunda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulayın. Anestezinin başlangıcı tipik olarak enjeksiyondan 5-10 dakika sonra ortaya çıkar, bu da doğrultma refleksinin kaybı ve dış uyaranlara yanıtın azalması ile gösterilir.
   2. Fareyi çalışma masasına aktarın. Uzuvları yapışkan bant kullanarak sabitleyin. Heparinizasyon sağlamak için intraperitoneal olarak 2.5 U / g heparin uygulayın.
   3. Karın derisindeki kürkü kesmek için elektrikli bir tıraş makinesi kullanın ve bölgeyi bir povidon-iyot çözeltisi ile dezenfekte edin.
3. Portal ven kateterizasyonu gerçekleştirin.
   1. Alt karın bölgesinden orta karın çizgisi boyunca ksifoid sürecine doğru 4 cm uzunlamasına bir kesi yapın. İç organlara zarar vermemek için peritonu makasla dikkatlice kesin. Cerrahi alanı ortaya çıkarmak için fare abdominal ekartörünü yerleştirin.
   2. Portal veni, sağ böbreği ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarmak için bağırsakları sağa doğru hareket ettirin (Şekil 2A). Böbreğin üst kenarındaki vena kava'yı klemplemek için arter forseps kullanın.
   3. Portal veni izole edin (Şekil 2A) ve distal ucu 6-0 ipek sütür ile bağlayın. Açıkta kalan damarın proksimal ucuna gevşek bir şekilde başka bir dikiş atın.
   4. Yaylı makasla bağlanan uca yakın bir kesi yapın ve kateteri yerleştirin. Kateteri insizyondan portal bifurkasyon seviyesine kadar ilerletin.
   5. Her iki bağı da kateterin etrafına sabitleyin ve kateterin serbest ucunu bir örnekleme şırıngasına bağlayarak uygun örneklemeyi onaylayın. Heparinize salin ile yıkayın ve kateteri klempleyin (Şekil 2C).
   6. Çekiş cihazını çıkarın ve bağırsakları sıfırlayın. Cerrahi bölgeyi tuzlu suya batırılmış steril gazlı bez veya pamukla örtün.
4. Suprahepatik inferior vena kava kateterizasyonu yapın.
   1. Sternumu açığa çıkaran ksifoid işleminden sternum boyunca bir kesi yapın.
   2. Sternumu dikey olarak kesin, açın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburga kenarı boyunca diyaframı kesin.
   3. Suprahepatik inferior vena kava'yı açığa çıkarın ve izole edin (Şekil 2B). Distal ucu 6-0 ipek sütür ile dikkatlice bağlayın. Damarın proksimal ucuna gevşek bir şekilde başka bir dikiş atın.
   4. Yaylı makasla bağlanan ucun hemen altından bir kesi yapın ve 10 cm'lik bir kateter yerleştirin. Kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri ilerletin ve her iki ligatürü de güvenli bir şekilde bağlayın. Uygun örneklemeyi onaylayın ve kateterin serbest ucunu klempleyin (Şekil 2D).
   5. Cerrahi bölgeyi tuzlu su çözeltisi ile durulayın. Yüzeyi tuzlu suya batırılmış steril gazlı bezle örtün.

3. Karaciğer perfüzyonu

1. Hayvan bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak aşırı dozda anestezik ve torakotomi kullanarak fareye ötenazi yapın ve tüm prosedürlerin acıyı en aza indirecek şekilde yapıldığından emin olun.
2. Şekil 1'de gösterildiği gibi bir oksijenatör, bir sıcaklık modülasyon cihazı, bir infüzyon pompası ve infüzyon tüpleri içeren karaciğer perfüzyon sistemini kurun.
3. Oksijenatöre sürekli %95 oksijen ve %5 karbondioksit gaz akışı sağlayın.
4. Su banyosunu açın ve organ haznesini 37 °C'ye ısıtın.
5. KRBH perfüzyon tamponunu insülinli ve insülinsiz hazırlayın. Boru sistemini 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edilmiş perfüzyon tamponu ile astarlayın.
   NOT: KRBH, BSA ve glikoz içermez. İnsan insülini içermeyen KRBH perfüzyon tamponu 5.0 mmol/L glikoz ve %0.25 BSA içerirken, insan insülini içeren KRBH perfüzyon tamponu 5.0 mmol/L glikoz, %0.25 BSA ve 4.0 ng/mL insan insülini içerir.
6. Fareyi, ortam sıcaklığı yaklaşık 37 °C'de tutulan bir kaba yerleştirin. Vücut ısısını 37 °C'de tutmak için bir ısıtma pedi kullanın.
7. KRBH tamponunu portal ven kateterinden infüze edin. İnfüzyon hızını bir mini pompa ile 0.2 mL / dk'ya ayarlayın.
8. Karaciğerin saniyeler içinde soluklaştığını gözlemleyin, bu da perfüzyon tamponunun karaciğerden aktığını gösterir. Karaciğerde kalan daha fazla kan hücresini temizlemek için, perfüzyonun başlangıcında zamanlamayı başlatarak infüzyonu 4 dakika ve 8 dakikalık zaman noktalarında 1 dakika duraklatın.
9. Karaciğeri KRBH tamponu ile toplam 10 dakika (iki 1 dakikalık duraklama hariç) perfüze edin, bu da dengeleme süresini temsil eder. Bazal numuneyi inferior vena kava kateterinden toplayın.
10. Karaciğeri insülin (4.0 ng/mL insan insülini) ile zenginleştirilmiş aynı solüsyonla 30 dakika daha perfüze edin.
11. İnferior vena kava tüpünden tüm örnekleri her 2 dakikada bir toplayın.
12. Perfüzyondan sonra karaciğer ağırlığını kaydedin. Farklı loblardan karaciğer örnekleri toplayın, hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından saklamak için -80 ° C'ye aktarın.
13. Toplanan tüm perfüzyon örneklerini ~ 1.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantları toplayın ve depolama için -80 °C'ye aktarın.
    NOT: Perfüzyon örneklerindeki insülin konsantrasyonu, insan insülin enzimine bağlı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanılarak ölçülür.
14. İşlem sonrası, tüm biyolojik atıkların güvenlik yönetmeliklerine göre bertaraf edildiğinden emin olun.

4. Veri analizi

1. Verileri, zaman içindeki insülin konsantrasyonu çıktısını gösteren XY grafiklerinde sunun.
2. Aşağıdaki formülü kullanarak ortalama hepatik insülin klerens oranını (HICR_AVE) hesaplayın:
   HICR_AVE = (1−C_f/C_i) × %100
   burada C_i = infüzyon tamponunun ilk insülin konsantrasyonu, C_f = suprahepatik inferior vena kavadan son 10 dakikadaki nihai ortalama insülin konsantrasyonu.

Bu protokol, hepatik insülin klerensini doğrudan hesaplamak için karaciğer infüzyonu prosedürünü ana hatlarıyla belirtir. Bu model güvenilir ve tekrarlanabilir. Bir deneyden elde edilen sonuçların bir örneği Şekil 3'te gösterilmiştir. 10 dakikalık bir dengeleme periyodundan sonra, 4.0 ng / mL insan insülini ile takviye edilmiş KRBH tamponu, portal venden 30 dakika boyunca perfüze edildi. Suprahepatik inferior vena kavadaki kateterden 2 d...

Protokoldeki kritik adımlar
Yukarıda açıklanan cerrahi prosedürler, karaciğerde herhangi bir lezyon oluşturmamak için nazik bir özenle yapılmalıdır. Ayrıca, karaciğer damar damarı duvarının kırılgan yapısı, kanülasyon sırasında dikkatli bir şekilde ele alınmazsa delinmeye ve ardından kanamaya karşı savunmasız hale getirir. Bu protokolde kan damarlarına verilen zararı en aza indirmek için daha yumuşak silikon tüpler kullanılır. Ent?...

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82200948, 82270921, 82170882) tarafından desteklenmiştir.