İnsan Neonatal Hava Yolu Epitel Hücreleri Üzerindeki Hiperoksi Etkilerini Değerlendirmek için Translasyonel 3D Hücre Kültürü Modeli

Yenidoğan trakeal hava yolu epitel hücrelerini (nTAEC) kullanan bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür modeli oluşturmak ve atmosferik olarak indüklenen oksidatif stresin gelişmekte olan yenidoğan hava yolu yüzey epitelinden türetilen hücreler üzerindeki etkisini incelemek için fizyolojik olarak ilgili hiperoksiye maruz kalma gerçekleştirmek için bir protokol açıklıyoruz.

Preterm neonatal hava yolu epiteli sürekli olarak çevresel stres faktörlerine maruz kalır. Akciğer hastalığı olan yenidoğanlarda bu stres faktörlerinden biri, ortam atmosferinden daha yüksek oksijen (_O2) gerilimini içerir - hiperoksi (% >21 O₂). Hiperoksinin hava yolu üzerindeki etkisi, hava yolunun gelişim aşaması, hiperoksi derecesi ve maruz kalma süresi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır ve değişken maruziyetler potansiyel olarak benzersiz fenotiplere yol açar. Hiperoksinin neonatal akciğer alveolarizasyonu ve hava yolu hiperreaktivitesi üzerindeki etkisi hakkında kapsamlı araştırmalar yapılmış olsa da, hiperoksinin insan neonatal hava yolu epitel hücreleri üzerindeki kısa ve uzun vadeli altta yatan etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Bunun önemli bir nedeni, insan neonatal hava yolu epitel gelişimini ve fonksiyonunu incelemek için etkili bir in vitro modelin azdır. Burada, insan neonatal trakeal hava yolu epitel hücrelerinin (nTAEC'ler) insan neonatal trakeal aspiratlarını kullanarak izole edilmesi ve genişletilmesi ve bu hücrelerin hava-sıvı arayüz (ALI) kültüründe kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. nTAEC'lerin ALI kültüründe olgun bir polarize hücre tek tabakası oluşturduğunu ve mukosiliyer farklılaşmaya uğradığını gösterdik. Ayrıca, özel bir inkübatör kullanarak ALI kültüründe hücre tek tabakasının orta derecede hiperoksi maruziyeti için bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, orta derecede hiperoksi maruziyetinin hücresel oksidatif stresi indüklediğini ancak önemli hücre zarı hasarına veya apoptoza neden olmadığını doğrulayan floresan kantifikasyonu kullanarak ALI kültüründe hiperoksi maruziyetini takiben hücresel oksidatif stresi ölçmek için bir test tarif ediyoruz. Bu model, Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesinde (NICU) yenidoğan hava yollarının karşılaştığı klinik olarak anlamlı hiperoksiya maruziyetini simüle etmek için potansiyel olarak kullanılabilir ve O_2'nin yenidoğan hava yolu epitel programlaması üzerindeki kısa ve uzun süreli etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu modeli kullanan çalışmalar, eski prematüre bebeklerde uzun süreli hava yolu hastalıklarının gelişiminde rol oynayan gelişmekte olan hava yollarında erken yaşam oksidatif hasarını azaltmanın yollarını araştırmak için kullanılabilir.

Terapötik oksijen (O₂), yenidoğan yoğun bakım ünitesinde (NICU) en çok kullanılan tedavilerden ^biridir1. Sonuç olarak, hiperoksiye maruz kalma (% >21 O₂), önemli akciğer hastalığı olan ve olmayan yenidoğanların karşılaştığı yaygın bir atmosferik stres faktörüdür. Hiperoksiye akciğer yanıtları, maruziyetin yoğunluğuna ve/veya süresine ve anatomik konuma, hücre tipine ve akciğer gelişiminin evresine bağlı olarak değişebilir 2,3,4,5,6. Neonatal hiperoksi akciğer hasarı ile ilgili araştırmaların büyük kısmı, preterm bebekleri etkileyen en yaygın kronik akciğer hastalığı olan bronkopulmoner displazi (BPD) modeline^postnatal alveolarizasyon bağlamında hiperoksi maruziyetinin etkisine odaklanmıştır 6,7,8,9,10,11. BPD şiddeti, solunum desteği miktarına göre sınıflandırılır ve adet sonrası 36 haftada^{ihtiyaç duyulan O} ₂ 9. BPD'li bebeklerin çoğu, akciğerler büyümeye devam ettikçe zamanla klinik olarak iyileşir ve çoğunluğu ilk doğum günlerinden önce solunum desteğini keser^12,13. Doğumdan sonra BPD'nin ciddiyetinden bağımsız olarak, eski preterm bebekleri etkileyen önemli morbiditeler arasında okul öncesi hırıltılı solunum, astım, çocukluk boyunca tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonları ve erken başlangıçlı kronik obstrüktif akciğer hastalığı riskinin 5 kat artması yer alır 12,14,15,16,17,18,19. Preterm bebeklerde hiperoksinin uzun süreli hava yolu hastalığı ve akciğer enfeksiyonları üzerindeki etkisi in vitro ve in vivo hayvan modelleri kullanılarak araştırılmıştır 20,21,22,23,24. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu mezenkimal doku, alveolar epitel ve hava yolu düz kasının rolüne odaklanmıştır 25,26,27,28.

Hava yolu yüzey epiteli, solunum sisteminin tüm yolunu kaplar, trakeadan terminal bronşiole kadar uzanır ve alveol²⁹ seviyesinden hemen önce sona erer. Hava yolu bazal hücreleri, hava yolu epitelinde bulunan birincil kök hücrelerdir ve kirpikli ve salgı hücrelerini içeren olgun hava yolu epitel soylarının tüm repertuarına farklılaşma kapasitesine sahiptir (kulüp hücreleri: mukus üretmeyen ve goblet hücreleri: mukus üreten)^29,30,31,32. Neonatal hiperoksik akciğer hasarı bağlamında hücre kültürü çalışmaları çoğunlukla yetişkin insan veya fare kanseri hücre hatlarını kullanmıştır^33,34. Ek olarak, çoğu in vitro deney, hücrelerin insanlarda in vivo hava yolu epiteline benzeyen bir mukosiliyer hava yolu epiteline farklılaşmasına izin vermeyen batık kültür sistemlerini kullanmıştır³⁵. Sonuç olarak, insan yenidoğanların gelişmekte olan hava yolu epitel hücrelerinde hiperoksinin neden olduğu akciğer hasarının etkilerine ilişkin bilgilerde bir boşluk vardır. Bunun bir nedeni, atmosferik maruziyetin insan yenidoğan hava yolu epiteli üzerindeki etkilerini incelemek için translasyonel modellerin azlığıdır. Yaşamın erken dönemlerinde hiperoksik akciğer hasarı, uzun süreli hava yolu hastalığına ve enfeksiyon riskinin artmasına neden olabilir, bu da eski prematüre bebeklerde yaşamı değiştiren sonuçlara yol açabilir 14,36,37. Şiddetli BPD'li hayatta kalmayan bebeklerde, hava yolu yüzey epiteli, goblet hücre hiperplazisi ve düzensiz siliyer gelişim dahil olmak üzere belirgin anormalliklere sahiptir, bu da anormal mukosiliyer klerensi ve hava yolu kalibresini tehlikeye atan artmış epitel yüksekliğini gösterir³⁸. Son on yılda, doğum sonrası hava yolu epitel gelişimini incelemek için hava-sıvı arayüzünde (ALI) birincil hava yolu epitel hücrelerinin kültürlenmesine artan bir ilgi olmuştur 39,40,41,42. Bununla birlikte, neonatal hava yolu epitel hücrelerinin ALI modelleri, hiperoksi maruziyeti gibi atmosferik redoks pertürbasyon modelleri bağlamında kullanılmamıştır.

Daha önce yayınlanmış bir yöntem³⁹ kullanılarak, YYBÜ'deki entübe yenidoğanlardan elde edilen neonatal trakeal aspirat örneklerini kullandık ve primer neonatal trakeal hava yolu epitel hücrelerini (nTAEC'ler) başarılı bir şekilde izole ettik ve genişlettik. Daha önce tarif edildiği gibi bu hücrelerde genleşme kapasitesini artırmak ve yaşlanmayı geciktirmek için Rho, Smad, Glikojen sentaz kinaz (GSK3) inhibitörleri ve memeli rapamisin hedefi (mTOR) sinyalini kullandık^39,42, bu da nTAEC'lerin verimli ve daha sonra geçmesine izin verir. Protokol, nTAEC'leri kullanarak 3D ALI kültürleri oluşturma ve nTAEC tek katmanlarında hiperoksi maruziyeti gerçekleştirme yöntemlerini açıklar. Rho ve Smad inhibisyonu, ALI kültürünün ilk 7 günü (ALI günleri 0 ila 7) için kullanılır, daha sonra bu inhibitörler, ALI kültürü süresinin geri kalanı için farklılaşma ortamından çıkarılır. ALI kültürlü hava yolu epitel hücresi tek tabakasının apikal yüzeyi, atmosferik pertürbasyon çalışmalarına olanak tanıyan ve in vivo hiperoksidiye maruz kalan gelişmekte olan bir yenidoğan hava yolunun patobiyolojisine çok benzeyen çevreye⁴³ maruz kalır. Yenidoğan hiperoksik akciğer hasarının önceki hücre kültürü çalışmalarında (ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücrelerden bağımsız olarak) kullanılan O₂ konsantrasyonu, maruz kalma süresi (15 dakika ila 10 gün arasında değişen) gibi önemli ölçüde değişir (%40 ila %95 arasında değişir)36,44,45,46,47. Bu çalışma için, ALI hücre tek tabakası, ALI 7. günden 14. güne kadar 7 gün boyunca% 60_O2'ye maruz bırakıldı (Rho / Smad inhibitörlerinin farklılaşma ortamından çıkarılmasından sonra). Hiperoksi maruziyeti, tamamen farklılaşmış olgun epitelin aksine, mukosiliyer farklılaşmanın erken-orta fazında (ALI 7 ila 14. gün) gerçekleştirildi ve bu nedenle preterm bebeklerde in vivo gelişen hava yolu epitelini simüle etti. Bu maruz kalma stratejisi, akut O₂ toksisitesi riskini (daha yüksek O₂ konsantrasyonları ile beklenirken) en aza indirirken, fizyolojik olarak ilgili bir aralıkta oksidatif stres uygular ve nispeten hipoksik intrauterin ortamdan hiperoksik bir dış ortama geçişin kritik penceresini andırır.

Neonatal trakeal aspirat örnekleri sadece ebeveynlerden bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı ve toplama, taşıma ve saklama için kullanılan protokol Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı (IRB 14377).

1. nTAEC'in izolasyonu, geçişi ve ALI kültürü için hazırlık

1. Medya hazırlığı
   1. İnhibitörler (BLEAM-I) ile bronşiyal epitelyal hava yolu ortamı (BLEAM): 1.25 mL HLL takviyesi (500 μg/mL insan serum albümini, 0.6 μM Linoleik asit, 0.6 μg/mL Lesitin), 15 mL L-Glutamin (6 mM), 2 mL Ekstrakt P (% 0.4, sığır hipofiz ekstresi), 5 mL TM1 (1 μM Epinefrin) ekleyerek 500 mL (1 şişe, 4 ° C'de saklanır) BLEAM hazırlayın. 5 μg/mL Transferrin, 10 nM Triiyodotironin, 0.1 μg/mL Hidrokortizon, 5 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 5 ng/mL insülin), 1 mL antibiyotik solüsyonu (Normosin, 0.1 mg/mL). Birincil hücrelerin yaşlanmasını önlemek ve genişleme verimliliğini artırmak için, daha önce tarif edildiği gibi aşağıdaki büyüme faktörü inhibitörlerini ekleyin³⁹: Y-27632 (Rho ile ilişkili protein kinaz veya ROCK inhibitörü) 5 μM nihai konsantrasyona sahip, A83-01 (Smad sinyalini inhibe eder) 1 μM nihai konsantrasyona sahip, CHIR 99021 (Glikojen sentaz kinaz-3 veya GSK3 inhibitörü) 0.4 μM nihai konsantrasyona sahip ve Rapamisin (rapamisin veya mTOR'un moleküler hedefinin inhibitörü) 5 nm konsantrasyon. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden geçirin. Ortam bileşenlerinin listesi için Tablo 1'e bakın.
   2. İnsan bronşiyal / trakeal epitel hücresi (HBTEC) ALI ortamı: Şişeyi 37 ° C'de çözdürerek ve 1 mL antibiyotik çözeltisi (Normosin, 0.1 mg / mL) ekleyerek 500 mL HBTEC ortamı yapın. Eklendikten sonra, ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden geçirin.
   3. İnhibitörlü HBTEC ortamı (HBTEC-I): HBTEC ortamını yukarıdaki gibi hazırlayın. Filtrelemeden önce, aşağıdaki inhibitörleri ekleyin: 5 μM nihai konsantrasyona sahip Y-27632 ve 0.5 μM nihai konsantrasyona sahip A83-01. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün.
      NOT: BLEAM-I, HBTEC ve HBTEC-I ortamlarını 4 °C'de, tarihli ve etiketli, karanlıkta (folyoya sarılı) saklayın ve yalnızca ihtiyaç duyulanların kısımlarını ısıtın (raf ömrü 30 gündür).
   4. HEPES / FBS: 500 mL HEPES tamponlu salin ve 88 mL FBS ekleyin (nihai konsantrasyon% 15'tir). Eklendikten sonra, çözeltiyi 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün ve 4 °C'de, tarihli ve etiketli olarak saklayın.
      NOT: Kullanmadan önce BLEAM, HEPES-FBS ve Tripsin-EDTA'yı 37 ° C'ye (en az 30 dakika) ısıtın ve ısıtın.
2. Kültür şişelerinin ve ALI hücre kültürü eklerinin 804G şartlandırılmış bir ortamla kaplanması
   1. 804G hücresi (sıçan mesanesi epitel hücre hattı) matris şartlandırılmış ortamı daha önce tarif edildiği gibi hazırlayın³⁹.
   2. Hücre kültürü şişesini ve hücre kültürü eklerini 37 °C inkübatörde en az 4 saat boyunca %5 CO₂ olmak üzere 804G şartlandırılmış ortamla kaplayın. Farklı kültür şişelerini ve hücre kültürü eklerini kaplamak için gereken ortam miktarları için Tablo 2'ye bakın.

2. nTAEC'lerin izolasyonu ve genişletilmesi ve sonraki ALI kültürü için hazırlık

1. Entübe yenidoğanların endotrakeal tüpünün rutin emilmesi sırasında taze trakeal aspirat (yaklaşık 1 mL) alın ve aspiratı bir mukus tuzağında toplayın. Aspirat hacmi mukus tuzağına ulaşmak için yetersizse, aspirasyon kateterini 1-3 mL steril tuzlu su ile durulayın.
2. Numuneyi etiketleyin ve buz üzerinde biyolojik tehlike torbasında saklayın.
   NOT: Numuneler buz üzerinde 4 °C'de en fazla 24 saat saklanabilir. Bununla birlikte, taze numunelerde verim daha yüksektir.
3. Numuneyi YYBÜ'den laboratuvara taşıyın. Bir T25 şişesini 804G şartlandırılmış ortamla kaplayın ve trakeal aspiratın laboratuvara taşınması sırasında numunenin aşılanması için hazırlanın.
4. Mukus tuzağını biyolojik tehlike torbasından çıkarın ve herhangi bir kontaminasyonu önlemek için dış yüzeyleri %70 etanol ile iyice temizleyin. Steril bir hücre kültürü başlığının altındaki mukus tuzağının kapağını dikkatlice açın.
5. Trakeal aspirat örneğini steril PBS ile 5 mL'ye seyreltin (mukusu seyreltmek için) ve tüm içeriği 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
6. Tüpü 250 x g, 20 °C-23 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı (mukus dahil) atın.
   NOT: Buradaki tüm santrifüjlemeler, aksi belirtilmedikçe 250 x g, 20 °C-23 °C'de 5 dakika süreyle yapılır.
7. Peleti 5 mL BLEAM-I içinde tekrar süspanse edin.
8. T25 şişesini inkübatörden çıkarın ve numuneyi kaplamadan önce 804G şartlandırılmış ortamı atın.
9. Numuneyi T25 şişesine yerleştirin ve 37 °C, %5_CO2'de inkübatöre yerleştirin (bu, Geçiş 0 veya P0 olarak adlandırılacaktır).
10. Bağlanmamış hücreleri yıkamak için kaplamadan 24 saat sonra ve ardından her 48 saatte bir ortamı BLEAM-I ile değiştirin.
    NOT: Trakeal aspirat örneği işlendikten ve BLEAM-I ortamında inkübe edildikten sonra, küboidal şekilli hücreler kaplamadan 7-10 gün sonra ortaya çıkar. Kaplamadan yaklaşık 3 hafta sonra, hücreler yoğun bir şekilde paketlenir ve sonraki geçiş, genişleme ve depolama için tripsinizasyon gerektirir. Erken geçiş (P1 - P2) hücreleri kriyotüplere yerleştirilir (kriyotüp başına 500 μL dondurma ortamı başına 2,5 x^{10 6} hücre) ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklanır.
11. Donmuş hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda sıvı nitrojenden hızla çözün ve hücre süspansiyonunu BLEAM-I içeren uygun boyutta steril bir tüpe aktarın.
12. Daha önce⁴⁸ tarif edildiği gibi bir tripan mavisi lekesi ve otomatik veya manuel hücre sayacı kullanarak toplam ve canlı hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu uygun bir hacimde BLEAM-I ile seyreltin, böylece nihai konsantrasyon 15 mL hücre süspansiyonunda (T75 şişesi için) 2.1 x^{10 6} hücredir.
    NOT: Bir T25 şişesi için, tohumlama için genellikle 5 mL hücre süspansiyonunda 0,7 x^{10 6} hücre kullanılır.
13. 15 mL hücre süspansiyonunu bir T75 şişesine aktarın ve gece boyunca 37 °C,% 5 CO_2'de inkübe edin.
14. Ertesi sabah, medyayı yeni BLEAM-I ile değiştirin. Ardından, medyayı her 2 günde bir yeni bir BLEAM-I ile değiştirin. Hücreler %80-90 civarında olduğunda, ALI kültürü için tripsinizlenmeye hazırdırlar.
15. Hücre tek tabakasına 5 mL tripsin-EDTA (T75) uygulayın.
    NOT: Taze tripsin kullanmayı unutmayın. Birden çok kez ısıtılmış tripsin kullanmaktan kaçının.
16. Şişeyi 37 °C'de inkübatörde 5 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri çıkarmak için şişenin 8x-10x tarafına hafifçe vurun. Tripsinizasyondan sonra hücrelerin yerinden çıktığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerin% >50'si şişede kalırsa, PBS 2x ile yıkayın ve tripsinizasyon adımını 2-3 dakikalık azaltılmış bir inkübasyon süresi ile tekrarlayın.
17. 15 mL HEPES-FBS ile reaksiyonu durdurun ve 4x-5x yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri uygun boyutta bir steril tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
18. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 1 mL BLEAM-I'de 5x-10x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek çözün.
19. Toplam ve canlı hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu uygun bir hacimde BLEAM-I ile seyreltin, böylece nihai konsantrasyon 100 μl hücre süspansiyonu başına 1 x^{10 5} canlı hücre olur.

3. nTAEC'lerin ALI kültürü

NOT: Hücre kültürü ekleri, 804G şartlandırılmış ortam ile kaplanmalı ve bir sonraki adımdan önce 37 °C'de en az 4 saat, %5 CO₂ inkübe edilmelidir (bkz. adım 1.2).

1. Hücre kültürü eklerini içeren 24 oyuklu hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın ve 804G ile koşullandırılmış ortamı atın.
2. Her ALI kuyucuğunun bazolateral (alt) odasına 1 mL BLEAM-I ekleyin. ALI hücre kültürü eklerinin apikal odasına 100 μL hücre süspansiyonu (1 x 10⁵ hücre) ekleyin ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. Bu aşama ALI günü -2 olarak tanımlanır.
3. Ertesi gün, bazolateral (1 mL) ve apikal (100 μL) odacıklardaki ortamı taze BLEAM-I ile değiştirin. Apikal odadaki ortamı değiştirirken, hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Bu aşama ALI günü -1 olarak tanımlanır.
4. Ertesi gün, ortamı hem bazolateral hem de apikal odalardan çıkarın.
   NOT: Hücre kültürü zarındaki hücrelerin su altında birleştiği koşullar altında birleştiği 2 gün sürer. Bu aşamada ALI kurulabilir.
5. Bazolateral odaya 1 mL HBTEC-I ortamı ekleyin, ancak apikal oda ortamını serbest bırakın ve havaya maruz bırakın. Bu aşama ALI günü 0 olarak tanımlanır.
6. ALI günü 0'dan 6'ya kadar her 48 saatte bir bazolateral odadaki HBTEC-I ortamını (1 mL) değiştirmeye devam edin. İstenilen hasat zaman noktasına kadar ALI 7. günde normal HBTEC ortamına (inhibitörler olmadan) geçin.
   NOT: ALI kültürünün ilk 7 günü boyunca, bazolateral odadan gelen ortam apikal odaya sızabilir. Hücre tabakasının sağlığını korumak ve farklılaşmalarına izin vermek için bu ortamın her gün dikkatli bir şekilde aspire edilmesi gerekir.
7. Moleküler teknikler, tahliller ve analiz için hücreleri, hücre kültürü eklerini ve bazolateral ortamları farklı zaman noktalarında hasat edin.
   1. Bu protokol için, ALI 0, 7 ve 28. günlerde, epitelyal farklılaşma belirteçlerinin qPCR gen ekspresyon analizi (standart üretici protokolü) için hücreleri hasat edin. ALI 0, 7, 14 ve 28. günlerde, bariyer fonksiyonunu test etmek için hücre kültürü eklerini hasat edin (aşağıda açıklanan yöntemler).
   2. ALI 0 ve 28. günlerde, epitelyal farklılaşma belirteçleri ile immünofloresan boyama için formalinle sabitlenmiş hücre kültürü ekleri kullanın (önceden yayınlanmış protokolü kullanarak)⁴⁹. ALI 14. günde, laktat dehidrojenaz (LDH) salınımı (standart üretici protokolü), oksidatif stres belirteçlerinin qPCR'si için hücre lizatları ve kaspaz-3 ve bölünmüş kaspaz-3 antikorları (standart üretici protokolü) ile immünoblot ve oksidatif stres testi için hücre kültürü ekleri (aşağıda açıklanan yöntem) hasat edin.

4. ALI farklılaşması sırasında bariyer fonksiyonunun test edilmesi

1. Trans-Epitelyal Elektrik Direncinin (TEER) Ölçülmesi
   NOT: Hücre katmanı bütünlüğünü değerlendirmek için ALI farklılaşması sırasında Epitelyal Volt/Ohm Metre (EVOM) kullanarak TEER'i ölçün⁵⁰.
   1. Test filtresi direnç değerlerini ölçmeden önce, Ohm (Ω) cinsinden arka plan direnci değerini ölçmek için 804G ile koşullandırılmış ortam kaplı bir hücre kültürü (herhangi bir hücre içermeyen) kullanın
   2. Arka plan direnç değerini test filtresi direnç değerlerinden çıkarın ve her test filtresi için TEER değerini elde etmek için farkı hücre büyüme yüzey alanı ile çarpın.
      TEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = Trans Epitelyal Elektrik Direnci (Ω.cm²)
      Ω_T = Test filtresi direnç değeri (Ω)
      Ω_B = Arka plan direnç değeri (Ω)
      C = Hücre büyümesi yüzey alanı (^cm2)
      NOT: TEER ölçümleri için kullanılan hücre kültürü ekleri daha sonra %10 tamponlu formalin ile sabitlenir ve hemen immünofloresan boyama ve floresan mikroskobu (aşağıda açıklanan yöntem) için kullanılır veya daha sonra boyama için 4 °C'de saklanır.
2. Floresein Isethionate Dextran (FITC-dekstran) epitel geçirgenlik testi
   NOT: Epitelyal geçirgenlik testi, ALI farklılaşması sırasında iki farklı moleküler ağırlık FITC-dekstran (10 kD ve 20 kD) kullanılarak gerçekleştirildi.
   1. FITC-dekstran çalışma solüsyonu (1 mg / mL) hazırlayın: 5 mg FITC ölçün ve 1 mL DMSO (5 mg / mL) ile karıştırın. 37 °C'ye ısıtılmış ve 1 mg/mL konsantrasyona ısıtılmış HBTEC ortamındaki 5 mg/mL stoğu yeniden süspanse edin. Çözeltiyi ışıktan koruyun.
   2. Test filtrelerini (hücreler içeren) yeni bir 12 oyuklu plakaya aktarın ve bazolateral bölmeye 1 mL HBTEC ortamı ekleyin.
   3. Apikal bölme ortamını (varsa) aspire edin ve 250 μL FITC-dekstran çalışma solüsyonu ile değiştirin. 60 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında inkübe edin.
   4. 12 oyuklu plakadan test filtrelerini (FITC-dextran çalışma solüsyonu içeren) çıkararak FITC-dekstran testini sonlandırın.
   5. Bazolateral ortamı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde ve girdapta 12 oyuklu plakadan toplayın.
   6. Her tüpten 100 μL'lik alikotları üçlü kopyalar halinde 96 oyuklu şeffaf tabanlı siyah polistiren mikroplakaya aktarın. Arka plan floresansını ölçmek için negatif kontrol olarak 100 μL HBTEC ortamını 96 oyuklu plakadaki ek kuyucuklara aktarın.
   7. 490 nm uyarma ve maksimum 520 nm emisyon kullanan bir spektrofotometre kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.
   8. Düzeltilmiş floresan elde etmek için test filtresi floresan değerlerinden ortalama arka plan floresan değerini çıkarın ve değerleri, FITC 0 kD ve 10 kD için ALI 20 günündeki düzeltilmiş floresan değerlerine karşı yüzde olarak ifade edin.

5. TriGas inkübatörü kullanılarak hiperoksi maruziyeti

1. ALI 7. günde, deneysel ve hasat ihtiyaçlarına göre hiperoksiye konulacak hücre kültürü eklerinin sayısını belirleyin.
2. TriGas inkübatördeki O₂ seviyesini %60 O_2'ye ayarlayın. O₂ seviyesinin %60'a ulaşması genellikle ~ 30-45 dakika sürer.
3. O₂ seviyesi %60'ta stabilize olduğunda, 24 oyuklu hücre kültürü plakasını hiperoksi grubuna atanan hücre kültürü ekleri ile birlikte inkübatörün içine yerleştirin ve inkübatör kapısını kapatın.
   NOT: İnkübatörün içindeki O₂ seviyesinde önemli bir düşüşü önlemek için bu adımın mümkün olduğunca verimli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
4. Hiperoksiye maruz kalan hücre kültürü eklerindeki ortamı, kontrol (%21_O2'ye maruz kalan) kuyucuklarıyla aynı programı izleyerek değiştirin. Hücre kültürü eklerinde ortam sızıntısı olup olmadığını her gün kontrol edin ve hücre kültürü odasına herhangi bir sızıntı olup olmadığını nazikçe aspire edin.
5. 7 gün boyunca hiperoksi maruziyetine devam edin (ALI günleri 7 ila 14). Hiperoksi maruziyeti tamamlandıktan sonra, ALI 14. günde hücreleri hasat edin veya hücre kültürü eklerini kullanarak tahliller yapın.

6. Hiperoksinin etkilerini değerlendirmek için oksidatif stres deneyi

NOT: CM-H2DCFDA test kitini kullandık ve_O2 maruziyetini takiben hücre kültürü eklerinde oksidatif stresin bir belirteci olarak ALI 14. günde floresan yoğunluğunu ölçtük. H₂DCFDA, reaktif oksijen türlerinin (ROS) canlı hücre başına kullanılan bir göstergesi olan 2 ", 7" -diklorofloreseinin (DCF) kimyasal olarak indirgenmiş ve asetillenmiş bir formudur. CM-H₂DCFDA, H₂DCFDA'nın tiyol-reaktif klorometil türevidir, bu da hücre içi bileşenlere daha fazla kovalent bağlanmayı teşvik eder ve boyanın hücre içinde daha uzun süre tutulmasını sağlar. Bu moleküller, asetat grupları hücre içi esterazların etkisiyle uzaklaştırılana ve^{hücre 51'de} oksidasyon meydana gelene kadar floresan değildir. Hücre içi oksidasyonu takiben, floresansta ortaya çıkan artış, hücresel oksidatif stresin⁵² vekil bir ölçüsü olarak bir floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Reaktif hafif ve havaya duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunması ve mümkün olduğunca hava geçirmez tutulması gerekir.

1. CM-H2DCFDA tahlil çözeltisinin hazırlanması: Her flakon, toz halinde 50 μg reaktif boyası içerir. 1 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, şişeye 80 μL steril DMSO ekleyin, bir pipetle iyice karıştırın ve hafifçe girdaplayın. Hücre kültürü eklerindeki boyanın 1 μM nihai konsantrasyonu için, 100 μL PBS başına 0,1 μL 1 mM stok ekleyin (örneğin, 6 hücre kültürü eki için 600 μL PBS'ye 0,6 μL stok çözeltisi ekleyin).
   NOT: Boyanın nihai konsantrasyonu 1-5 μM arasında değişebilir. Dozun her kültür koşulu için optimize edilmesi gerekir.
2. Hem hiperoksiye maruz kalan hem de normoksiye maruz kalan grup için her hücre kültürüne 1 μM boya çözeltisinden 100 μL ekleyin. Her tedavi grubundan negatif kontrol olarak en az 1 hücre kültürü kullanın (boyasız 100 μL PBS). 37 °C'de 30 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun. 1x'i PBS ile yıkayın.
3. Slayt hazırlığı: Fazla PBS'yi boşaltın. Hücre kültürü eklerini dikkatlice tutun ve hücre kültürü zarını yavaşça kesmek için bir bıçak kullanın. Slaytın üzerine 1-2 damla montaj sıvısı dökün. Düz uçlu forsepslerle, zarın köşesini dikkatlice tutun, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde montaj parçasına yerleştirin ve bir kapak kaymasıyla. Fazla montaj sıvısını çıkarın ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. Slaytlar artık görüntülenmeye hazırdır.
   NOT: Floresan yoğunluğu 2-3 saat içinde önemli ölçüde azaldığından, slayt ve floresan mikroskobunun hazırlanması mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
4. Floresan mikroskobu: Cy2 (siyanin-2) kanalını kullanan bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın. Hücre kültürü başına üç ayrı, örtüşmeyen alandan görüntüler yakalayın.
5. Oksidatif stresin floresan tespiti
   NOT: ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) ve aşağıda açıklanan iş akışını kullanarak düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) ölçmek için floresan mikroskobundan alınan görüntüleri kullanın. CTCF, hiperoksi maruziyetini takiben hücre kültürü eklerinde oksidatif stres için bir belirteç görevi görür ve ImageJ yazılımının yardımıyla arka plan floresansının ortadan kaldırılmasıyla ölçülür.
   1. Mikroskopi görüntüsünü ImageJ'de açın ve dikdörtgen aracını kullanarak ilgilendiğiniz alanı seçin. Sağ tıklayarak seçim alanını (α) kaydedin ve ROI (ilgilenilen bölge) yöneticisine ekle'yi seçin. Görüntülerde bu seçim alanını kullanın.
   2. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla altında ölçüm parametrelerini seçin ve ayarlar sekmesinde Alan, Entegre Yoğunluk ve Ortalama Gri Değer'i seçin.
   3. Her görüntü için ROI yöneticisinden aynı seçim alanını kullanın ve Analiz Et > Ölç'ü seçin. Entegre yoğunluk değeri, seçilen alanın toplam floresansını (F_t) temsil eder. Açılır pencereden ölçüm değerlerini not edin.
   4. Her görüntüdeki arka plan floresansını (F_b) düzeltmek için, dikdörtgen aracını kullanarak floresan olmayan küçük bir alan seçin. Bu bölge için Analiz Et > Ölç'ü seçin. Ortalama yoğunluk değeri F_b'yi temsil eder. Açılır pencereden ölçüm değerlerini not edin.
   5. Arka plan okumalarının ortalama floresan yoğunluğunu ROI'nin toplam alanıyla çarparak ve bu sayıyı ROI'nin entegre yoğunluk değerinden çıkararak CTCF'yi hesaplayın. Her iki tedavi grubu (Kontrol ve Hyperoxia) için tüm görüntüler için bu iş akışını tekrarlayın.
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = Düzeltilmiş toplam hücre floresansı (AU)
      F_t = Toplam floresan
      F_b = Arka plan floresansı
      α = Seçim alanı

nTAEC'leri izole etmek için, YYBÜ'deki entübe yenidoğanlardan trakeal aspiratlar topladık ve aspiratları daha sonraki işlemler için buz üzerinde laboratuvara taşıdık (Şekil 1A). Trakeal aspirat örnekleri hava yolu epitelyal büyüme ortamında (Rho / Smad, GSK3 ve mTOR inhibitörleri içeren BLEAM-I) tohumlandıktan sonra, küboidal hücreler 7-10 gün içinde ortaya çıktı. 14 gün sonra, hücreler% 50 -% 60...

Burada açıklanan protokol, YYBÜ'de entübe edilmiş yenidoğanlardan neonatal trakeal aspirat örneklerinin toplanması ve işlenmesi için bir yöntemi detaylandırır ve daha önce belirlenmiş yöntemler kullanılarak bu örneklerden canlı nTAEC'lerin daha sonra izolasyonu ve genişletilmesi³⁹. Ayrıca, nTAEC'leri ALI üzerinde kültürlemek ve TEER, FITC-dekstran testi, immünofloresan boyama ve hücre tipine (yani, bazal, siliyer, kulüp ve kadeh) spesifi...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi ve bildirecek çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) ve Oklahoma Paylaşılan Klinik ve Translasyonel Kaynaklar (NIGMS'den Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ile U54GM104938) AG'ye sağlanan fonlarla desteklenmektedir. Boston, Massachusetts'teki Harvard Tıp Okulu, Massachusetts General Hospital'dan Dr. Paul LeRou ve Dr. Xingbin Ai'ye, bazı deneylerde kullanılan yenidoğan donör hücrelerini sağladıkları için teşekkür ederiz. Figürler Biorender ile oluşturuldu. İstatistiksel analizler GraphPad Prism ile yapıldı.