Трансляционная модель 3D-клеточной культуры для оценки влияния гипероксии на эпителиальные клетки дыхательных путей новорожденных

Мы описываем протокол создания модели культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) с использованием эпителиальных клеток дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC) и выполняем физиологически значимое воздействие гипероксии для изучения влияния атмосферно-индуцированного окислительного стресса на клетки, полученные из развивающегося эпителия поверхности дыхательных путей новорожденных.

Эпителий дыхательных путей недоношенных новорожденных постоянно подвергается воздействию стрессоров окружающей среды. Одним из таких стрессоров у новорожденных с заболеваниями легких является напряжение кислорода (O₂) выше, чем в окружающей атмосфере, что называется гипероксией (>21%_O2). Влияние гипероксии на дыхательные пути зависит от различных факторов, включая стадию развития дыхательных путей, степень гипероксии и продолжительность воздействия, при этом вариабельное воздействие потенциально может привести к уникальным фенотипам. Несмотря на то, что были проведены обширные исследования влияния гипероксии на альвеоляризацию легких новорожденных и гиперреактивность дыхательных путей, мало что известно о краткосрочном и долгосрочном влиянии гипероксии на эпителиальные клетки дыхательных путей новорожденных человека. Основной причиной этого является нехватка эффективной модели in vitro для изучения развития и функции эпителия дыхательных путей новорожденных человека. В данной статье мы описываем метод выделения и расширения эпителиальных клеток дыхательных путей (nTAEC) трахеи человека у новорожденных с использованием аспиратов трахеи человека и культивирования этих клеток в культуре воздушно-жидкостного интерфейса (ALI). Мы демонстрируем, что nTAEC образуют зрелый поляризованный клеточный монослой в культуре ALI и подвергаются мукоцилиарной дифференцировке. Также представлен способ умеренного воздействия гипероксии на монослой клеток в культуре ALI с использованием специализированного инкубатора. Кроме того, мы описываем анализ для измерения клеточного окислительного стресса после воздействия гипероксии в культуре ALI с использованием флуоресцентного количественного анализа, который подтверждает, что умеренное воздействие гипероксии индуцирует клеточный окислительный стресс, но не вызывает значительного повреждения клеточной мембраны или апоптоза. Эта модель потенциально может быть использована для моделирования клинически значимого воздействия гипероксии, с которым сталкиваются неонатальные дыхательные пути в отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН), а также для изучения кратковременного и долгосрочного воздействия_О2 на программирование эпителия дыхательных путей новорожденных. Исследования с использованием этой модели могут быть использованы для изучения способов смягчения окислительного повреждения развивающихся дыхательных путей в раннем возрасте, которое связано с развитием долгосрочных заболеваний дыхательных путей у бывших недоношенных детей.

Терапевтический кислород (O₂) является одним из наиболее часто используемых методов лечения в отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН)¹. Следовательно, воздействие гипероксии (>21%_О2) является распространенным атмосферным стрессором, с которым сталкиваются новорожденные со значительными заболеваниями легких и без них. Реакция легких на гипероксию может варьироваться в зависимости от интенсивности и/или продолжительности воздействия, а также анатомического расположения, типа клеток и стадии развития легких 2,3,4,5,6. Основная часть исследований в области неонатального повреждения легких при гипероксии была сосредоточена на влиянии воздействия гипероксии в контексте постнатальной альвеоляризации для моделирования бронхолегочной дисплазии (БЛД) - наиболее распространенного хронического заболевания легких, поражающего недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. _{Тяжесть} ПРЛ классифицируется по объему респираторной поддержки и О2, необходимому через 36 недель после менструации^{в возрасте 9} лет. У большинства детей с ПРЛ клинические улучшения со временем по мере роста легких, причем большинство из них отказываются от респираторной поддержки до своего первого дня ^{рождения.} Независимо от тяжести БЛД после рождения, значимые заболевания, поражающие бывших недоношенных детей, включают в себя 5-кратное увеличение риска дошкольных хрипов, астму, рецидивирующие респираторные инфекции в детстве и раннее начало хронической обструктивной болезни легких 12,14,15,16,17,18,19. Влияние гипероксии на долгосрочное заболевание дыхательных путей и легочные инфекции у недоношенных детей было исследовано с использованием животных моделей in vitro и in vivo 20,21,22,23,24. Тем не менее, большинство из этих моделей были сосредоточены на роли мезенхимальной ткани, альвеолярного эпителия и гладких мышц дыхательных путей 25,26,27,28.

Поверхностный эпителий дыхательных путей выстилает весь путь дыхательной системы, простираясь от трахеи вниз до терминальной бронхиолы и заканчиваясь непосредственно перед уровнем альвеол²⁹. Базальные клетки дыхательных путей являются первичными стволовыми клетками в эпителии дыхательных путей, обладающими способностью дифференцироваться во весь репертуар зрелых эпителиальных линий дыхательных путей, которые включают реснитчатые и секреторные клетки (булановые клетки: не продуцирующие слизь, и бокаловидные клетки: продуцирующие слизь)29,30,31,32. В исследованиях клеточных культур в контексте неонатального гипероксического повреждения легких в основном использовались клеточные линии рака взрослого человека или мыши^33,34. Кроме того, в большинстве экспериментов in vitro использовались погруженные в воду системы культивирования, которые не позволяют дифференцировать клетки в мукоцилиарный эпителий дыхательных путей, напоминающий эпителий дыхательных путей in vivo у человека³⁵. Следовательно, существует пробел в знаниях о влиянии повреждения легких, вызванного гипероксией, на развитие эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных людей. Одной из причин является нехватка трансляционных моделей для изучения влияния атмосферного воздействия на эпителий дыхательных путей новорожденных человека. Гипероксическое повреждение легких в раннем возрасте может привести к долгосрочному заболеванию дыхательных путей и повышенному риску инфекции, что приводит к изменяющим жизнь последствиям у бывших недоношенных детей 14,36,37. У невыживших младенцев с тяжелым БЛД эпителий поверхности дыхательных путей имеет отчетливые аномалии, включая гиперплазию бокаловидных клеток и нарушение развития ресничек, что указывает на аномальный мукоцилиарный клиренс и повышенную высоту эпителия, ставящую под угрозу калибр дыхательных путей³⁸. В последнее десятилетие наблюдается повышенный интерес к культивированию первичных эпителиальных клеток дыхательных путей на границе воздушно-жидкостных соединений (ОПЛ) для изучения постнатального развития эпителия дыхательных путей 39,40,41,42. Тем не менее, модели ALI эпителиальных клеток дыхательных путей новорожденных не использовались в контексте моделей окислительно-восстановительных возмущений атмосферы, таких как воздействие гипероксии.

Используя ранее опубликованный метод³⁹, мы использовали образцы аспирата трахеи новорожденных, полученные от интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных, и успешно выделили и расширили первичные эпителиальные клетки дыхательных путей трахеи новорожденных (nTAEC). Мы использовали ингибиторы Rho, Smad, гликогенсинтазинкиназы (GSK3) и мишени рапамицина млекопитающих (mTOR) для увеличения способности к экспансии и задержки старения в этих клетках, как описано ранее^39,42, что обеспечивает эффективное и последующее пассирование nTAECs. В протоколе описаны методы создания 3D культур ALI с использованием nTAECs и проведения воздействия гипероксии на монослои nTAEC. Ингибирование Rho и Smad используется в течение первых 7 дней культивирования ALI (дни ALI с 0 по 7), после чего эти ингибиторы удаляются из сред дифференцировки на оставшуюся часть времени культивирования ALI. Апикальная поверхность монослоя эпителиальных клеток дыхательных путей, культивируемых ALI, остается подверженной воздействию окружающей^среды43, что позволяет изучать атмосферные возмущения и очень напоминает патобиологию развивающихся неонатальных дыхательных путей, подвергшихся гипероксии in vivo. Концентрация_О2, использованная в предыдущих исследованиях клеточных культур (независимо от иммортализованных или первичных клеток) при гипероксическом повреждении легких у новорожденных, значительно варьирует (в диапазоне от 40% до 95%), как и продолжительность воздействия (от 15 минут до 10 дней)36,44,45,46,47. В этом исследовании монослой клеток ALI подвергался воздействию 60%_O2 в течение 7 дней с 7-го по 14-й день ALI (после удаления ингибиторов Rho/Smad из дифференцировочной среды). Воздействие гипероксии проводилось в раннюю-среднюю фазу мукоцилиарной дифференцировки (ОПЛ с 7 по 14 день) в отличие от полностью дифференцированного зрелого эпителия и, таким образом, симулировало развитие эпителия дыхательных путей in vivo у недоношенных детей. _{Такая стратегия} воздействия сводит к минимуму риск острой токсичности О2 (которая ожидается при более высоких концентрациях_О2), в то же время продолжая оказывать окислительный стресс в физиологически значимом диапазоне, и напоминает критическое окно перехода от относительно гипоксической внутриутробной среды к гипероксической внешней среде у недоношенных новорожденных людей.

Образцы аспирата трахеи новорожденных были собраны только после информированного согласия родителей, а протокол, используемый для сбора, транспортировки и хранения, был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Центра медицинских наук Университета Оклахомы (IRB 14377).

1. Подготовка к выделению, пассированию и культуре ALI nTAEC

1. Подготовка СМИ
   1. Бронхиальная эпителиальная среда для проходимых дыхательных путей (BLEAM) с ингибиторами (BLEAM-I): Приготовьте 500 мл (1 флакон, хранящийся при температуре 4 °C) BLEAM, добавив 1,25 мл добавки HLL (500 мкг/мл сывороточного альбумина человека, 0,6 мкМ линолевой кислоты, 0,6 мкг/мл лецитина), 15 мл L-глутамина (6 мМ), 2 мл экстракта P (0,4%, экстракт гипофиза крупного рогатого скота), 5 мл TM1 (1 мкМ адреналина, 5 мкг/мл трансферрина, 10 нМ трийодтиронина, 0,1 мкг/мл гидрокортизона, 5 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 5 нг/мл инсулина), 1 мл раствора антибиотика (нормоцин, 0,1 мг/мл). Для предотвращения старения первичных клеток и повышения эффективности экспансии добавляют следующие ингибиторы фактора роста, как описано ранее³⁹: Y-27632 (Rho-ассоциированная протеинкиназа или ингибитор ROCK) с конечной концентрацией 5 мкМ, A83-01 (ингибирует передачу сигналов Smad) с конечной концентрацией 1 мкМ, CHIR 99021 (ингибитор гликогенсинтазы-киназы-3 или GSK3) с конечной концентрацией 0,4 мкМ и рапамицин (ингибитор молекулярной мишени рапамицина или mTOR) с конечной концентрацией. концентрация 5 нМ. Фильтруйте фильтр через фильтр размером 0,22 мкм с размером пор. Список компонентов мультимедиа приведен в таблице 1 .
   2. Среда ALI для эпителиальных клеток бронхов/трахеи человека (HBTEC): Приготовьте 500 мл среды HBTEC, разморозив флакон при 37 °C и добавив 1 мл раствора антибиотика (нормоцин, 0,1 мг/мл). После добавления фильтрующий материал пропустите через фильтр размером 0,22 мкм с размером пор.
   3. Фильтрующий материал HBTEC с ингибиторами (HBTEC-I): Подготовьте фильтрующий материал HBTEC, как указано выше. Перед фильтрацией добавьте следующие ингибиторы: Y-27632 с конечной концентрацией 5 μМ и A83-01 с конечной концентрацией 0,5 μM. Фильтруйте фильтр через фильтр размером пор 0,22 μм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните фильтрующие материалы BLEAM-I, HBTEC и HBTEC-I при температуре 4 °C, датированном и маркированном, в темноте (завернутым в фольгу) и разогревайте только аликвоты того, что необходимо (срок годности 30 дней).
   4. HEPES/FBS: Добавьте 500 мл HEPES-буферизованного физиологического раствора и 88 мл FBS (конечная концентрация 15%). После добавления отфильтруйте раствор через фильтр размером поры 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C, датируя и маркируя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением нагрейте BLEAM, HEPES-FBS и Trypsin-EDTA до 37 °C (не менее 30 минут).
2. Покрытие колб для культур и вкладышей для культивирования клеток ALI средой, кондиционированной 804G
   1. Готовьте клеточную 804G (эпителиальную клеточную линию мочевого пузыря крысы) матрично-кондиционированную среду, как описано ранее³⁹.
   2. Покройте колбу для клеточных культур и вкладыши для клеточных культур средой, кондиционированной 804G, в течение не менее 4 ч в инкубаторе при температуре 37 °C с содержанием 5%_CO2. В таблице 2 приведены количества среды, необходимые для покрытия различных культуральных колб и вкладышей для клеточных культур.

2. Выделение и размножение нТАЭК и подготовка к последующему культивированию ОЛИ

1. Приобретайте свежий аспират трахеи (примерно 1 мл) во время рутинного отсасывания эндотрахеальной трубки интубированных новорожденных и собирайте аспират в ловушку слизи. Если объем аспирата недостаточен для достижения ловушки слизи, промойте отсасывающий катетер 1-3 мл стерильного физиологического раствора.
2. Наклейте на образец этикетку и храните его в пакете с биологической опасностью на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить на льду при температуре 4 °C не более 24 часов. Однако выход выше со свежими образцами.
3. Транспортировка образца из отделения интенсивной терапии новорожденных в лабораторию. Смажьте колбу T25 средой, кондиционированной 804G, и подготовьтесь к инокуляции образца во время транспортировки аспирата трахеи в лабораторию.
4. Извлеките ловушку для слизи из пакета с биологически опасными веществами и тщательно очистите внешние поверхности 70% этанолом, чтобы избежать загрязнения. Осторожно откройте колпачок на ловушку слизи под стерильным клеточно-культуральным колпаком.
5. Разведите образец аспирата трахеи стерильным PBS до 5 мл (для разжижения слизи) и перенесите все содержимое в коническую пробирку объемом 50 мл.
6. Центрифугируйте пробирку при температуре 250 x g, 20 °C-23 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость (включая слизь).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все центрифугирования здесь проводятся при температуре 250 x g, 20 °C-23 °C в течение 5 минут, если не указано иное.
7. Ресуспендируйте гранулу в 5 мл BLEAM-I.
8. Извлеките колбу T25 из инкубатора и выбросьте кондиционированный фильтрующий материал 804G перед нанесением покрытия на образец.
9. Поместите образец в колбу T25 и поместите в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_CO2 (это будет называться Passage 0 или P0).
10. Меняйте носители с помощью BLEAM-I через 24 часа после нанесения покрытия для вымывания неприкрепленных элементов и в последующем каждые 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После обработки образца аспирата трахеи и его инкубации в среде BLEAM-I через 7-10 дней после осаждения появляются клетки кубовидной формы. Примерно через 3 недели после осаждения клетки плотно упаковываются и требуют трипсинизации для последующего пассирования, расширения и хранения. Клетки раннего пассажа (P1 - P2) помещают в криопробирки (2,5 х 10⁶ клеток на 500 мкл замораживающей среды на криопробирку) и хранят в жидком азоте для длительного хранения.
11. Быстро разморозьте замороженные клетки из жидкого азота на водяной бане при температуре 37 °C и перенесите клеточную суспензию в стерильную пробирку соответствующего размера, содержащую BLEAM-I.
12. Подсчитайте клетки для определения общего и живого количества клеток с использованием трипанового синего пятна и автоматического или ручного счетчика клеток, как описано ранее⁴⁸. Разбавьте клеточную суспензию соответствующим объемом BLEAM-I, чтобы конечная концентрация составляла 2,1 х 10⁶ клеток в 15 мл клеточной суспензии (для колбы Т75).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для колбы T25 обычно используется 0,7 x 10⁶ клеток в 5 мл клеточной суспензии.
13. Перенесите клеточную суспензию объемом 15 мл в колбу T75 и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, 5%_CO2.
14. На следующее утро обменяйте носители на новые BLEAM-I. Затем меняйте носители на новый BLEAM-I каждые 2 дня. Как только клетки достигают 80-90%, они готовы к трипсинизации для культивирования ОПЛ.
15. Нанесите 5 мл трипсина-ЭДТА (Т75) на монослой клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте использовать свежий трипсин. Избегайте использования трипсина, который был нагрет несколько раз.
16. Инкубировать колбу при температуре 37 °C в течение 5 минут в инкубаторе. Затем постучите по боковой стороне колбы в 8-10 раз, чтобы сместить ячейки. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были смещены после трипсинизации. Если на колбе осталось >50% клеток, промойте PBS 2x и повторите этап трипсинизации с уменьшенным временем инкубации на 2-3 минуты.
17. Остановите реакцию с помощью 15 мл HEPES-FBS и проводите пипетку вверх и вниз в 4-5 раз. Переложите клетки в стерильную пробирку соответствующего размера и центрифугируйте при давлении 250 x g в течение 5 минут, чтобы гранулировать клетки.
18. После центрифугирования осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Растворите клеточную гранулу в 1 мл BLEAM-I, осторожно пипетируя вверх и вниз в 5-10 раз.
19. Подсчитайте ячейки, чтобы определить общее и активное количество клеток. Разбавьте клеточную суспензию соответствующим объемом BLEAM-I, чтобы конечная концентрация составляла 1 x 10⁵ живых клеток на 100 мкл клеточной суспензии.

3. Культура ALI nTAECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладыши для клеточных культур должны быть покрыты средой, кондиционированной 804G, и инкубироваться в течение не менее 4 ч при 37 °C, 5%_CO2 перед следующим этапом (см. шаг 1.2).

1. Извлеките из инкубатора 24-луночные планшеты для клеточных культур, содержащие вкладыши для клеточных культур, и выбросьте среды, подготовленные по стандарту 804G.
2. Добавьте 1 мл BLEAM-I в базолатеральную (нижнюю) камеру каждой лунки ALI. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии (1 x 10⁵ клеток) в апикальную камеру вкладышей для клеточных культур ALI и инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2. Этот этап определяется как день -2 ALI.
3. На следующий день замените среду в базолатеральной (1 мл) и апикальной (100 мкл) камерах свежим BLEAM-I. При смене среды в апикальной камере будьте осторожны, чтобы не потревожить монослой клетки. Этот этап определяется как день -1 ALI.
4. На следующий день удалите среду как из базолатеральной, так и из апикальной камер.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеткам на мембране клеточной культуры требуется 2 дня, чтобы слиться в условиях погружения. На этом этапе может быть установлен ALI.
5. Добавьте 1 мл среды HBTEC-I в базолатеральную камеру, но оставьте среду апикальной камеры свободной и подверженной воздействию воздуха. Этот этап определяется как день 0 ALI.
6. Продолжайте заменять среду HBTEC-I (1 мл) в базолатеральной камере каждые 48 ч с 0-го по 6-й день ALI. Переключитесь на обычную среду HBTEC (без ингибиторов) на 7-й день ALI до желаемого момента сбора урожая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 7 дней культивирования ОЛИ среда из базолатеральной камеры может просачиваться в апикальную камеру. Эту среду необходимо тщательно отсасывать каждый день, чтобы поддерживать здоровье клеточного слоя и позволять им дифференцироваться.
7. Сбор клеток, вставки клеточных культур и базолатеральные среды в разные моменты времени для молекулярных методов, анализов и анализа.
   1. Для этого протокола на 0, 7 и 28 день ALI собирают клетки для анализа экспрессии генов qPCR (стандартный протокол производителя) маркеров дифференцировки эпителия. На 0, 7, 14 и 28 день ALI собирают вставки для клеточных культур для тестирования барьерной функции (методы, описанные ниже).
   2. На 0-й и 28-й дни ALI используйте фиксированные формалином вставки для иммунофлуоресцентного окрашивания маркерами дифференцировки эпителия (с использованием ранее опубликованного протокола)⁴⁹. На 14-й день ALI собирают базолатеральные среды для высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (стандартный протокол производителя), лизаты клеток для количественной ПЦР маркеров окислительного стресса и иммуноблот с антителами к каспазе-3 и расщепленной каспазе-3 (стандартный протокол производителя), а также вставки для клеточных культур для анализа окислительного стресса (метод описан ниже).

4. Проверка барьерной функции при дифференцировке ALI

1. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте TEER с помощью эпителиального вольт-омметра (EVOM) во время дифференцировки ALI для оценки целостности клеточного слоя⁵⁰.
   1. Перед измерением значений сопротивления тестового фильтра используйте кондиционированную 804G клеточную культуру с покрытием из среды (без каких-либо клеток) для измерения значения фонового сопротивления в Омах (Ω)
   2. Вычтите значение фонового сопротивления из значений сопротивления тестового фильтра и умножьте разницу на площадь поверхности роста ячейки, чтобы получить значение TEER для каждого тестового фильтра.
      TEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = Электрическое сопротивление трансэпителия (Ω,см²)
      Ω_T = Значение сопротивления фильтра (Ω)
      Ω_B = значение фонового сопротивления (Ω)
      C = площадь поверхности роста клеток (^см2)
      Вставки для клеточных культур, используемые для измерений TEER, впоследствии фиксируют 10% буферным формалином и немедленно используют для иммунофлуоресцентного окрашивания и флуоресцентной микроскопии (метод, описанный ниже) или хранят при температуре 4 °C для последующего окрашивания.
2. Флуоресцеин исетионат декстран (FITC-декстран) анализ проницаемости эпителия
   Примечание: Анализ проницаемости эпителия проводили с использованием двух различных молекулярных масс FITC-декстрана (10 кД и 20 кДа) во время дифференцировки ALI.
   1. Приготовьте рабочий раствор FITC-декстрана (1 мг/мл): отмерьте 5 мг FITC и смешайте с 1 мл ДМСО (5 мг/мл). Ресуспендируйте массу 5 мг/мл в среде HBTEC, нагретой до 37 °C до концентрации 1 мг/мл. Берегите раствор от света.
   2. Перенесите тестовые фильтры (содержащие ячейки) на новый 12-луночный планшет и добавьте 1 мл фильтрующего материала HBTEC в базолатеральный отсек.
   3. Аспирируйте апикальные компартментные среды (если таковые имеются) и замените 250 мкл рабочего раствора FITC-декстрана. Инкубировать при комнатной температуре, защищенной от света, в течение 60 минут.
   4. Завершите анализ ФИТК-декстран, удалив тестовые фильтры (содержащие рабочий раствор ФИТК-декстран) с 12-луночного планшета.
   5. Соберите базолатеральную среду с 12-луночного планшета в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и вортекс.
   6. Перенесите 100 мкл аликвот из каждой пробирки на 96-луночный микропланшет из черного полистирола с прозрачным дном в трех экземплярах. Переведите 100 мкл среды HBTEC в дополнительные лунки в 96-луночном планшете в качестве отрицательного контроля для измерения фоновой флуоресценции.
   7. Измерение интенсивности флуоресценции с помощью спектрофотометра с использованием максимумов возбуждения 490 нм и излучения 520 нм.
   8. Вычтите среднее значение фоновой флуоресценции из значений флуоресценции тестового фильтра, чтобы получить скорректированную флуоресценцию, и выразите значения в процентах от скорректированных значений флуоресценции в 0-й день ALI для FITC 10 кД и 20 кДа.

5. Воздействие на гипероксию с помощью инкубатора TriGas

1. На 7-й день ALI определите количество вставок для клеточных культур, которые должны быть введены в гипероксию, исходя из потребностей эксперимента и урожая.
2. Установите уровень O₂ в инкубаторе TriGas на 60 % O₂. Обычно требуется ~30-45 минут, чтобы уровень O₂ достиг 60%.
3. Как только уровень_О2 стабилизируется на уровне 60%, поместите в инкубатор 24-луночный планшет для клеточных культур со вставками для клеточных культур, отнесенными к группе гипероксии, и закройте дверцу инкубатора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен как можно эффективнее, чтобы предотвратить значительное падение уровня_О2 внутри инкубатора.
4. Меняйте среду во вставках клеточных культур, подвергшихся воздействию гипероксии, следуя тому же графику, что и в контрольных лунках (с экспозицией 21%_O2 ). Ежедневно проверяйте вставки для клеточных культур на предмет утечки среды и аккуратно отсасывайте любую утечку в камеру для клеточных культур.
5. Продолжайте воздействие гипероксии в течение 7 дней (ALI с 7 по 14 день). После завершения воздействия гипероксии соберите клетки или проведите анализы с использованием вставок клеточных культур на 14-й день ОИМ.

6. Анализ окислительного стресса для оценки эффектов гипероксии

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали набор для анализа CM-H2DCFDA и измерили интенсивность флуоресценции на 14-й день ALI в качестве маркера окислительного стресса во вставках клеточных культур после воздействия_O2 . H₂DCFDA представляет собой химически восстановленную и ацетилированную форму 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF), которая является индикатором активных форм кислорода (АФК), проходящих через живые клетки. CM-H₂DCFDA представляет собой тиол-реактивное хлорметилпроизводное H₂DCFDA, которое способствует дальнейшему ковалентному связыванию с внутриклеточными компонентами, обеспечивая более длительное удержание красителя в клетке. Эти молекулы являются нефлуоресцентными до тех пор, пока ацетатные группы не будут удалены под действием внутриклеточных эстераз, и в клетке⁵¹ не произойдет окисление. После внутриклеточного окисления результирующее увеличение флуоресценции может быть измерено с помощью флуоресцентного микроскопа в качестве суррогатной меры клеточного окислительного стресса⁵². Реагент светочувствителен и чувствителен к воздуху, поэтому его необходимо защищать от света и поддерживать герметичность, насколько это возможно.

1. Приготовление раствора для анализа CM-H2DCFDA: Каждый флакон содержит 50 мкг красителя-реагента в порошкообразном виде. Чтобы приготовить стоковый раствор массой 1 мМ, добавьте во флакон 80 мкл стерильного ДМСО, хорошо перемешайте пипеткой и осторожно перемешайте. Для конечной концентрации красителя в 1 мкМ во вставках для клеточных культур добавьте 0,1 мкл 1 мМ запаса на 100 мкл PBS (например, добавьте 0,6 мкл исходного раствора к 600 мкл PBS для 6 вставок для клеточных культур).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация красителя может варьироваться в пределах 1-5 μМ. Доза должна быть оптимизирована для каждого условия культивирования.
2. Добавьте 100 мкл раствора красителя 1 мкМ в каждую культуру клеток как для группы, подвергшейся воздействию гипероксии, так и в группе, подверженной воздействию нормоксии. Используйте не менее 1 клеточной культуры в качестве отрицательного контроля из каждой группы лечения (100 мкл PBS без красителя). Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут в защищенном от света месте. Постирайте 1x с PBS.
3. Подготовка предметного стекла: Слейте излишки PBS. Осторожно удерживайте вставки для клеточных культур и с помощью лезвия медленно вырезайте мембрану клеточной культуры. Налейте на затвор 1-2 капли монтажной жидкости. С помощью щипцов с плоским наконечником осторожно удерживайте угол мембраны, положите его клеточной стороной вниз на монтант и накройте покровным листом. Удалите излишки жидкости и дайте высохнуть на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Теперь слайды готовы к изображению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка предметного стекла и флуоресцентная микроскопия должны быть выполнены как можно быстрее, так как интенсивность флуоресценции значительно снижается в течение 2-3 часов.
4. Флуоресцентная микроскопия: Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием канала Cy2 (цианина-2). Получение изображений из трех отдельных, не перекрывающихся областей для каждой клеточной культуры.
5. Флуоресцентное детектирование окислительного стресса
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изображения флуоресцентной микроскопии для измерения скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) и рабочего процесса, описанного ниже. CTCF служит маркером окислительного стресса во вставках клеточных культур после воздействия гипероксии и измеряется путем устранения фоновой флуоресценции с помощью программного обеспечения ImageJ.
   1. Откройте микроскопическое изображение в программе ImageJ и выберите интересующую область с помощью инструмента «Прямоугольник». Сохраните область выбора (α), щелкнув правой кнопкой мыши, и выберите Добавить в менеджер ROI (область интереса). Используйте эту область выделения для всех изображений.
   2. Выберите параметры для измерения в разделе «Анализ» > «Установить измерения » и выберите «Площадь», «Интегрированная плотность» и «Среднее значение серого » на вкладке настроек.
   3. Для каждого изображения используйте одну и ту же область выбора в менеджере ROI и выберите «Анализировать > измерять». Интегральное значение плотности представляет собой общую флуоресценцию (F_t) выбранной области. Запишите значения измерений во всплывающем окне.
   4. Чтобы скорректировать флуоресценцию фона (F_b) на каждом изображении, выделите небольшую область нефлуоресцентной области с помощью инструмента «Прямоугольник». Выберите Анализ > Измерить для этого региона. Среднее значение интенсивности представляет собой F_b. Запишите значения измерений во всплывающем окне.
   5. Рассчитайте CTCF, умножив среднюю интенсивность флуоресценции фоновых показаний на общую площадь ROI и вычтя это число из интегрированного значения плотности ROI. Повторите этот процесс для всех изображений для обеих групп лечения (контрольная и гипероксия).
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = Скорректированная общая флуоресценция клеток (A.M.)
      F_t = общая флуоресценция
      F_b = фоновая флуоресценция
      α = Область выбора

Чтобы выделить nTAEC, мы собрали аспираты трахеи у интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных и транспортировали аспираты на льду в лабораторию для дальнейшей обработки (рис. 1A). После посева образцов аспирата т...

В описанном здесь протоколе подробно описан метод сбора и обработки образцов аспирата трахеи новорожденных от интубированных новорожденных в отделении интенсивной терапии новорожденных с последующим выделением и расширением живых нТАЭК из этих образцов с использ?...

Авторам нечего раскрывать и сообщать о конфликте интересов.

Эта работа поддерживается финансированием от Пресвитерианского фонда здоровья (PHF) и Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 с премией за институциональное развитие (IDeA) от NIGMS) для AG. Мы хотели бы поблагодарить доктора Пола Лероу и доктора Синбинь Ай из Массачусетской больницы общего профиля, Гарвардской медицинской школы, Бостон, штат Массачусетс, за предоставление неонатальных донорских клеток, использованных в некоторых экспериментах. Фигуры создавались с помощью Biorender. Статистический анализ проводился с помощью GraphPad Prism.