A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודל תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) תוך שימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAEC) ומבצעים חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני המושרה על ידי אטמוספירה על תאים שמקורם באפיתל פני השטח של דרכי הנשימה המתפתחות.
אפיתל דרכי הנשימה הפגים חשוף כל הזמן לגורמי לחץ סביבתיים. אחד מגורמי הלחץ הללו בילודים עם מחלת ריאות כולל מתח חמצן (O2) גבוה יותר מהאטמוספירה הסביבתית - המכונה היפראוקסיה (>21% O2). השפעת ההיפראוקסיה על דרכי הנשימה תלויה בגורמים שונים, כולל השלב ההתפתחותי של דרכי הנשימה, מידת ההיפראוקסיה ומשך החשיפה, כאשר חשיפות משתנות עלולות להוביל לפנוטיפים ייחודיים. בעוד שקיים מחקר מקיף על השפעת היפראוקסיה על אלבאולריזציה של ריאות יילודים ותגובתיות יתר של דרכי הנשימה, מעט ידוע על ההשפעה הבסיסית לטווח הקצר והארוך של היפראוקסיה על תאי אפיתל של דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה עיקרית לכך היא המחסור במודל יעיל במבחנה לחקר התפתחות ותפקוד אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה של יילודים אנושיים (nTAECs) תוך שימוש בשאיבות קנה הנשימה של יילודים אנושיים ותרבית תאים אלה בתרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנו מדגימים כי nTAECs יוצרים תא חד-שכבתי מקוטב בוגר בתרבית ALI ועוברים התמיינות רירית. כמו כן, אנו מציגים שיטה לחשיפה מתונה להיפראוקסיה של חד-שכבת התא בתרבית ALI באמצעות אינקובטור מיוחד. בנוסף, אנו מתארים בדיקה למדידת מתח חמצוני תאי בעקבות חשיפה להיפראוקסיה בתרבית ALI באמצעות כימות פלואורסצנטי, המאשר כי חשיפה מתונה להיפרופקסיה גורמת למתח חמצוני תאי אך אינה גורמת לנזק משמעותי לקרום התא או לאפופטוזיס. ניתן להשתמש במודל זה כדי לדמות חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה קלינית בה נתקלים דרכי הנשימה של יילודים ביחידה לטיפול נמרץ בילודים (NICU) ולהשתמש בו כדי לחקור את ההשפעות הקצרות והארוכות טווח של O2 על תכנות אפיתל דרכי הנשימה של היילודים. ניתן להשתמש במחקרים המשתמשים במודל זה כדי לחקור דרכים להפחית פגיעה חמצונית בגיל מוקדם בדרכי הנשימה המתפתחות, המעורבת בהתפתחות מחלות ארוכות טווח בדרכי הנשימה אצל פגים לשעבר.
חמצן טיפולי (O2) הוא אחד הטיפולים הנפוצים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ יילודים (NICU)1. כתוצאה מכך, חשיפה להיפראוקסיה (>21% O2) היא גורם לחץ אטמוספרי שכיח בו נתקלים יילודים עם ובלי מחלת ריאות משמעותית. תגובות הריאות להיפראוקסיה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת ו/או משך החשיפה והמיקום האנטומי, סוג התא ושלב התפתחות הריאות 2,3,4,5,6. עיקר המחקר בפגיעה ריאתית היפראוקסיה בילודים התמקד בהשפעת החשיפה להיפראוקסיה בהקשר של אלבאולריזציה לאחר הלידה למודל דיספלזיה ברונכופולמונרית (BPD) - מחלת הריאות הכרונית הנפוצה ביותר הפוגעת בפגים 6,7,8,9,10,11. חומרת הפרעת אישיות גבולית מסווגת לפי כמות התמיכה הנשימתית, ו-O2 הדרוש בשבוע 36 לאחר גילהווסת 9. רוב התינוקות עם הפרעת אישיות גבולית משתפרים קלינית עם הזמן ככל שהריאות ממשיכות לגדול, כאשר רובם נגמלים מתמיכה נשימתית לפני יום הולדתם הראשון12,13. ללא קשר לחומרת הפרעת אישיות גבולית לאחר הלידה, תחלואה משמעותית המשפיעה על פגים לשעבר כוללת סיכון מוגבר פי 5 לצפצופים בגיל הרך, אסטמה, זיהומים נשימתיים חוזרים במהלך הילדות, ומחלת ריאות חסימתית כרוניתמוקדמת 12,14,15,16,17,18,19 . ההשפעה של היפראוקסיה על מחלות דרכי נשימה ארוכות טווח וזיהומים ריאתיים בפגים נחקרה באמצעות מודלים של בעלי חיים במבחנה וב-vivo 20,21,22,23,24. עם זאת, רוב המודלים הללו התמקדו בתפקיד הרקמה המזנכימלית, האפיתל המכתשית והשריר החלק של דרכי הנשימה 25,26,27,28.
אפיתל פני השטח של דרכי הנשימה מצפה את כל הנתיב של מערכת הנשימה, משתרע מקנה הנשימה עד לסימפונות הסופיים, ומסתיים ממש לפני מפלס הנאדיות29. תאי בסיס של דרכי הנשימה הם תאי הגזע העיקריים באפיתל דרכי הנשימה, עם היכולת להתמיין לכל הרפרטואר של שושלות אפיתל בוגרות של דרכי הנשימה, הכוללות תאים ריסניים ומפרישים (תאי מועדון: לא מייצרים ריר, ותאי גביע: מייצרי ריר)29,30,31,32. מחקרי תרבית תאים בהקשר של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים השתמשו בעיקר בקווי תאים של סרטן אנושי או עכבר בוגרים33,34. בנוסף, רוב הניסויים במבחנה השתמשו במערכות תרבית שקועות, שאינן מאפשרות התמיינות של התאים לאפיתל של דרכי הנשימה הריריות הדומה לאפיתל דרכי הנשימה in vivo בבני אדם35. כתוצאה מכך, קיים פער בידע לגבי ההשפעות של פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי היפראוקסיה בהתפתחות תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה אחת היא המחסור במודלים תרגומיים לחקר ההשפעות של חשיפה אטמוספרית על אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. פגיעה ריאתית היפראוקסית בשלב מוקדם בחיים עלולה להוביל למחלה ארוכת טווח בדרכי הנשימה ולסיכון מוגבר לזיהום, וכתוצאה מכך להשלכות משנות חיים אצל פגים לשעבר 14,36,37. בתינוקות שאינם שורדים עם הפרעת אישיות גבולית חמורה, לאפיתל פני השטח של דרכי הנשימה יש חריגות מובהקות, כולל היפרפלזיה של תאי גביע והתפתחות ריסנית לא תקינה, המציינת פינוי רירית לא תקין וגובה אפיתל מוגבר הפוגע בקליבר דרכי הנשימה38. בעשור האחרון, היה עניין גובר בתרבית תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לחקור את התפתחות האפיתל של דרכי הנשימה לאחר הלידה 39,40,41,42. עם זאת, מודלים של ALI של תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים לא שימשו בהקשר של מודלים של הפרעות חמצון חיזור אטמוספרי כגון חשיפה להיפראוקסיה.
באמצעות שיטה39 שפורסמה בעבר, השתמשנו בדגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים שהתקבלו מיילודים מונשמים בפגייה ובודדנו והרחבנו בהצלחה תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של קנה הנשימה (nTAECs). השתמשנו במעכבים של Rho, Smad, גליקוגן סינתאז קינאז (GSK3), ויעד יונקים של איתות רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל את יכולת ההתפשטות ולעכב את ההזדקנות בתאים אלה, כפי שתואר קודם לכן39,42, מה שמאפשר מעבר יעיל ומאוחר יותר של nTAECs. הפרוטוקול מתאר שיטות להקמת תרביות ALI תלת מימדיות באמצעות nTAECs וביצוע חשיפה להיפראוקסיה על חד-שכבות nTAEC. עיכוב Rho ו-Smad משמש במשך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI (ימי ALI 0 עד 7), ולאחר מכן מעכבים אלה מוסרים מאמצעי ההתמיינות למשך שארית תקופת תרבית ALI. המשטח האפיקלי של חד-שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה בתרבית ALI נשאר חשוף לסביבה43, מה שמאפשר מחקרי הפרעות אטמוספריות ודומה מאוד לפתוביולוגיה של דרכי נשימה מתפתחות של יילודים שנחשפו להיפראוקסיה in vivo. ריכוז ה-O2 ששימש במחקרי תרבית תאים קודמים (ללא קשר לתאים אימורטליים או ראשוניים) של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים משתנה באופן משמעותי (נע בין 40% ל-95%), וכך גם משך החשיפה (נע בין 15 דקות ל-10 ימים)36,44,45,46,47. במחקר זה, תאי ה-ALI נחשפו ל-60% O2 במשך 7 ימים מהיום ה-7 עד ה-14 של ALI (לאחר הסרת מעכבי Rho/Smad מאמצעי ההתמיינות). חשיפה להיפראוקסיה בוצעה בשלב המוקדם-אמצע של התמיינות הרירית (ALI יום 7 עד 14) בניגוד לאפיתל הבוגר המובחן במלואו ובכך מדמה את אפיתל דרכי הנשימה המתפתח in vivo בפגים. אסטרטגיית חשיפה זו ממזערת את הסיכון לרעילות O2 חריפה (הצפויה עם ריכוזים גבוהים יותר של O2) תוך הפעלת מתח חמצוני בטווח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ודומה לחלון המעבר הקריטי מהסביבה התוך רחמית ההיפוקסית יחסית לסביבה חיצונית היפראוקסית בילודים אנושיים פגים.
דגימות שאיבת קנה הנשימה של היילודים נאספו רק לאחר הסכמה מדעת של ההורים, והפרוטוקול המשמש לאיסוף, הובלה ואחסון אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (IRB 14377).
1. הכנה לבידוד, מעבר ותרבית ALI של nTAEC
2. בידוד והרחבה של nTAECs והכנה לתרבית ALI הבאה
3. תרבות ALI של nTAECs
הערה: יש לצבוע את תוספות תרבית התאים במדיה ממוזגת 804G ולדגור למשך 4 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לפני השלב הבא (ראה שלב 1.2).
4. בדיקת תפקוד מחסום במהלך התמיינות ALI
5. חשיפה להיפראוקסיה באמצעות חממת TriGas
6. בדיקת מתח חמצוני להערכת ההשפעות של היפראוקסיה
הערה: השתמשנו בערכת הבדיקה CM-H2DCFDA ומדדנו את עוצמת הקרינה ביום ה-14 של ALI כסמן לעקה חמצונית בתוספות תרבית תאים לאחר חשיפה ל-O2 . H2DCFDA היא צורה מופחתת כימית ואצטילית של 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF) המהווה אינדיקטור חי לתאים של מיני חמצן תגובתיים (ROS). CM-H2DCFDA הוא נגזרת הכלורו-מתיל התגובתי של H2DCFDA, המקדם קשירה קוולנטית נוספת לרכיבים תוך-תאיים, ומאפשר שמירה ארוכה יותר של הצבע בתוך התא. מולקולות אלה אינן פלואורסצנטיות עד להסרת קבוצות האצטט על ידי פעולת אסטרזות תוך-תאיות, וחמצון מתרחש בתא51. בעקבות חמצון תוך-תאי, ניתן למדוד את העלייה הנובעת מכך בקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמדד חלופי למתח חמצוני תאי52. המגיב קל ורגיש לאוויר ולכן יש להגן עליו מפני אור ולשמור עליו אטום ככל האפשר.
כדי לבודד nTAECs, אספנו שאיפות קנה נשימה מיילודים שעברו אינטובציה בפגייה והעברנו את השאיפות על קרח למעבדה להמשך עיבוד (איור 1A). לאחר זריעת דגימות השאיבה של קנה הנשימה במדיום גידול אפיתל של דרכי הנשימה (BLEAM-I המכיל מעכבי Rho/Smad, GSK3 ו-mTOR), הופיעו תאים קובו?...
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה לאיסוף ועיבוד של דגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים מיילודים אינטובציה בפגייה עם בידוד והרחבה של nTAECs חיים מדגימות אלה תוך שימוש בשיטות שנקבעו בעבר39. יתר על כן, תיארנו שיטה לתרבית nTAECs ב-ALI ואפיון ההתמיינות שלהם לאפיתל מקוטב של ד...
למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי אינטרסים לדווח עליהם.
עבודה זו נתמכת על ידי מימון מקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF) ומשאבים קליניים ותרגומיים משותפים של אוקלהומה (U54GM104938 עם פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מ-NIGMS) ל-AG. אנו רוצים להודות לד"ר פול לרו ולד"ר שינגבין איי מבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, על שסיפקו תאים מתורמי יילודים ששימשו בחלק מהניסויים. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-426796 | |
1X PBS (Phosphate Buffered Saline) Solution, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
A 83-01 | Tocris | 29-391-0 | |
ALI Transwell Inserts, 6.5mm | Corning | 3470 | |
Anti-Acetylated Tubulin antibody, Mouse monoclonal | Sigma | T7451 | |
Anti-alpha Tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
Anti-Cytokeratin 5 antibody | Abcam | ab53121 | |
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM) | LifeLine Cell Technology | LL-0023 | |
CHIR 99021 | Tocris | 44-231-0 | |
Cleaved caspase-3 antibody | Cell signaling | 9664T | |
SCGB1A1 or Club Cell Protein (CC16) Human, Rabbit Polyclonal Antibody | BioVendor R&D | RD181022220-01 | |
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator) | Thermo Scientific | C6827 | |
Corning Cell Culture Treated T25 Flasks | Corning | 430639 | |
Corning U-Shaped Cell Culture T75 Flasks | Corning | 430641U | |
CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay | Thermo Scientific | C20300 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | EN62248 | |
Dimethyl sulfoxide [DMSO] Hybri-Max | Sigma | D2650 | |
Distilled water | Gibco | 15230162 | |
EVOM Manual for TEER Measurement | World Precision Instrument | EVM-MT-03-01 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10082147 | |
Fluorescein Isothiocyanate Dextran (average mol wt 10,000) | Fisher Scientific | F0918100MG | |
Fluorescein isothiocyanate–dextran (average mol wt 20,00) | Sigma | FD20-100MG | |
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Human ads-HRP | Southern Biotech | 1031-05 | |
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21141 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), Mouse/Human ads-HRP | Southern Biotech | 4050-05 | |
HBTEC Air-Liquid Interface (ALI) Differentiation Medium | LifeLine Cell Technology | LM-0050 | |
HEPES | Lonza | CC-5024 | |
Heracell VIOS 160i Tri-Gas CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 51030411 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Scientific | 4368814 | |
HLL supplement | LifeLine Cell Technology | LS-1001 | |
ImageJ | NIH | N/A | imagej.nih.gov/ij/ |
Invivogen Normocin - Antimicrobial Reagent | Fisher Scientific | NC9273499 | |
L-Glutamine | LifeLine Cell Technology | LS-1013 | |
Normal Goat Serum | Gibco | PCN5000 | |
Normocin | Invivogen | ant-nr-05 | |
p63 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-25268 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183025 | |
RAPAMYCIN | Thermo Scientific | AAJ62473MC | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Scientific | 4444964 | |
Taqman Gene Exression Assays: 18S rRNA | Thermo Scientific | Hs99999901_s1 | |
Taqman Gene Exression Assays: CAT | Thermo Scientific | Hs00156308_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: FOXJ1 | Thermo Scientific | Hs00230964_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GAPDH | Thermo Scientific | Hs02786624_g1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX1 | Thermo Scientific | Hs00829989_gH | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX2 | Thermo Scientific | Hs01591589_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: GPX3 | Thermo Scientific | Hs01078668_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: KRT5 | Thermo Scientific | Hs00361185_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: MUC5AC | Thermo Scientific | Hs01365616_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SCGB1A1 | Thermo Scientific | Hs00171092_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SOD1 | Thermo Scientific | Hs00533490_m1 | |
Taqman Gene Exression Assays: SOD2 | Thermo Scientific | Hs00167309_m1 | |
Thermo Scientific Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane (0.22 μm pores, 500 ml) | Thermo Scientific | 5660020 | |
TM-1 Combined Supplement | LifeLine Cell Technology | LS-1055 | |
Total caspase-3 antibody | Cell signaling | 14220S | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Gibco | 25300062 | |
Y-27632 2 HCl | Tocris | 12-541-0 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved