Valutazione della clearance dell'insulina nei topi tramite perfusione epatica in situ

La clearance epatica dell'insulina è fondamentale per regolare l'omeostasi del glucosio. Questo articolo descrive una procedura di perfusione epatica di facile utilizzo per valutare direttamente il tasso di clearance dell'insulina epatica in situ nei topi.

La clearance epatica dell'insulina è essenziale per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio ed è strettamente legata a disturbi metabolici come l'obesità, l'insulino-resistenza e il diabete. Una misurazione accurata della clearance dell'insulina è fondamentale per comprendere i meccanismi alla base di queste condizioni. Questo protocollo presenta una procedura di perfusione epatica semplice e facile da usare nei topi, specificamente progettata per valutare direttamente il tasso di clearance dell'insulina epatica. Il metodo prevede l'incannulamento preciso della vena porta e della vena cava inferiore sopraepatica per creare un sistema di perfusione in situ che imita le condizioni fisiologiche. Il protocollo guida i ricercatori in ogni fase della procedura, dalla preparazione chirurgica all'impostazione del sistema di perfusione, fino alla raccolta e all'analisi dei campioni. Vengono fornite istruzioni dettagliate, insieme a risultati rappresentativi e suggerimenti importanti per ottimizzare la procedura. Un video tutorial accompagna il protocollo scritto, offrendo istruzioni e illustrazioni visivamente approfondite, rendendolo un riferimento accessibile e completo per gli scienziati che esplorano i meccanismi molecolari alla base del metabolismo e della clearance dell'insulina epatica.

La scoperta dell'insulina è diventata una delle pietre miliari del secolo scorso. Molto si sa sulla regolazione della sintesi dell'insulina, della secrezione e delle sue funzioni fisiologiche nei tessuti metabolici. Tuttavia, c'è stata meno attenzione alla degradazione dell'insulina e ai suoi meccanismi regolatori. Il metabolismo dell'insulina può essere inteso come l'interazione tra la funzione delle cellule beta, la resistenza o sensibilità all'insulina (IR) e la clearance dell'insulina. Oltre alla secrezione di insulina, la clearance insulinica epatica svolge un ruolo cruciale nel mantenere il livello omeostatico di insulina necessario per raggiungere i tessuti bersaglio periferici e facilitare la corretta azione dell'insulina¹. Diversi studi hanno identificato la ridotta clearance dell'insulina come un fattore cruciale nella patogenesi dell'iperinsulinemia nella sindrome metabolica, così come in altre condizioni come il diabete di tipo 2 ^{2,3, la} steatoepatite 4 non alcolica e la sindrome dell'ovaio policistico⁵. Pertanto, l'iperinsulinemia secondaria a ridotta clearance può svolgere un ruolo nella patogenesi della malattia metabolica. Le strategie che migliorano la clearance dell'insulina hanno il potenziale per invertire gli impatti sfavorevoli dell'iperinsulinemia in questi individui.

L'insulina ha un modello di distribuzione unico. Il livello di insulina plasmatica circolante dipende dall'equilibrio tra la secrezione e la rimozione dell'insulina. Il pancreas secerne insulina nella vena porta in modo pulsatile, dirigendola verso gli epatociti. Essendo il primo organo a incontrare la secrezione di insulina, il fegato degrada la maggior parte dell'insulina durante il suo primo passaggio, rappresentando il 60%-70% dell'insulina totale⁶. L'insulina rimanente esce dal fegato attraverso la vena epatica, entrando nella circolazione sistemica, dove viene parzialmente utilizzata dai tessuti periferici (principalmente muscoli, tessuto adiposo e reni) prima di essere ulteriormente estratta dal fegato durante il suo secondo passaggio attraverso l'arteria epatica⁷.

La misurazione precisa della clearance dell'insulina è fondamentale. La misurazione diretta della clearance dell'insulina epatica negli studi sull'uomo è impegnativa perché è difficile ottenere campioni di sangue dalle vene portale ed epatiche. Vengono utilizzati sia metodi diretti che indiretti per stimare la clearance dell'insulina nell'uomo e nei modelli animali. Vengono impiegate circa tre strategie per misurare indirettamente la clearance dell'insulina. Le valutazioni più frequentemente utilizzate nella pratica clinica coinvolgono metodiche basate sul rapporto molare C-peptide/insulina⁸. Questo approccio si basa sulla secrezione equimolare di entrambi i peptidi e sull'assenza di estrazione del peptide C da parte del fegato⁹. Il secondo gruppo di metodi dipende dall'analisi matematica delle curve di decadimento plasmatico dell'insulina dopo un input noto e specifico dell'ormone nella circolazione ^2,10,11. Il terzo metodo si basa sul fatto che l'infusione di insulina a una velocità costante porta a livelli stabili dell'ormone nel sangue, dove la velocità di rimozione corrisponde alla velocità di somministrazione¹². Questi metodi indiretti riflettono principalmente la clearance complessiva dell'insulina nel corpo. Dato che il fegato è il sito primario di clearance dell'insulina e svolge un ruolo cruciale in questo processo, è essenziale valutare direttamente la clearance dell'insulina epatica.

Studi precedenti hanno misurato direttamente l'estrazione di insulina epatica in cani sani^13,14. Gli studi hanno anche utilizzato un modello isolato di fegato di ratto perfuso per valutare l'estrazione di insulina dal fegato^15,16. A causa dell'elevata disponibilità di ceppi geneticamente modificati, i topi fungono da modelli preziosi per lo studio dei percorsi molecolari. Alcuni studi¹⁷ hanno utilizzato la perfusione epatica per valutare direttamente la clearance dell'insulina epatica in un modello murino. In questi studi, un perfusato contenente insulina umana viene infuso nella vena porta e raccolto dalla vena cava inferiore. La proporzione di insulina assorbita dal fegato indica la sua eliminazione. La tecnica di perfusione epatica mantiene il fegato in condizioni quasi fisiologiche facendo circolare un perfusato caldo, ossigenato e arricchito di sostanze nutritive attraverso il sistema vascolare epatico. Tuttavia, non ci sono indicazioni pratiche sufficienti e consigli essenziali per far progredire e diffondere questa tecnica.

Pertanto, mentre la clearance insulinica epatica ha ricevuto una crescente attenzione, il suo ruolo nei disturbi, così come i suoi meccanismi molecolari, rimangono poco chiari¹⁸. Pertanto, le tecniche avanzate sono molto necessarie nel campo della ricerca scientifica. Questo protocollo stabilisce una procedura dettagliata di perfusione epatica modificata nei topi per valutare la clearance epatica dell'insulina. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per studiare gli effetti dei farmaci sul fegato, compreso l'effetto di primo passaggio, i processi di trasporto dei farmaci e vari altri aspetti.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di medicina di Nanchino (IACUC-2105018) e ha seguito le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Tutti i topi C57BL/6N sono stati mantenuti con un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. I topi di sei settimane sono stati divisi casualmente in un gruppo di dieta Chow (CD) e un gruppo di dieta ad alto contenuto di grassi (HFD). Il gruppo HFD è stato alimentato con una dieta ricca di grassi al 60% e ha continuato con questa dieta fino alle 10 settimane di età. Il peso corporeo medio era di 28,55 g ± 1,2 g per il gruppo HFD e di 24,3 g ± 0,48 g per il gruppo di controllo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione

1. Eseguire la sterilizzazione necessaria degli strumenti chirurgici e dei materiali di consumo mediante sterilizzazione in autoclave.
2. Posizionare gli strumenti chirurgici, la sutura di seta 6-0, l'applicatore di cotone sterile, l'iniezione di cloruro di sodio (500 ml), i tamponi di cotone e le spugne sul tavolo operatorio in modo appropriato.
3. Preparare 30 mL di soluzione salina eparinizzata con una concentrazione finale di 200 UI/mL.
4. Preparare due tubi in silicone con un diametro interno di 0,31 mm e un diametro esterno di 0,64 mm; uno di 4 cm di lunghezza per l'uso come catetere della vena porta e l'altro di 10 cm di lunghezza per l'uso come catetere della vena cava inferiore.
5. Preparare il tampone di perfusione Krebs-Henseleit (KRBH) contenente 5,0 mmol/L di glucosio e 0,25% di BSA.
6. Preparare il tampone di perfusione Krebs-Henseleit (KRBH) contenente 5,0 mmol/L di glucosio, 0,25% BSA e 4,0 ng/mL di insulina umana.
7. Impostare il sistema di perfusione epatica. La Figura 1 mostra i principali componenti del sistema di perfusione epatica.

2. Cateterismo chirurgico

1. Preparare la miscela anestetica seguendo i passaggi seguenti:
   1. Diluire Zoletil 50 (250 mg/5 mL) 10 volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.
   2. Diluire la xilazina cloridrato (200 mg/2 mL) 10 volte con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.
   3. Miscelare la soluzione di Zoletil 50 allo 0,5% con la soluzione di xilazina cloridrato all'1% in rapporto 1:1.
2. Anestetizzare i topi.
   1. Controlla e registra il peso corporeo del mouse. Somministrare la miscela anestetica tramite iniezione intraperitoneale alla dose di 5 ml/kg di peso corporeo (2,5 mg/mL Zoletil 50; 5 mg/mL xilazina cloridrato). L'inizio dell'anestesia avviene in genere entro 5-10 minuti dall'iniezione, indicato dalla perdita del riflesso di raddrizzamento e dalla ridotta risposta agli stimoli esterni.
   2. Trasferire il mouse sul tavolo operatorio. Fissare gli arti con del nastro adesivo. Somministrare 2,5 U/g di eparina per via intraperitoneale per ottenere l'eparinizzazione.
   3. Usa un rasoio elettrico per tagliare il pelo sulla pelle addominale e disinfetta l'area con una soluzione di iodio povidone.
3. Eseguire il cateterismo della vena porta.
   1. Praticare un'incisione longitudinale di 4 cm dal basso addome verso il processo xifoideo lungo la linea medio-addominale. Tagliare accuratamente il peritoneo con le forbici per evitare di danneggiare gli organi viscerali. Inserire il divaricatore addominale del mouse per esporre il campo chirurgico.
   2. Sposta l'intestino verso destra per rivelare la vena porta, il rene destro e la vena cava inferiore (Figura 2A). Usa una pinza per arterie per bloccare la vena cava sul bordo superiore del rene.
   3. Isolare la vena porta (Figura 2A) e legare l'estremità distale con una sutura di seta 6-0. Legare liberamente un'altra sutura sull'estremità prossimale del vaso esposto.
   4. Praticare un'incisione vicino all'estremità legata con le forbici a molla e inserire il catetere. Far avanzare il catetere attraverso l'incisione fino al livello della biforcazione portale.
   5. Fissare entrambe le legature attorno al catetere e confermare il corretto campionamento collegando l'estremità libera del catetere a una siringa di campionamento. Sciacquare con soluzione fisiologica eparinizzata e bloccare il catetere (Figura 2C).
   6. Rimuovere il dispositivo di trazione e ripristinare l'intestino. Coprire l'area chirurgica con una garza sterile imbevuta di soluzione salina o cotone.
4. Eseguire il cateterismo sopraepatico della vena cava inferiore.
   1. Praticare un'incisione lungo lo sterno dal processo xifoideo, esponendo lo sterno.
   2. Tagliare verticalmente lo sterno e tagliare il diaframma lungo il margine delle costole per esporre la cavità toracica.
   3. Esporre e isolare la vena cava inferiore sopraepatica (Figura 2B). Legare con cura l'estremità distale con una sutura di seta 6-0. Legare liberamente un'altra sutura sull'estremità prossimale del vaso.
   4. Praticare un'incisione appena sotto l'estremità legata con le forbici a molla e inserire un catetere da 10 cm. Far avanzare il catetere fino a quando la punta del catetere non è vicina al fegato e legare saldamente entrambe le legature. Verificare il corretto campionamento e bloccare l'estremità libera del catetere (Figura 2D).
   5. Sciacquare l'area chirurgica con soluzione salina. Coprire la superficie con una garza sterile imbevuta di soluzione salina.

3. Perfusione epatica

1. Sopprimere il topo utilizzando un sovradosaggio di anestetico e toracotomia in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali, assicurandosi che tutte le procedure siano eseguite in modo da ridurre al minimo la sofferenza.
2. Impostare il sistema di perfusione epatica, che include un ossigenatore, un dispositivo di modulazione della temperatura, una pompa per infusione e tubi per infusione, come mostrato nella Figura 1.
3. Fornire un flusso continuo di gas del 95% di ossigeno e del 5% di anidride carbonica all'ossigenatore.
4. Aprire il bagnomaria e preriscaldare la camera dell'organo a 37 °C.
5. Preparare il tampone di perfusione KRBH con e senza insulina. Adescare il sistema di tubi con il tampone di perfusione incubato in un bagno d'acqua a 37 °C.
   NOTA: Il KRBH è privo di BSA e glucosio. Il tampone di perfusione KRBH senza insulina umana contiene 5,0 mmol/L di glucosio e lo 0,25% di BSA, mentre il tampone di perfusione KRBH con insulina umana contiene 5,0 mmol/L di glucosio, 0,25% di BSA e 4,0 ng/mL di insulina umana.
6. Mettere il topo in un contenitore con la temperatura ambiente mantenuta a circa 37 °C. Utilizzare un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
7. Infondere il tampone KRBH attraverso il catetere della vena porta. Impostare la velocità di infusione a 0,2 ml/min tramite una mini pompa.
8. Osserva che il fegato diventa pallido in pochi secondi, indicando che il tampone di perfusione scorre attraverso il fegato. Per eliminare più cellule del sangue rimanenti nel fegato, mettere in pausa l'infusione per 1 minuto ai punti temporali di 4 minuti e 8 minuti, iniziando il tempo all'inizio della perfusione.
9. Perfondere il fegato con tampone KRBH per un totale di 10 minuti (escluse le due pause di 1 minuto), che rappresentano il periodo di equilibrio. Raccogliere il campione basale dal catetere della vena cava inferiore.
10. Perfondere il fegato con la stessa soluzione arricchita con insulina (4,0 ng/mL di insulina umana) per altri 30 minuti.
11. Raccogli tutti i campioni dal tubo della vena cava inferiore ogni 2 minuti.
12. Registrare il peso del fegato dopo la perfusione. Raccogliere campioni di fegato da diversi lobi, congelarli immediatamente in azoto liquido e quindi trasferirli a -80 °C per la conservazione.
13. Centrifugare tutti i campioni di perfusione raccolti a ~1.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere i surnatanti e trasferirli a -80 °C per la conservazione.
    NOTA: La concentrazione di insulina nei campioni di perfusione viene misurata utilizzando kit di test di immunoassorbimento enzimatico legato all'insulina umana (ELISA).
14. Dopo la procedura, assicurarsi che tutti i rifiuti biologici vengano smaltiti secondo le norme di sicurezza.

4. Analisi dei dati

1. Presenta i dati in grafici XY che mostrano l'output della concentrazione di insulina nel tempo.
2. Calcolare il tasso medio di clearance insulinica epatica (HICR_AVE) utilizzando la seguente formula:
   HICR_AVE = (1−C_f/C_i) × 100%
   dove C_i = concentrazione iniziale di insulina del tampone per infusione, C_f = concentrazione media finale di insulina negli ultimi 10 minuti dalla vena cava inferiore sopraepatica.

Questo protocollo delinea la procedura per l'infusione epatica per calcolare direttamente la clearance epatica dell'insulina. Questo modello è affidabile e riproducibile. Un esempio dei risultati ottenuti da un esperimento è mostrato nella Figura 3. Dopo un periodo di equilibrio di 10 minuti, il tampone KRBH integrato con 4,0 ng/mL di insulina umana è stato perfuso attraverso la vena porta per 30 minuti. Il liquido di perfusione è stato prelevato dal cat...

Passaggi critici nel protocollo
Le procedure chirurgiche sopra descritte devono essere eseguite con cura delicata per evitare di creare lesioni nel fegato. Inoltre, la fragile struttura della parete del vaso venoso epatico lo rende vulnerabile alla puntura e al successivo sanguinamento se non maneggiato con cura durante l'incannulamento. In questo protocollo vengono utilizzati tubi in silicone più morbidi per ridurre al minimo i danni ai vasi sanguigni. Si raccomanda...

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82200948, 82270921, 82170882).