Avaliação da depuração de insulina em camundongos por meio de perfusão hepática in situ

A depuração hepática da insulina é fundamental para regular a homeostase da glicose. Este artigo descreve um procedimento de perfusão hepática fácil de usar para avaliar diretamente a taxa de depuração da insulina hepática in situ em camundongos.

A depuração hepática da insulina é essencial para manter a homeostase da glicose e está intimamente ligada a distúrbios metabólicos, como obesidade, resistência à insulina e diabetes. A medição precisa da depuração da insulina é vital para entender os mecanismos subjacentes dessas condições. Este protocolo apresenta um procedimento de perfusão hepática simples e fácil de usar em camundongos, projetado especificamente para avaliar diretamente a taxa de depuração de insulina hepática. O método envolve a canulação precisa da veia porta e da veia cava inferior supra-hepática para criar um sistema de perfusão in situ que imita as condições fisiológicas. O protocolo orienta os pesquisadores em todas as etapas do procedimento, desde a preparação cirúrgica e configuração do sistema de perfusão até a coleta e análise de amostras. Instruções detalhadas são fornecidas, juntamente com resultados representativos e dicas importantes para otimizar o procedimento. Um tutorial em vídeo acompanha o protocolo escrito, oferecendo instruções e ilustrações visualmente detalhadas, tornando-o uma referência acessível e abrangente para cientistas que exploram os mecanismos moleculares por trás do metabolismo e depuração da insulina hepática.

A descoberta da insulina tornou-se um dos marcos do século passado. Muito se sabe sobre a regulação da síntese de insulina, secreção e suas funções fisiológicas nos tecidos metabólicos. No entanto, tem havido menos foco na degradação da insulina e seus mecanismos regulatórios. O metabolismo da insulina pode ser entendido como a interação entre a função das células beta, a resistência ou sensibilidade à insulina (RI) e a depuração da insulina. Juntamente com a secreção de insulina, a depuração hepática de insulina desempenha um papel crucial na manutenção do nível homeostático de insulina necessário para atingir os tecidos-alvo periféricos e facilitar a ação adequada da insulina¹. Vários estudos identificaram a depuração de insulina prejudicada como um fator crucial na patogênese da hiperinsulinemia na síndrome metabólica, bem como em outras condições, como diabetes tipo 2^2, esteato-hepatite não alcoólica⁴ e síndrome do ovário policístico⁵. Assim, a hiperinsulinemia secundária à depuração reduzida pode desempenhar um papel na patogênese da doença metabólica. Estratégias que melhoram a depuração da insulina têm o potencial de reverter os impactos desfavoráveis da hiperinsulinemia nesses indivíduos.

A insulina tem um padrão único de distribuição. O nível de insulina plasmática circulante depende do equilíbrio entre a secreção e a remoção de insulina. O pâncreas secreta insulina na veia porta de forma pulsátil, direcionando-a para os hepatócitos. Como o primeiro órgão a encontrar secreção de insulina, o fígado degrada a maior parte da insulina durante sua primeira passagem, respondendo por 60% a 70% do total de insulina⁶. A insulina remanescente sai do fígado pela veia hepática, entrando na circulação sistêmica, onde é parcialmente utilizada pelos tecidos periféricos (principalmente músculo, tecido adiposo e rins) antes de ser extraída pelo fígado durante sua segunda passagem pela artéria hepática⁷.

A medição precisa da depuração da insulina é crucial. Medir diretamente a depuração da insulina hepática em estudos em humanos é um desafio porque a obtenção de amostras de sangue das veias porta e hepática é difícil. Métodos diretos e indiretos são usados para estimar a depuração da insulina em humanos e modelos animais. Aproximadamente três estratégias são empregadas para medir a depuração de insulina indiretamente. As avaliações mais frequentemente utilizadas na prática clínica envolvem métodos baseados na relação molar peptídeo C/insulina⁸. Essa abordagem é fundamentada na secreção equimolar de ambos os peptídeos e na ausência de extração do peptídeo C pelo fígado⁹. O segundo grupo de métodos depende da análise matemática das curvas de decaimento plasmático da insulina após uma entrada conhecida e específica do hormônio na circulação ^2,10,11. O terceiro método baseia-se no fato de que a infusão de insulina a uma taxa constante leva a níveis estáveis do hormônio no sangue, onde a taxa de remoção coincide com a taxa de administração¹². Esses métodos indiretos refletem principalmente a depuração geral da insulina no corpo. Dado que o fígado é o principal local de depuração da insulina e desempenha um papel crucial nesse processo, é essencial avaliar diretamente a depuração da insulina hepática.

Estudos anteriores mediram diretamente a extração de insulina hepática em cães saudáveis ^13,14. Estudos também usaram um modelo isolado de fígado de rato perfundido para avaliar a extração de insulina do fígado^15,16. Devido à alta disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, os camundongos servem como modelos valiosos para investigar vias moleculares. Alguns estudos¹⁷ utilizaram a perfusão hepática para avaliar diretamente a depuração de insulina hepática em um modelo de camundongo. Nesses estudos, um perfusato contendo insulina humana é infundido na veia porta e coletado da veia cava inferior. A proporção de insulina absorvida pelo fígado indica sua depuração. A técnica de perfusão hepática mantém o fígado em condições quase fisiológicas, circulando um perfusado quente, oxigenado e enriquecido com nutrientes através da vasculatura hepática. No entanto, não há orientação prática suficiente e dicas essenciais para o avanço e disseminação dessa técnica.

Assim, embora a depuração hepática de insulina tenha recebido atenção crescente, seu papel nos distúrbios, bem como seus mecanismos moleculares, permanecem obscuros¹⁸. Portanto, técnicas avançadas são muito necessárias no campo da pesquisa científica. Este protocolo estabelece um procedimento detalhado de perfusão hepática modificada em camundongos para avaliar a depuração hepática da insulina. Além disso, esse método também pode ser usado para estudar os efeitos dos medicamentos no fígado, incluindo o efeito de primeira passagem, processos de transporte de medicamentos e vários outros aspectos.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing (IACUC-2105018) e seguiu as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Todos os camundongos C57BL / 6N foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas com livre acesso a comida e água. Camundongos de seis semanas de idade foram divididos aleatoriamente em um grupo de dieta Chow (CD) e um grupo de dieta rica em gordura (HFD). O grupo HFD foi alimentado com uma dieta rica em 60% de gordura e continuou com essa dieta até as 10 semanas de idade. O peso corporal médio foi de 28,55 g ± 1,2 g para o grupo HFD e 24,3 g ± 0,48 g para o grupo controle. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação

1. Realize a esterilização necessária de instrumentos cirúrgicos e consumíveis por meio de autoclavagem.
2. Coloque os instrumentos cirúrgicos, sutura de seda 6-0, aplicador de algodão pequeno estéril, injeção de cloreto de sódio (500 mL), cotonetes e esponjas adequadamente na mesa de operação.
3. Prepare 30 mL de solução salina heparinizada com uma concentração final de 200 UI / mL.
4. Prepare dois tubos de silicone com diâmetro interno de 0,31 mm e diâmetro externo de 0,64 mm; um de 4 cm de comprimento para uso como cateter de veia porta e o outro de 10 cm de comprimento para uso como cateter de veia cava inferior.
5. Prepare o tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KRBH) contendo 5,0 mmol / L de glicose e 0,25% de BSA.
6. Prepare o tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KRBH) contendo 5,0 mmol / L de glicose, 0,25% de BSA e 4,0 ng / mL de insulina humana.
7. Configure o sistema de perfusão hepática. A Figura 1 mostra os principais componentes do sistema de perfusão hepática.

2. Cateterismo cirúrgico

1. Prepare a mistura anestésica seguindo os passos abaixo:
   1. Dilua Zoletil 50 (250 mg / 5 mL) 10 vezes com solução de cloreto de sódio a 0,9%.
   2. Dilua o cloridrato de xilazina (200 mg / 2 mL) 10 vezes com solução de cloreto de sódio a 0,9%.
   3. Misture a solução de Zoletil 50 a 0,5% com a solução de cloridrato de xilazina a 1% na proporção de 1:1.
2. Anestesie os ratos.
   1. Verifique e registre o peso corporal do mouse. Administre a mistura anestésica por injeção intraperitoneal na dose de 5 mL / kg de peso corporal (2,5 mg / mL Zoletil 50; 5 mg / mL de cloridrato de xilazina). O início da anestesia geralmente ocorre dentro de 5 a 10 minutos após a injeção, indicado pela perda do reflexo de endireitamento e resposta reduzida a estímulos externos.
   2. Transfira o mouse para a mesa de operação. Prenda os membros com fita adesiva. Administre 2,5 U/g de heparina por via intraperitoneal para obter heparinização.
   3. Use um barbeador elétrico para aparar o pelo da pele abdominal e desinfete a área com uma solução de iodopovidona.
3. Realize o cateterismo da veia porta.
   1. Faça uma incisão longitudinal de 4 cm do abdômen inferior em direção ao apêndice xifóide ao longo da linha abdominal média. Corte cuidadosamente o peritônio com uma tesoura para evitar danos aos órgãos viscerais. Insira o afastador abdominal do rato para expor o campo cirúrgico.
   2. Mova os intestinos para a direita para revelar a veia porta, o rim direito e a veia cava inferior (Figura 2A). Use uma pinça de artéria para prender a veia cava na borda superior do rim.
   3. Isole a veia porta (Figura 2A) e ligue a extremidade distal com uma sutura de seda 6-0. Amarre frouxamente outra sutura na extremidade proximal do vaso exposto.
   4. Faça uma incisão perto da extremidade ligada com uma tesoura de mola e insira o cateter. Avance o cateter através da incisão até o nível da bifurcação portal.
   5. Prenda ambas as ligaduras ao redor do cateter e confirme a amostragem adequada conectando a extremidade livre do cateter a uma seringa de amostragem. Lave com solução salina heparinizada e clampeie o cateter (Figura 2C).
   6. Remova o dispositivo de tração e reinicie os intestinos. Cubra a área cirúrgica com gaze estéril embebida em solução salina ou algodão.
4. Realize cateterismo da veia cava inferior supra-hepática.
   1. Faça uma incisão ao longo do esterno a partir do processo xifóide, expondo o esterno.
   2. Corte verticalmente o esterno e corte o diafragma ao longo da margem da costela para expor a cavidade torácica.
   3. Expor e isolar a veia cava inferior supra-hepática (Figura 2B). Ligue cuidadosamente a extremidade distal com uma sutura de seda 6-0. Amarre frouxamente outra sutura na extremidade proximal do vaso.
   4. Faça uma incisão logo abaixo da extremidade ligada com uma tesoura de mola e insira um cateter de 10 cm. Avance o cateter até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado e amarre ambas as ligaduras com segurança. Confirme a amostragem adequada e clampeie a extremidade livre do cateter (Figura 2D).
   5. Enxágue a área cirúrgica com solução salina. Cubra a superfície com gaze estéril embebida em solução salina.

3. Perfusão hepática

1. Eutanasiar o camundongo usando uma overdose de anestésico e toracotomia de acordo com as diretrizes institucionais para cuidados e uso de animais, garantindo que todos os procedimentos sejam realizados de maneira a minimizar o sofrimento.
2. Configure o sistema de perfusão hepática, que inclui um oxigenador, um dispositivo de modulação de temperatura, uma bomba de infusão e tubos de infusão, conforme mostrado na Figura 1.
3. Forneça um fluxo contínuo de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono para o oxigenador.
4. Ligue o banho-maria e pré-aqueça a câmara do órgão a 37 °C.
5. Prepare o tampão de perfusão KRBH com e sem insulina. Preparar o sistema de tubagem com o tampão de perfusão incubado em banho-maria a 37 °C.
   NOTA: O KRBH é livre de BSA e glicose. O tampão de perfusão KRBH sem insulina humana contém 5,0 mmol/L de glicose e 0,25% de BSA, enquanto o tampão de perfusão KRBH com insulina humana contém 5,0 mmol/L de glicose, 0,25% de BSA e 4,0 ng/mL de insulina humana.
6. Coloque o mouse em um recipiente com a temperatura ambiente mantida em aproximadamente 37 °C. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.
7. Infundir o tampão KRBH através do cateter da veia porta. Defina a taxa de infusão em 0,2 mL / min por meio de uma mini bomba.
8. Observe que o fígado fica pálido em segundos, indicando que o tampão de perfusão está fluindo através do fígado. Para eliminar mais células sanguíneas restantes no fígado, pause a infusão por 1 minuto nos pontos de tempo de 4 e 8 minutos, iniciando o tempo no início da perfusão.
9. Perfundir o fígado com tampão KRBH por um total de 10 min (excluindo as duas pausas de 1 min), representando o período de equilíbrio. Colete a amostra basal do cateter da veia cava inferior.
10. Perfundir o fígado com a mesma solução enriquecida com insulina (4,0 ng/mL de insulina humana) por mais 30 min.
11. Colete todas as amostras do tubo de veia cava inferior a cada 2 min.
12. Registre o peso do fígado após a perfusão. Colete amostras de fígado de diferentes lóbulos, congele-as imediatamente em nitrogênio líquido e transfira para -80 ° C para armazenamento.
13. Centrifugue todas as amostras de perfusão coletadas a ~ 1.000 x g por 10 min a 4 ° C. Recolher os sobrenadantes e transferi-los para -80 °C para armazenamento.
    NOTA: A concentração de insulina em amostras de perfusão é medida usando kits de ensaio de imunoabsorção enzimática de insulina humana (ELISA).
14. Após o procedimento, certifique-se de que todos os resíduos biológicos sejam descartados de acordo com as normas de segurança.

4. Análise dos dados

1. Apresente os dados em gráficos XY mostrando a produção da concentração de insulina ao longo do tempo.
2. Calcule a taxa média de depuração da insulina hepática (HICR_AVE) usando a seguinte fórmula:
   HICR_AVE = (1−C_f/C_i) × 100%
   onde C_i = concentração inicial de insulina do tampão de infusão, C_f = concentração média final de insulina nos últimos 10 minutos da veia cava inferior supra-hepática.

Este protocolo descreve o procedimento de infusão hepática para calcular a depuração da insulina hepática diretamente. Este modelo é confiável e reprodutível. Um exemplo dos resultados obtidos de um experimento é mostrado na Figura 3. Após um período de equilíbrio de 10 minutos, o tampão KRBH suplementado com 4,0 ng/mL de insulina humana foi perfundido através da veia porta por 30 minutos. O líquido de perfusão foi coletado do cateter na veia...

Etapas críticas no protocolo
Os procedimentos cirúrgicos descritos acima devem ser realizados com cuidado suave para evitar a criação de lesões no fígado. Além disso, a estrutura frágil da parede do vaso da veia hepática a torna vulnerável a punções e sangramento subsequente se não for manuseada com cuidado durante a canulação. Tubos de silicone mais macios são utilizados neste protocolo para minimizar os danos aos vasos sanguíneos. Recomenda-se que o...

Nenhum conflito de interesse foi declarado.

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82200948, 82270921, 82170882).