מודל תרבית תלת מימד תרגומי להערכת השפעות היפראוקסיה על תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים

אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודל תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) תוך שימוש בתאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה בילודים (nTAEC) ומבצעים חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית כדי לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני המושרה על ידי אטמוספירה על תאים שמקורם באפיתל פני השטח של דרכי הנשימה המתפתחות.

אפיתל דרכי הנשימה הפגים חשוף כל הזמן לגורמי לחץ סביבתיים. אחד מגורמי הלחץ הללו בילודים עם מחלת ריאות כולל מתח חמצן (O₂) גבוה יותר מהאטמוספירה הסביבתית - המכונה היפראוקסיה (>21% O₂). השפעת ההיפראוקסיה על דרכי הנשימה תלויה בגורמים שונים, כולל השלב ההתפתחותי של דרכי הנשימה, מידת ההיפראוקסיה ומשך החשיפה, כאשר חשיפות משתנות עלולות להוביל לפנוטיפים ייחודיים. בעוד שקיים מחקר מקיף על השפעת היפראוקסיה על אלבאולריזציה של ריאות יילודים ותגובתיות יתר של דרכי הנשימה, מעט ידוע על ההשפעה הבסיסית לטווח הקצר והארוך של היפראוקסיה על תאי אפיתל של דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה עיקרית לכך היא המחסור במודל יעיל במבחנה לחקר התפתחות ותפקוד אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל של דרכי הנשימה של קנה הנשימה של יילודים אנושיים (nTAECs) תוך שימוש בשאיבות קנה הנשימה של יילודים אנושיים ותרבית תאים אלה בתרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). אנו מדגימים כי nTAECs יוצרים תא חד-שכבתי מקוטב בוגר בתרבית ALI ועוברים התמיינות רירית. כמו כן, אנו מציגים שיטה לחשיפה מתונה להיפראוקסיה של חד-שכבת התא בתרבית ALI באמצעות אינקובטור מיוחד. בנוסף, אנו מתארים בדיקה למדידת מתח חמצוני תאי בעקבות חשיפה להיפראוקסיה בתרבית ALI באמצעות כימות פלואורסצנטי, המאשר כי חשיפה מתונה להיפרופקסיה גורמת למתח חמצוני תאי אך אינה גורמת לנזק משמעותי לקרום התא או לאפופטוזיס. ניתן להשתמש במודל זה כדי לדמות חשיפה להיפראוקסיה רלוונטית מבחינה קלינית בה נתקלים דרכי הנשימה של יילודים ביחידה לטיפול נמרץ בילודים (NICU) ולהשתמש בו כדי לחקור את ההשפעות הקצרות והארוכות טווח של O₂ על תכנות אפיתל דרכי הנשימה של היילודים. ניתן להשתמש במחקרים המשתמשים במודל זה כדי לחקור דרכים להפחית פגיעה חמצונית בגיל מוקדם בדרכי הנשימה המתפתחות, המעורבת בהתפתחות מחלות ארוכות טווח בדרכי הנשימה אצל פגים לשעבר.

חמצן טיפולי (O₂) הוא אחד הטיפולים הנפוצים ביותר ביחידה לטיפול נמרץ יילודים (NICU)¹. כתוצאה מכך, חשיפה להיפראוקסיה (>21% O₂) היא גורם לחץ אטמוספרי שכיח בו נתקלים יילודים עם ובלי מחלת ריאות משמעותית. תגובות הריאות להיפראוקסיה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת ו/או משך החשיפה והמיקום האנטומי, סוג התא ושלב התפתחות הריאות 2,3,4,5,6. עיקר המחקר בפגיעה ריאתית היפראוקסיה בילודים התמקד בהשפעת החשיפה להיפראוקסיה בהקשר של אלבאולריזציה לאחר הלידה למודל דיספלזיה ברונכופולמונרית (BPD) - מחלת הריאות הכרונית הנפוצה ביותר הפוגעת בפגים 6,7,8,9,10,11. חומרת הפרעת אישיות גבולית מסווגת לפי כמות התמיכה הנשימתית, ו-O₂ הדרוש בשבוע 36 לאחר גיל^{הווסת 9}. רוב התינוקות עם הפרעת אישיות גבולית משתפרים קלינית עם הזמן ככל שהריאות ממשיכות לגדול, כאשר רובם נגמלים מתמיכה נשימתית לפני יום הולדתם הראשון^12,13. ללא קשר לחומרת הפרעת אישיות גבולית לאחר הלידה, תחלואה משמעותית המשפיעה על פגים לשעבר כוללת סיכון מוגבר פי 5 לצפצופים בגיל הרך, אסטמה, זיהומים נשימתיים חוזרים במהלך הילדות, ומחלת ריאות חסימתית כרונית^מוקדמת 12,14,15,16,17,18,19 . ההשפעה של היפראוקסיה על מחלות דרכי נשימה ארוכות טווח וזיהומים ריאתיים בפגים נחקרה באמצעות מודלים של בעלי חיים במבחנה וב-vivo 20,21,22,23,24. עם זאת, רוב המודלים הללו התמקדו בתפקיד הרקמה המזנכימלית, האפיתל המכתשית והשריר החלק של דרכי הנשימה 25,26,27,28.

אפיתל פני השטח של דרכי הנשימה מצפה את כל הנתיב של מערכת הנשימה, משתרע מקנה הנשימה עד לסימפונות הסופיים, ומסתיים ממש לפני מפלס הנאדיות²⁹. תאי בסיס של דרכי הנשימה הם תאי הגזע העיקריים באפיתל דרכי הנשימה, עם היכולת להתמיין לכל הרפרטואר של שושלות אפיתל בוגרות של דרכי הנשימה, הכוללות תאים ריסניים ומפרישים (תאי מועדון: לא מייצרים ריר, ותאי גביע: מייצרי ריר)29,30,31,32. מחקרי תרבית תאים בהקשר של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים השתמשו בעיקר בקווי תאים של סרטן אנושי או עכבר בוגרים^33,34. בנוסף, רוב הניסויים במבחנה השתמשו במערכות תרבית שקועות, שאינן מאפשרות התמיינות של התאים לאפיתל של דרכי הנשימה הריריות הדומה לאפיתל דרכי הנשימה in vivo בבני אדם³⁵. כתוצאה מכך, קיים פער בידע לגבי ההשפעות של פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי היפראוקסיה בהתפתחות תאי אפיתל בדרכי הנשימה של יילודים אנושיים. סיבה אחת היא המחסור במודלים תרגומיים לחקר ההשפעות של חשיפה אטמוספרית על אפיתל דרכי הנשימה של יילודים אנושיים. פגיעה ריאתית היפראוקסית בשלב מוקדם בחיים עלולה להוביל למחלה ארוכת טווח בדרכי הנשימה ולסיכון מוגבר לזיהום, וכתוצאה מכך להשלכות משנות חיים אצל פגים לשעבר 14,36,37. בתינוקות שאינם שורדים עם הפרעת אישיות גבולית חמורה, לאפיתל פני השטח של דרכי הנשימה יש חריגות מובהקות, כולל היפרפלזיה של תאי גביע והתפתחות ריסנית לא תקינה, המציינת פינוי רירית לא תקין וגובה אפיתל מוגבר הפוגע בקליבר דרכי הנשימה³⁸. בעשור האחרון, היה עניין גובר בתרבית תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לחקור את התפתחות האפיתל של דרכי הנשימה לאחר הלידה 39,40,41,42. עם זאת, מודלים של ALI של תאי אפיתל של דרכי הנשימה בילודים לא שימשו בהקשר של מודלים של הפרעות חמצון חיזור אטמוספרי כגון חשיפה להיפראוקסיה.

באמצעות שיטה³⁹ שפורסמה בעבר, השתמשנו בדגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים שהתקבלו מיילודים מונשמים בפגייה ובודדנו והרחבנו בהצלחה תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה של קנה הנשימה (nTAECs). השתמשנו במעכבים של Rho, Smad, גליקוגן סינתאז קינאז (GSK3), ויעד יונקים של איתות רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל את יכולת ההתפשטות ולעכב את ההזדקנות בתאים אלה, כפי שתואר קודם לכן^39,42, מה שמאפשר מעבר יעיל ומאוחר יותר של nTAECs. הפרוטוקול מתאר שיטות להקמת תרביות ALI תלת מימדיות באמצעות nTAECs וביצוע חשיפה להיפראוקסיה על חד-שכבות nTAEC. עיכוב Rho ו-Smad משמש במשך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI (ימי ALI 0 עד 7), ולאחר מכן מעכבים אלה מוסרים מאמצעי ההתמיינות למשך שארית תקופת תרבית ALI. המשטח האפיקלי של חד-שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה בתרבית ALI נשאר חשוף לסביבה⁴³, מה שמאפשר מחקרי הפרעות אטמוספריות ודומה מאוד לפתוביולוגיה של דרכי נשימה מתפתחות של יילודים שנחשפו להיפראוקסיה in vivo. ריכוז ה-O₂ ששימש במחקרי תרבית תאים קודמים (ללא קשר לתאים אימורטליים או ראשוניים) של פגיעה ריאתית היפראוקסית בילודים משתנה באופן משמעותי (נע בין 40% ל-95%), וכך גם משך החשיפה (נע בין 15 דקות ל-10 ימים)36,44,45,46,47. במחקר זה, תאי ה-ALI נחשפו ל-60% O₂ במשך 7 ימים מהיום ה-7 עד ה-14 של ALI (לאחר הסרת מעכבי Rho/Smad מאמצעי ההתמיינות). חשיפה להיפראוקסיה בוצעה בשלב המוקדם-אמצע של התמיינות הרירית (ALI יום 7 עד 14) בניגוד לאפיתל הבוגר המובחן במלואו ובכך מדמה את אפיתל דרכי הנשימה המתפתח in vivo בפגים. אסטרטגיית חשיפה זו ממזערת את הסיכון לרעילות O₂ חריפה (הצפויה עם ריכוזים גבוהים יותר של O₂) תוך הפעלת מתח חמצוני בטווח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ודומה לחלון המעבר הקריטי מהסביבה התוך רחמית ההיפוקסית יחסית לסביבה חיצונית היפראוקסית בילודים אנושיים פגים.

דגימות שאיבת קנה הנשימה של היילודים נאספו רק לאחר הסכמה מדעת של ההורים, והפרוטוקול המשמש לאיסוף, הובלה ואחסון אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (IRB 14377).

1. הכנה לבידוד, מעבר ותרבית ALI של nTAEC

1. הכנת מדיה
   1. מדיום אפיתל סימפונות (BLEAM) עם מעכבים (BLEAM-I): הכן 500 מ"ל (בקבוק אחד, מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס) של BLEAM על ידי הוספת 1.25 מ"ל של תוסף HLL (500 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין בסרום אנושי, 0.6 מיקרומטר חומצה לינולאית, 0.6 מיקרוגרם/מ"ל לציטין), 15 מ"ל L-גלוטמין (6 מ"מ), 2 מ"ל תמצית P (0.4%, תמצית יותרת המוח בקר), 5 מ"ל TM1 (1 מיקרומטר אפינפרין, 5 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 10 ננומטר טריודוטירונין, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 5 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי (EGF), 5 ננוגרם/מ"ל אינסולין), 1 מ"ל תמיסת אנטיביוטיקה (נורמוצין, 0.1 מ"ג/מ"ל). כדי למנוע הזדקנות של התאים הראשוניים ולשפר את יעילות ההתפשטות, הוסף את מעכבי גורם הגדילה הבאים כפי שתואר קודם לכן³⁹: Y-27632 (מעכב חלבון קינאז או מעכב ROCK) עם ריכוז סופי של 5 מיקרומטר, A83-01 (מעכב איתות Smad) עם ריכוז סופי של 1 מיקרומטר, CHIR 99021 (מעכב גליקוגן סינתאז קינאז-3 או מעכב GSK3) עם ריכוז סופי של 0.4 מיקרומטר ורפמיצין (מעכב מטרה מולקולרית של רפמיצין או mTOR) עם ריכוז סופי ריכוז של 5 ננומטר. סנן את המדיה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה של רכיבי מדיה.
   2. מדיום ALI של תאי אפיתל סימפונות/קנה הנשימה האנושיים (HBTEC): הכינו 500 מ"ל של חומר HBTEC על ידי הפשרת הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס והוספת 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה (נורמוצין, 0.1 מ"ג/מ"ל). לאחר ההוספה, סנן את המדיה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
   3. מדיית HBTEC עם מעכבים (HBTEC-I): הכן את מדיית HBTEC כמפורט לעיל. לפני הסינון יש להוסיף את המעכבים הבאים: Y-27632 בריכוז סופי של 5 מיקרומטר ו-A83-01 בריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר.
      הערה: אחסן מדיה BLEAM-I, HBTEC ו-HBTEC-I בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מתוארכת ומסומנת, בחושך (עטוף בנייר כסף), ורק לחמם את הכמות הדרושה (חיי המדף הם 30 יום).
   4. HEPES/FBS: הוסיפו 500 מ"ל של מי מלח עם חוצץ HEPES ו-88 מ"ל של FBS (הריכוז הסופי הוא 15%). לאחר ההוספה, סנן את התמיסה דרך מסנן בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מתוארכת ומסומנת.
      הערה: יש לחמם את BLEAM, HEPES-FBS ו-Trypsin-EDTA ל-37 מעלות צלזיוס (לפחות 30 דקות) לפני השימוש.
2. ציפוי צלוחיות תרבית ותוספות תרבית תאים ALI עם מדיום ממוזג 804G
   1. הכן מדיה מותנית מטריצת תא 804G (קו תאי אפיתל של שלפוחית השתן של חולדה) כפי שתואר קודם לכן³⁹.
   2. מצפים את בקבוק תרבית התאים ותוספות תרבית התאים במדיה מותנית 804G למשך 4 שעות לפחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. עיין בטבלה 2 לכמויות המדיה הדרושות לציפוי צלוחיות תרבית שונות ותוספות תרבית תאים.

2. בידוד והרחבה של nTAECs והכנה לתרבית ALI הבאה

1. רכשו שאיבה טרייה של קנה הנשימה (כ-1 מ"ל) במהלך יניקה שגרתית של הצינור האנדוטרכיאלי של יילודים מונשמים ואספו את השאיפה במלכודת ריר. אם נפח השאיבה אינו מספיק כדי להגיע למלכודת הריר, שטפו את קטטר היניקה עם 1-3 מ"ל מי מלח סטריליים.
2. סמן את הדגימה ואחסן אותה בשקית ביולוגית על קרח.
   הערה: ניתן לאחסן את הדגימות על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לכל היותר. עם זאת, התשואה גבוהה יותר עם דגימות טריות.
3. העבר את הדגימה מהפגייה למעבדה. מצפים בקבוק T25 במדיה מותנית 804G ומתכוננים לחיסון הדגימה בזמן הובלת שאיבת קנה הנשימה למעבדה.
4. הסר את מלכודת הריר משקית הסכנה הביולוגית ונקה היטב את המשטחים החיצוניים עם 70% אתנול כדי למנוע זיהום. פתח בזהירות את המכסה על מלכודת הריר מתחת למכסה מנוע סטרילי של תרבית תאים.
5. יש לדלל את דגימת שאיבת קנה הנשימה עם PBS סטרילי ל-5 מ"ל (לדילול ריר) ולהעביר את כל התוכן לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
6. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 250 x גרם, 20°C-23°C למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט (כולל ריר).
   הערה: כל הצנטריפוגות כאן נעשות בטמפרטורה של 250 x גרם, 20 °C-23 °C למשך 5 דקות אלא אם צוין אחרת.
7. השעו מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של BLEAM-I.
8. הסר את בקבוק T25 מהחממה והשליך את המדיה הממוזגת 804G לפני ציפוי הדגימה.
9. צלחו את הדגימה בבקבוק T25 והניחו בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ (זה ייקרא מעבר 0 או P0).
10. החלף את המדיה עם BLEAM-I 24 שעות לאחר הציפוי כדי לשטוף תאים לא מחוברים ולאחר מכן כל 48 שעות.
    הערה: לאחר עיבוד דגימת השאיבה של קנה הנשימה והדגירה שלה במדיה BLEAM-I, תאים בצורת קוביה מופיעים 7-10 ימים לאחר הציפוי. בסביבות 3 שבועות לאחר הציפוי, התאים ארוזים בצפיפות ודורשים טריפסיניזציה לצורך מעבר, הרחבה ואחסון לאחר מכן. תאי מעבר מוקדם (P1 - P2) ממוקמים בצינורות קריו-צינורות (2.5 x 10⁶ תאים לכל 500 מיקרוליטר של חומרי הקפאה לכל קריו-טיוב) ומאוחסנים בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
11. הפשירו במהירות תאים קפואים מחנקן נוזלי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והעבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי בגודל מתאים המכיל BLEAM-I.
12. ספור את התאים כדי לקבוע את מספר התאים הכולל והחי באמצעות כתם כחול טריפן ומונה תאים אוטומטי או ידני כמתואר קודם לכן⁴⁸. יש לדלל את תרחיף התאים בנפח מתאים של BLEAM-I, כך שהריכוז הסופי הוא 2.1 x 10⁶ תאים ב-15 מ"ל של תרחיף תאים (עבור בקבוק T75).
    הערה: עבור בקבוק T25, 0.7 x 10⁶ תאים ב-5 מ"ל של תרחיף תאים משמשים בדרך כלל לזריעה.
13. העבירו את תרחיף התאים בנפח 15 מ"ל לבקבוק T75 ודגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
14. למחרת בבוקר, החליפו את התקשורת עם BLEAM-I החדש. לאחר מכן, החליפו את המדיה ב-BLEAM-I חדש כל יומיים. ברגע שהתאים בסביבות 80%-90%, הם מוכנים לטריפסין לתרבית ALI.
15. החל 5 מ"ל של טריפסין-EDTA (T75) על תא חד-שכבתי.
    הערה: זכרו להשתמש בטריפסין טרי. הימנעו משימוש בטריפסין שחומם מספר פעמים.
16. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בחממה. לאחר מכן, הקש על צד הבקבוק 8x-10x כדי לעקור את התאים. בדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נעקרו לאחר טריפסיניזציה. אם >50% מהתאים נשארים על הבקבוק, יש לשטוף עם PBS 2x ולחזור על שלב הטריפסיניזציה עם זמן דגירה מופחת של 2-3 דקות.
17. עצור את התגובה עם 15 מ"ל של HEPES-FBS ופיפטה למעלה ולמטה 4x-5x. העבירו את התאים לצינור סטרילי בגודל מתאים וצנטריפוגה ב-250 x גרם למשך 5 דקות כדי לגלול את התאים.
18. לאחר צנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. ממיסים את כדור התא ב-1 מ"ל של BLEAM-I על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 5x-10x.
19. ספור את התאים כדי לקבוע את מספר התא הכולל ואת מספר התא החי. יש לדלל את תרחיף התאים בנפח מתאים של BLEAM-I, כך שהריכוז הסופי הוא 1 x 10⁵ תאים חיים לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים.

3. תרבות ALI של nTAECs

הערה: יש לצבוע את תוספות תרבית התאים במדיה ממוזגת 804G ולדגור למשך 4 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ לפני השלב הבא (ראה שלב 1.2).

1. הסר את צלחות תרבית התאים בעלות 24 בארות המכילות את תוספות תרבית התאים מהחממה והשליך את המדיה המותנית ב-804G.
2. הוסף 1 מ"ל של BLEAM-I לתא הבסיסי (התחתון) של כל באר ALI. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים (1 x 10⁵ תאים) לתא האפיקלי של מוסיף תרבית התאים ALI ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. שלב זה מוגדר כ-ALI יום -2.
3. למחרת, החלף את המדיה בתאים הבסיסיים (1 מ"ל) והאפיקליים (100 מיקרוליטר) עם BLEAM-I טרי. בעת החלפת המדיה בתא האפיקלי, היזהר לא להפריע לחד-שכבת התא. שלב זה מוגדר כ-ALI יום -1.
4. למחרת, הסר את המדיה הן מהתא הבסיסי והן מהתא האפיקלי.
   הערה: לוקח יומיים עד שהתאים על קרום תרבית התאים מתכנסים בתנאים שקועים. בשלב זה ניתן להקים ALI.
5. הוסף 1 מ"ל של מדיה HBTEC-I לתא הבסיסי אך השאר את מדיה התא האפיקלי חופשית וחשופה לאוויר. שלב זה מוגדר כיום ALI 0.
6. המשך להחליף את המדיה HBTEC-I (1 מ"ל) בתא הבסיסי כל 48 שעות מיום 0 עד 6 של ALI. עבור למדיית HBTEC רגילה (ללא מעכבים) ביום 7 של ALI עד לנקודת הזמן הרצויה של הקציר.
   הערה: במהלך 7 הימים הראשונים של תרבית ALI, מדיה מהתא הבסיסי עלולה לדלוף לתוך החדר האפיקלי. יש לשאוב את המדיה הזו בזהירות מדי יום כדי לשמור על בריאות שכבת התא ולאפשר להם להתמיין.
7. קצור תאים, תוספות תרבית תאים ומדיה בסיסית בנקודות זמן שונות לטכניקות מולקולריות, בדיקות וניתוח.
   1. עבור פרוטוקול זה, בימי ALI 0, 7 ו-28, קצרו תאים לניתוח ביטוי גנים qPCR (פרוטוקול יצרן סטנדרטי) של סמני התמיינות אפיתל. בימי ALI 0, 7, 14 ו-28, תוספות תרבית תאים לבדיקת תפקוד המחסום (שיטות המתוארות להלן).
   2. בימים 0 ו-28 של ALI, השתמש בתוספות תרבית תאים קבועות פורמלין לצביעה אימונו-פלואורסצנטית עם סמני התמיינות אפיתל (תוך שימוש בפרוטוקול שפורסם בעבר)⁴⁹. ביום ה-14 של ALI, קצירת מדיה בסיסית לשחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) (פרוטוקול יצרן סטנדרטי), ליזאטים של תאים ל-qPCR של סמני עקה חמצונית, ואימונובלוט עם נוגדנים caspase-3 ו-caspase-3 שסועים (פרוטוקול יצרן סטנדרטי), ותוספות תרבית תאים לבדיקת עקה חמצונית (שיטה המתוארת להלן).

4. בדיקת תפקוד מחסום במהלך התמיינות ALI

1. מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER)
   הערה: מדוד TEER באמצעות מד וולט/אוהם אפיתל (EVOM) במהלך התמיינות ALI כדי להעריך את תקינות שכבת התא⁵⁰.
   1. לפני מדידת ערכי התנגדות מסנן הבדיקה, השתמש בתרבית תאים מצופה מדיה מותנית 804G (נטולת תאים) כדי למדוד את ערך התנגדות הרקע באוהם (Ω)
   2. הפחיתו את ערך התנגדות הרקע מערכי ההתנגדות של מסנן הבדיקה והכפילו את ההבדל בשטח הפנים של גידול התא כדי לקבל ערך TEER עבור כל מסנן בדיקה.
      TEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (Ω.ס"מ²)
      Ω_T = ערך התנגדות מסנן בדיקה (Ω)
      Ω_B = ערך התנגדות רקע (Ω)
      C = שטח הפנים של גידול התאים (ס"מ²)
      הערה: תוספות תרבית תאים המשמשות למדידות TEER מקובעות לאחר מכן עם פורמלין חוצץ של 10% ומשמשות מיד לצביעה אימונו-פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית (שיטה המתוארת להלן) או מאוחסנות ב-4 מעלות צלזיוס לצביעה מאוחר יותר.
2. בדיקת חדירות אפיתל פלואורסצאין איזתיונאט דקסטרן (FITC-dextran)
   הערה: בדיקת חדירות אפיתל בוצעה תוך שימוש בשני משקלים מולקולריים שונים של FITC-dextan (10 kD ו-20 kD) במהלך התמיינות ALI.
   1. הכן תמיסת עבודה של FITC-dextan (1 מ"ג/מ"ל): מדוד 5 מ"ג של FITC וערבב פנימה 1 מ"ל של DMSO (5 מ"ג/מ"ל). יש להשעות מלאי של 5 מ"ג/מ"ל במדיה HBTEC המחוממת ל-37 מעלות צלזיוס לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. הגן על התמיסה מפני אור.
   2. העבירו מסנני בדיקה (המכילים תאים) לצלחת חדשה של 12 בארות והוסיפו 1 מ"ל של מדיה HBTEC בתא הבסיסי.
   3. שאפו את מדיית התא האפיקלי (אם קיימת) והחליפו ב-250 מיקרוליטר של תמיסת עבודה FITC-dextran. דגירה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור למשך 60 דקות.
   4. סיים את בדיקת FITC-dextran על ידי הסרת מסנני הבדיקה (המכילים תמיסת עבודה FITC-dextran) מלוח 12 הבארות.
   5. אסוף את המדיה הבסיסית מצלחת 12 הבארות בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומערבולת.
   6. העבירו 100 מיקרוליטר אליקוטים מכל צינור למיקרו-פלטת פוליסטירן שחורה תחתונה שקופה של 96 בארות בשלושה עותקים. העבר 100 מיקרוליטר של מדיית HBTEC לבארות נוספות בלוח 96 הבארות כבקרה שלילית למדידת פלואורסצנטיות ברקע.
   7. מדוד את עוצמת הקרינה באמצעות ספקטרופוטומטר באמצעות עירור של 490 ננומטר ומקסימום פליטה של 520 ננומטר.
   8. הפחיתו את ערך הקרינה הממוצע ברקע מערכי הקרינה של מסנן הבדיקה כדי לקבל פלואורסצנטיות מתוקנת ולבטא את הערכים כאחוז מול ערכי הקרינה המתוקנים ביום ALI 0 עבור FITC 10 kD ו-20 kD.

5. חשיפה להיפראוקסיה באמצעות חממת TriGas

1. ביום 7 של ALI, קבע את מספר התוספות של תרבית תאים שיש להכניס להיפראוקסיה על סמך צרכי הניסוי והקציר.
2. הגדר את רמת O₂ בחממת TriGas ל-60% O₂. בדרך כלל לוקח ~30-45 דקות עד שרמת O₂ מגיעה ל-60%.
3. ברגע שרמת ה-O₂ מתייצבת על 60%, הניחו את צלחת תרבית התאים בת 24 הבארות עם תוספות תרבית התאים שהוקצו לקבוצת ההיפראוקסיה בתוך החממה וסגרו את דלת החממה.
   הערה: שלב זה צריך להתבצע בצורה יעילה ככל האפשר כדי למנוע ירידה משמעותית ברמת O₂ בתוך החממה.
4. שנה את המדיה בתוספות תרבית התאים החשופות להיפראוקסיה בהתאם לאותו לוח זמנים כמו בארות הבקרה (21% O₂ חשופות). בדוק את תוספות תרבית התאים מדי יום לאיתור דליפת מדיה ושאף בעדינות כל דליפה לתא תרבית התאים.
5. המשך חשיפה להיפראוקסיה במשך 7 ימים (ALI ימים 7 עד 14). לאחר השלמת החשיפה להיפראוקסיה, קצרו תאים או בצעו בדיקות באמצעות תוספות תרבית תאים ביום ה-14 של ALI.

6. בדיקת מתח חמצוני להערכת ההשפעות של היפראוקסיה

הערה: השתמשנו בערכת הבדיקה CM-H2DCFDA ומדדנו את עוצמת הקרינה ביום ה-14 של ALI כסמן לעקה חמצונית בתוספות תרבית תאים לאחר חשיפה ל-O₂ . H₂DCFDA היא צורה מופחתת כימית ואצטילית של 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF) המהווה אינדיקטור חי לתאים של מיני חמצן תגובתיים (ROS). CM-H₂DCFDA הוא נגזרת הכלורו-מתיל התגובתי של H₂DCFDA, המקדם קשירה קוולנטית נוספת לרכיבים תוך-תאיים, ומאפשר שמירה ארוכה יותר של הצבע בתוך התא. מולקולות אלה אינן פלואורסצנטיות עד להסרת קבוצות האצטט על ידי פעולת אסטרזות תוך-תאיות, וחמצון מתרחש בתא⁵¹. בעקבות חמצון תוך-תאי, ניתן למדוד את העלייה הנובעת מכך בקרינה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמדד חלופי למתח חמצוני תאי⁵². המגיב קל ורגיש לאוויר ולכן יש להגן עליו מפני אור ולשמור עליו אטום ככל האפשר.

1. הכנת תמיסת בדיקת CM-H2DCFDA: כל בקבוקון מכיל 50 מיקרוגרם של צבע מגיב בצורת אבקה. להכנת תמיסת מלאי של 1 מ"מ, הוסיפו לבקבוקון 80 מיקרוליטר של DMSO סטרילי, ערבבו היטב עם פיפטה ומערבלו בעדינות. עבור ריכוז סופי של 1 מיקרומטר של הצבע בתוספות תרבית תאים, הוסף 0.1 מיקרוליטר ממלאי 1 מ"מ לכל 100 מיקרוליטר PBS (למשל, הוסף תמיסת מלאי של 0.6 מיקרוליטר ל-600 מיקרוליטר PBS עבור 6 תוספות תרבית תאים).
   הערה: הריכוז הסופי של הצבע יכול לנוע בין 1-5 מיקרומטר. יש למטב את המינון לכל מצב תרבית.
2. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הצבע של 1 מיקרומטר בכל תרבית תאים הן עבור הקבוצה שנחשפה להיפראוקסיה והן עבור הקבוצה שנחשפה לנורמוקסיה. השתמש בתרבית תאים אחת לפחות כבקרה שלילית מכל קבוצת טיפול (100 מיקרוליטר PBS ללא צבע). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מוגנת מפני אור. שטפו 1x עם PBS.
3. הכנת שקופית: מסננים את כל ה-PBS העודף. החזק בזהירות את תוספות תרבית התאים והשתמש בלהב כדי לחתוך לאט את קרום תרבית התאים. יוצקים 1-2 טיפות נוזל הרכבה על השקופית. בעזרת מלקחיים שטוחים, החזק בזהירות את פינת הממברנה, הנח אותה עם צד התא כלפי מטה על התושבת וכסה אותה בהחלקת כיסוי. הסר עודפי נוזל הרכבה והשאיר לייבוש באוויר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. השקופיות מוכנות כעת לצילום.
   הערה: יש לבצע את הכנת השקופית והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית במהירות האפשרית מכיוון שעוצמת הפלואורסצנט דועכת משמעותית במשך 2-3 שעות.
4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית: צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך שימוש בערוץ Cy2 (ציאנין-2). צלם תמונות משלושה אזורים נפרדים שאינם חופפים לכל תרבית תאים.
5. זיהוי פלואורסצנטי של מתח חמצוני
   הערה: השתמש בתמונות ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי למדוד פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים (CTCF) באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) וזרימת העבודה המתוארת להלן. CTCF משמש כסמן לעקה חמצונית בתוספות תרבית התאים לאחר חשיפה להיפראוקסיה ונמדד על ידי ביטול הקרינה ברקע בעזרת תוכנת ImageJ.
   1. פתחו את תמונת המיקרוסקופיה ב-ImageJ ובחרו את אזור העניין בעזרת הכלי מלבן. שמור את אזור הבחירה (α) על-ידי לחיצה ימנית ובחר הוסף למנהל החזר ההשקעה (אזור עניין). השתמשו באזור בחירה זה בכל התמונות.
   2. בחר את הפרמטרים למדידה תחת Analyze > Set Measurements ובחר Area, Integrated Density ו-Mean Gray Value בכרטיסייה Settings.
   3. עבור כל תמונה, השתמש באותו אזור בחירה ממנהל ההחזר על ההשקעה ובחר Analyze > Measure. ערך הצפיפות המשולב מייצג את הקרינה הכוללת (F_t) של האזור הנבחר. רשום את ערכי המדידה מהחלון המוקפץ.
   4. כדי לתקן את הקרינה ברקע (F_b) בכל תמונה, בחר אזור קטן של אזור שאינו פלואורסצנטי בעזרת הכלי מלבן. בחר נתח > מדידה עבור אזור זה. ערך העוצמה הממוצע מייצג את F_b. רשום את ערכי המדידה מהחלון המוקפץ.
   5. חשב CTCF על ידי הכפלת עוצמת הקרינה הממוצעת של קריאות רקע בשטח הכולל של ה-ROI והפחתת מספר זה מערך הצפיפות המשולב של ה-ROI. חזור על תהליך עבודה זה עבור כל התמונות עבור שתי קבוצות הטיפול (Control ו-Hyperoxia).
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = פלואורסצנציה כוללת מתוקנת של תאים (A.U.)
      F_t = פלואורסצנטיות כוללת
      F_b = פלואורסצנטי רקע
      α = אזור בחירה

כדי לבודד nTAECs, אספנו שאיפות קנה נשימה מיילודים שעברו אינטובציה בפגייה והעברנו את השאיפות על קרח למעבדה להמשך עיבוד (איור 1A). לאחר זריעת דגימות השאיבה של קנה הנשימה במדיום גידול אפיתל של דרכי הנשימה (BLEAM-I המכיל מעכבי Rho/Smad, GSK3 ו-mTOR), הופיעו תאים קובו?...

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה לאיסוף ועיבוד של דגימות שאיבת קנה הנשימה של יילודים מיילודים אינטובציה בפגייה עם בידוד והרחבה של nTAECs חיים מדגימות אלה תוך שימוש בשיטות שנקבעו בעבר³⁹. יתר על כן, תיארנו שיטה לתרבית nTAECs ב-ALI ואפיון ההתמיינות שלהם לאפיתל מקוטב של ד...

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגודי אינטרסים לדווח עליהם.

עבודה זו נתמכת על ידי מימון מקרן הבריאות הפרסביטריאנית (PHF) ומשאבים קליניים ותרגומיים משותפים של אוקלהומה (U54GM104938 עם פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מ-NIGMS) ל-AG. אנו רוצים להודות לד"ר פול לרו ולד"ר שינגבין איי מבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, על שסיפקו תאים מתורמי יילודים ששימשו בחלק מהניסויים. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות GraphPad Prism.