Modelo de cultivo celular 3D traslacional para evaluar los efectos de la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales humanas

Describimos un protocolo para establecer un modelo de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) utilizando células epiteliales de la vía aérea traqueal neonatal (nTAEC) y realizar una exposición a la hiperoxia fisiológicamente relevante para estudiar el efecto del estrés oxidativo inducido por la atmósfera en las células derivadas del epitelio de la superficie de la vía aérea neonatal en desarrollo.

El epitelio de las vías respiratorias neonatales prematuros está constantemente expuesto a factores estresantes ambientales. Uno de estos factores estresantes en los neonatos con enfermedad pulmonar es la tensión de oxígeno (_O2) superior a la atmósfera ambiente, denominada hiperoxia (>21%_O2). El efecto de la hiperoxia en las vías respiratorias depende de varios factores, incluida la etapa de desarrollo de las vías respiratorias, el grado de hiperoxia y la duración de la exposición, con exposiciones variables que pueden conducir a fenotipos únicos. Si bien se han realizado numerosas investigaciones sobre el efecto de la hiperoxia en la alveolarización pulmonar neonatal y la hiperreactividad de las vías respiratorias, se sabe poco sobre el efecto subyacente a corto y largo plazo de la hiperoxia en las células epiteliales de las vías respiratorias neonatales humanas. Una de las principales razones de esto es la escasez de un modelo in vitro eficaz para estudiar el desarrollo y la función epitelial de las vías respiratorias neonatales humanas. Aquí, describimos un método para aislar y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias traqueales neonatales humanas (nTAEC) utilizando aspirados traqueales neonatales humanos y cultivando estas células en cultivo de interfaz aire-líquido (ALI). Demostramos que los nTAEC forman una monocapa de células polarizadas maduras en el cultivo de ALI y experimentan diferenciación mucociliar. También presentamos un método para la exposición moderada a hiperoxia de la monocapa celular en cultivo de ALI utilizando una incubadora especializada. Además, describimos un ensayo para medir el estrés oxidativo celular después de la exposición a hiperoxia en cultivo de ALI utilizando cuantificación fluorescente, que confirma que la exposición moderada a la hiperoxia induce estrés oxidativo celular pero no causa daño significativo a la membrana celular o apoptosis. Este modelo puede utilizarse potencialmente para simular la exposición a la hiperoxia clínicamente relevante encontrada por las vías respiratorias neonatales en la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) y utilizarse para estudiar los efectos a corto y largo plazo del_O2 en la programación epitelial de las vías respiratorias neonatales. Los estudios que utilizan este modelo podrían utilizarse para explorar formas de mitigar la lesión oxidativa temprana en las vías respiratorias en desarrollo, que está implicada en el desarrollo de enfermedades de las vías respiratorias a largo plazo en ex bebés prematuros.

El oxígeno terapéutico (_O2) es una de las terapias más utilizadas en la unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN)¹. En consecuencia, la exposición a la hiperoxia (>21%_O2) es un factor de estrés atmosférico común que encuentran los neonatos con y sin enfermedad pulmonar significativa. Las respuestas pulmonares a la hiperoxia pueden variar dependiendo de la intensidad y/o duración de la exposición y de la localización anatómica, el tipo de célula y la etapa del desarrollo pulmonar 2,3,4,5,6. La mayor parte de la investigación en lesión pulmonar por hiperoxia neonatal se ha centrado en el efecto de la exposición a la hiperoxia en el contexto de la alveolarización postnatal en la displasia broncopulmonar modelo (DBP), la enfermedad pulmonar crónica más común que afecta a los recién nacidos prematuros 6,7,8,9,10,11. La gravedad de la displasia broncopulmonar se clasifica según la cantidad de soporte respiratorio y el_O2 necesario a las 36 semanas después de la edad menstrual^{a las 9} semanas. La mayoría de los bebés con TLP mejoran clínicamente con el tiempo a medida que los pulmones continúan creciendo, y la mayoría deja de recibir asistencia respiratoria antes de su primer cumpleaños^12,13. Independientemente de la gravedad de la TLP después del nacimiento, las morbilidades significativas que afectan a los recién nacidos prematuros incluyen un riesgo 5 veces mayor de sibilancias preescolares, asma, infecciones respiratorias recurrentes durante la infancia y enfermedad pulmonar obstructiva crónica de inicio temprano 12,14,15,16,17,18,19. El efecto de la hiperoxia sobre la enfermedad de las vías respiratorias a largo plazo y las infecciones pulmonares en recién nacidos prematuros se ha investigado utilizando modelos animales in vitro e in vivo 20,21,22,23,24. Sin embargo, la mayoría de estos modelos se centraron en el papel del tejido mesenquimatoso, el epitelio alveolar y el músculo liso de la vía aérea 25,26,27,28.

El epitelio de la superficie de las vías respiratorias recubre todo el trayecto del sistema respiratorio, extendiéndose desde la tráquea hasta el bronquiolo terminal, terminando justo antes del nivel de los alvéolos²⁹. Las células basales de la vía aérea son las células madre primarias del epitelio de la vía aérea, con la capacidad de diferenciarse en todo el repertorio de linajes epiteliales maduros de la vía aérea, que incluyen células ciliadas y secretoras (células club: no productoras de moco, y células caliciformes: productoras de moco)29,30,31,32. Los estudios de cultivos celulares en el contexto de la lesión pulmonar hiperóxica neonatal han utilizado principalmente líneas celulares de cáncer humano o de ratón^{adulto 33,34}. Además, la mayoría de los experimentos in vitro han utilizado sistemas de cultivo sumergido, que no permiten la diferenciación de las células en un epitelio mucociliar de las vías respiratorias similar al epitelio in vivo de las vías respiratorias en humanos³⁵. En consecuencia, existe un vacío en el conocimiento sobre los efectos de la lesión pulmonar inducida por hiperoxia en el desarrollo de células epiteliales de las vías respiratorias de neonatos humanos. Una de las razones es la escasez de modelos traslacionales para estudiar los efectos de la exposición atmosférica en el epitelio de las vías respiratorias neonatales humanas. La lesión pulmonar hiperóxica en una etapa temprana de la vida puede provocar una enfermedad de las vías respiratorias a largo plazo y un mayor riesgo de infección, lo que tiene consecuencias que alteran la vida de los recién nacidos prematuros 14,36,37. En los lactantes no supervivientes con DBP grave, el epitelio de la superficie de las vías respiratorias presenta anomalías distintivas, como hiperplasia de células caliciformes y trastornos del desarrollo ciliar, lo que denota un aclaramiento mucociliar anormal y un aumento de la altura epitelial que compromete el calibre de las vías respiratorias³⁸. En la última década, ha aumentado el interés en el cultivo de células epiteliales primarias de la vía aérea en la interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar el desarrollo epitelial postnatal de la vía aérea 39,40,41,42. Sin embargo, los modelos ALI de células epiteliales de las vías respiratorias neonatales no se han utilizado en el contexto de modelos de perturbación redox atmosférica, como la exposición a la hiperoxia.

Utilizando un método previamente publicado³⁹, hemos utilizado muestras de aspirado traqueal neonatal obtenidas de neonatos intubados en la UCIN y hemos aislado y expandido con éxito células epiteliales primarias de la vía aérea traqueal neonatal (nTAEC). Hemos utilizado inhibidores de Rho, Smad, glucógeno sintasa quinasa (GSK3) y señalización de diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar la capacidad de expansión y retrasar la senescencia en estas células, como se ha descrito anteriormente^39,42, lo que permite un paso eficiente y posterior de las nTAECs. El protocolo describe métodos para establecer cultivos 3D de ALI utilizando nTAEC y realizar la exposición a la hiperoxia en las monocapas de nTAEC. La inhibición de Rho y Smad se utiliza durante los primeros 7 días de cultivo de ALI (días 0 a 7 de ALI), después de lo cual estos inhibidores se eliminan de los medios de diferenciación durante el resto de la duración del cultivo de ALI. La superficie apical de la monocapa de células epiteliales de la vía aérea cultivada con ALI permanece expuesta al medio ambiente⁴³, lo que permite estudios de perturbaciones atmosféricas y se asemeja mucho a la patobiología de una vía aérea neonatal en desarrollo expuesta a la hiperoxia in vivo. La concentración de_O2 utilizada en estudios previos de cultivos celulares (independientemente de las células inmortalizadas o primarias) de la lesión pulmonar hiperóxica neonatal varía significativamente (oscilando entre el 40% y el 95%), al igual que la duración de la exposición (oscilando entre 15 min y 10 días)36,44,45,46,47. Para este estudio, la monocapa de células ALI se expuso al 60% de_O2 durante 7 días, desde el día 7 hasta el día 14 de ALI (después de la eliminación de los inhibidores de Rho/Smad de los medios de diferenciación). La exposición a la hiperoxia se realizó durante la fase temprana-media de la diferenciación mucociliar (ALI, días 7 a 14) en comparación con el epitelio maduro completamente diferenciado y, por lo tanto, simula el epitelio de las vías respiratorias en desarrollo in vivo en los recién nacidos prematuros. Esta estrategia de exposición minimiza el riesgo de toxicidad aguda por_O2 (que se espera con concentraciones más altas de_O2) mientras sigue ejerciendo estrés oxidativo dentro de un rango fisiológicamente relevante y se asemeja a la ventana crítica de transición del entorno intrauterino relativamente hipóxico a un entorno externo hiperóxico en los recién nacidos humanos prematuros.

Las muestras de aspirado traqueal neonatal se recolectaron solo después del consentimiento informado de los padres, y el protocolo utilizado para la recolección, el transporte y el almacenamiento ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (IRB 14377).

1. Preparación para el aislamiento, el paso y la cultura ALI de nTAEC

1. Preparación de los medios
   1. Medio de la vía aérea epitelial bronquial (BLEAM) con inhibidores (BLEAM-I): Prepare 500 mL (1 frasco, almacenado a 4 °C) de BLEAM agregando 1,25 mL de suplemento de HLL (500 μg/mL de albúmina sérica humana, 0,6 μM de ácido linoleico, 0,6 μg/mL de lecitina), 15 mL de L-Glutamina (6 mM), 2 mL de Extracto P (0,4%, extracto de hipófisis bovina), 5 mL de TM1 (1 μM de epinefrina, 5 μg/mL de transferrina, 10 nM de triyodotironina, 0,1 μg/mL de hidrocortisona, 5 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 5 ng/mL de insulina), 1 mL de solución antibiótica (Normocina, 0,1 mg/mL). Para prevenir la senescencia de las células primarias y mejorar la eficiencia de la expansión, agregue los siguientes inhibidores del factor de crecimiento como se describió anteriormente³⁹: Y-27632 (proteína quinasa asociada a Rho o inhibidor de ROCK) con una concentración final de 5 μM, A83-01 (inhibe la señalización de Smad) con una concentración final de 1 μM, CHIR 99021 (glucógeno sintasa quinasa-3 o inhibidor de GSK3) con una concentración final de 0,4 μM y Rapamicina (inhibidor de la diana molecular de la rapamicina o mTOR) con una concentración final concentración de 5 nM. Filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de los componentes de medios.
   2. Medio ALI de células epiteliales bronquiales/traqueales humanas (HBTEC): Prepare 500 ml de medio HBTEC descongelando el frasco a 37 °C y añadiendo 1 ml de solución antibiótica (normocina, 0,1 mg/ml). Una vez añadido, filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
   3. Medios HBTEC con inhibidores (HBTEC-I): Prepare los medios HBTEC como se indicó anteriormente. Antes de filtrar, agregue los siguientes inhibidores: Y-27632 con una concentración final de 5 μM y A83-01 con una concentración final de 0,5 μM. Filtre el medio a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
      NOTA: Guarde los soportes BLEAM-I, HBTEC y HBTEC-I a 4 °C, fechados y etiquetados, en la oscuridad (envueltos en papel de aluminio) y solo caliente las alícuotas de lo que se necesita (la vida útil es de 30 días).
   4. HEPES/FBS: Añadir 500 mL de solución salina tamponada con HEPES y 88 mL de FBS (la concentración final es del 15%). Una vez añadida, filtre la solución a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y guárdela a 4 °C, fechada y etiquetada.
      NOTA: Aliquot y caliente BLEAM, HEPES-FBS y Trypsin-EDTA a 37 °C (al menos 30 min) antes de su uso.
2. Recubrimiento de matraces de cultivo e insertos de cultivo celular ALI con un medio acondicionado 804G
   1. Prepare los medios condicionados por la matriz de células 804G (línea celular epitelial de vejiga de rata) como se describió anteriormente³⁹.
   2. Cubra el matraz de cultivo celular y los insertos de cultivo celular con medios acondicionados con 804G durante al menos 4 h en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂. Consulte la Tabla 2 para conocer las cantidades de medios necesarias para recubrir diferentes matraces de cultivo e insertos de cultivo celular.

2. Aislamiento y expansión de los nTAEC y preparación para el cultivo posterior de ALI

1. Adquiera aspirado traqueal fresco (aproximadamente 1 mL) durante la succión rutinaria del tubo endotraqueal de los neonatos intubados y recoja el aspirado en una trampa de moco. Si el volumen de aspirado es insuficiente para alcanzar el atrapón de moco, enjuague el catéter de succión con 1-3 ml de solución salina estéril.
2. Etiquete la muestra y guárdela en una bolsa de riesgo biológico con hielo.
   NOTA: Las muestras pueden almacenarse en hielo a 4 °C durante un máximo de 24 h. Sin embargo, el rendimiento es mayor con muestras frescas.
3. Transportar la muestra desde la UCIN hasta el laboratorio. Cubra un matraz T25 con medios acondicionados con 804G y prepárese para la inoculación de la muestra en el momento del transporte del aspirado traqueal al laboratorio.
4. Retire la trampa de moco de la bolsa de riesgo biológico y limpie a fondo las superficies exteriores con etanol al 70% para evitar cualquier contaminación. Abra con cuidado la tapa de la trampa de moco debajo de una campana de cultivo de células estéril.
5. Diluir la muestra de aspirado traqueal con PBS estéril a 5 mL (para diluir la mucosidad) y transferir todo el contenido a un tubo cónico de 50 mL.
6. Centrifugar el tubo a 250 x g, 20 °C-23 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante (incluida la mucosidad).
   NOTA: Todas las centrifugaciones aquí se realizan a 250 x g, 20 °C-23 °C durante 5 min, a menos que se especifique lo contrario.
7. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de BLEAM-I.
8. Retire el matraz T25 de la incubadora y deseche el medio acondicionado 804G antes de sembrar la muestra.
9. Colocar la muestra en el matraz T25 y colocarla en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ (esto se denominará Paso 0 o P0).
10. Cambie el medio con BLEAM-I 24 h después del recubrimiento para lavar las células no adheridas y, posteriormente, cada 48 h.
    NOTA: Después de procesar la muestra de aspirado traqueal e incubarla en medio BLEAM-I, aparecen células de forma cúbica 7-10 días después de la siembra. Alrededor de 3 semanas después de la siembra, las células están densamente empaquetadas y requieren tripsinización para su posterior paso, expansión y almacenamiento. Las células de paso temprano (P1 - P2) se colocan en tubos criogénicos (2,5 x 10⁶ células por 500 μL de medio de congelación por tubo criogénico) y se almacenan en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
11. Descongele rápidamente las células congeladas de nitrógeno líquido en un baño de agua a 37 °C y transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de tamaño adecuado que contenga BLEAM-I.
12. Cuente las células para determinar el número total de células vivas y células vivas utilizando una tinción de azul de tripán y un contador de células automatizado o manual como se describió anteriormente⁴⁸. Diluir la suspensión celular con un volumen adecuado de BLEAM-I, de modo que la concentración final sea de 2,1 x 10⁶ células en 15 mL de suspensión celular (para matraz T75).
    NOTA: Para un matraz T25, generalmente se usan 0.7 x 10⁶ celdas en 5 mL de suspensión de celdas para la siembra.
13. Transfiera la suspensión celular de 15 mL a un matraz T75 e incube durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂.
14. A la mañana siguiente, intercambie los medios con el nuevo BLEAM-I. A continuación, cambie los medios por un nuevo BLEAM-I cada 2 días. Una vez que las células están alrededor del 80%-90%, están listas para ser tripsinizadas para el cultivo de ALI.
15. Aplique 5 mL de tripsina-EDTA (T75) a la monocapa celular.
    NOTA: Recuerde usar tripsina fresca. Evite usar tripsina que se haya calentado varias veces.
16. Incubar el matraz a 37 °C durante 5 min en la incubadora. Luego, golpee el costado del matraz 8x-10x para desalojar las células. Revise bajo el microscopio para confirmar que las células se han desprendido después de la tripsinización. Si el >50% de las células permanecen en el matraz, lavar con PBS 2x y repetir el paso de tripsinización con un tiempo de incubación reducido de 2-3 min.
17. Detenga la reacción con 15 mL de HEPES-FBS y pipetee hacia arriba y hacia abajo 4x-5x. Transfiera las células a un tubo estéril de tamaño adecuado y centrifugue a 250 x g durante 5 minutos para granular las células.
18. Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Disuelva el pellet celular en 1 mL de BLEAM-I pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5x-10x.
19. Cuente las celdas para determinar el número total de celdas y células vivas. Diluir la suspensión celular con un volumen adecuado de BLEAM-I, de modo que la concentración final sea de 1 x 10^{5 células} vivas por cada 100 μl de suspensión celular.

3. Cultura ALI de nTAECs

NOTA: Los insertos de cultivo celular deben recubrirse con medios acondicionados con 804G e incubarse durante al menos 4 h a 37 °C, 5% de CO₂ antes del siguiente paso (ver paso 1.2).

1. Retire la(s) placa(s) de cultivo celular de 24 pocillos que contienen los insertos de cultivo celular de la incubadora y deseche los medios acondicionados con 804G.
2. Agregue 1 mL de BLEAM-I a la cámara basolateral (inferior) de cada pocillo de ALI. Añadir 100 μL de suspensión celular (1 x 10⁵ células) a la cámara apical de los insertos de cultivo celular ALI e incubar las células a 37 °C, 5% de CO₂. Esta etapa se define como ALI día -2.
3. Al día siguiente, cambie los medios en las cámaras basolateral (1 mL) y apical (100 μL) con BLEAM-I fresco. Al cambiar el medio en la cámara apical, tenga cuidado de no alterar la monocapa celular. Esta etapa se define como ALI día -1.
4. Al día siguiente, retire los medios de las cámaras basolateral y apical.
   NOTA: Las células de la membrana de cultivo celular tardan 2 días en confluente en condiciones sumergidas. En esta etapa, se puede establecer ALI.
5. Agregue 1 mL de medio HBTEC-I a la cámara basolateral, pero deje el medio de la cámara apical libre y expuesto al aire. Esta etapa se define como ALI día 0.
6. Continúe intercambiando el medio HBTEC-I (1 mL) en la cámara basolateral cada 48 h desde el día 0 hasta el día 6 de ALI. Cambie a medios HBTEC regulares (sin inhibidores) el día 7 de ALI hasta el punto de tiempo deseado de la cosecha.
   NOTA: Durante los primeros 7 días de cultivo de ALI, los medios de la cámara basolateral pueden filtrarse a la cámara apical. Este medio debe aspirarse cuidadosamente todos los días para mantener la salud de la capa celular y permitirles diferenciarse.
7. Coseche células, inserciones de cultivo celular y medios basolaterales en diferentes puntos de tiempo para técnicas moleculares, ensayos y análisis.
   1. Para este protocolo, en los días 0, 7 y 28 de ALI, se recolectan células para el análisis de expresión génica de qPCR (protocolo estándar del fabricante) de marcadores de diferenciación epitelial. En los días 0, 7, 14 y 28 de ALI, recoja insertos de cultivo celular para probar la función de barrera (métodos descritos a continuación).
   2. En los días 0 y 28 de ALI, utilice insertos de cultivo celular fijados en formol para la tinción inmunofluorescente con marcadores de diferenciación epitelial (utilizando el protocolo publicado previamente)⁴⁹. En el día 14 de ALI, recoja medios basolaterales para la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (protocolo estándar del fabricante), lisados celulares para qPCR de marcadores de estrés oxidativo e inmunotransferencia con anticuerpos contra caspasa-3 y caspasa-3 escindida (protocolo estándar del fabricante), e insertos de cultivo celular para el ensayo de estrés oxidativo (método descrito a continuación).

4. Prueba de la función de barrera durante la diferenciación de ALI

1. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)
   NOTA: Mida el TEER utilizando un voltímetro epitelial / ohmio (EVOM) durante la diferenciación de ALI para evaluar la integridad de la capa celular⁵⁰.
   1. Antes de medir los valores de resistencia del filtro de prueba, utilice un cultivo celular recubierto de medio acondicionado a 804G (desprovisto de células) para medir el valor de resistencia de fondo en ohmios (Ω)
   2. Reste el valor de resistencia de fondo de los valores de resistencia del filtro de prueba y multiplique la diferencia por el área de superficie de crecimiento de la celda para obtener el valor de TEER para cada filtro de prueba.
      TEER = (Ω_T - Ω_B) X C
      TEER = Resistencia eléctrica transepitelial (Ω.cm²)
      Ω_T = Valor de resistencia del filtro de prueba (Ω)
      Ω_B = Valor de resistencia de fondo (Ω)
      C = Área de superficie de crecimiento celular (cm²)
      NOTA: Los insertos de cultivo celular utilizados para las mediciones de TEER se fijan posteriormente con formalina tamponada al 10% y se utilizan inmediatamente para la tinción inmunofluorescente y la microscopía fluorescente (método descrito a continuación) o se almacenan a 4 °C para la tinción posterior.
2. Ensayo de permeabilidad epitelial de isetionato de fluoresceína dextrano (FITC-dextrano)
   NOTA: El ensayo de permeabilidad epitelial se realizó utilizando dos pesos moleculares diferentes de FITC-dextrano (10 kD y 20 kD) durante la diferenciación de ALI.
   1. Prepare la solución de trabajo de FITC-dextrano (1 mg/mL): mida 5 mg de FITC y mezcle 1 mL de DMSO (5 mg/mL). Vuelva a suspender el caldo de 5 mg/mL en medios HBTEC calentados a 37 °C hasta una concentración de 1 mg/mL. Proteja la solución de la luz.
   2. Transfiera los filtros de prueba (que contienen celdas) a una nueva placa de 12 pocillos y agregue 1 ml de medio HBTEC en el compartimento basolateral.
   3. Aspire los medios del compartimento apical (si los hay) y reemplácelos con 250 μL de solución de trabajo de FITC-dextrano. Incubar a temperatura ambiente protegido de la luz durante 60 min.
   4. Finalice el ensayo de FITC-dextrano retirando los filtros de prueba (que contienen solución de trabajo de FITC-dextrano) de la placa de 12 pocillos.
   5. Recoja los medios basolaterales de la placa de 12 pocillos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y vórtice.
   6. Transfiera 100 μL de alícuotas de cada tubo a una microplaca de poliestireno negro de fondo transparente de 96 pocillos por triplicado. Transfiera 100 μL de medios HBTEC a pocillos adicionales en la placa de 96 pocillos como control negativo para medir la fluorescencia de fondo.
   7. Mida la intensidad de la fluorescencia utilizando un espectrofotómetro con una excitación de 490 nm y máximos de emisión de 520 nm.
   8. Reste el valor promedio de fluorescencia de fondo de los valores de fluorescencia del filtro de prueba para obtener la fluorescencia corregida y exprese los valores como un porcentaje frente a los valores de fluorescencia corregidos en el día 0 de ALI para FITC 10 kD y 20 kD.

5. Exposición a la hiperoxia con la incubadora TriGas

1. En el día 7 de ALI, determine el número de insertos de cultivo celular que se pondrán en hiperoxia en función de las necesidades experimentales y de cosecha.
2. Ajuste el nivel de O₂ en la incubadora TriGas al 60% de O₂. Por lo general, se necesitan ~ 30-45 minutos para que el nivel de O₂ alcance el 60%.
3. Una vez que el nivel de_O2 se estabilice en el 60%, coloque la placa de cultivo celular de 24 pocillos con los insertos de cultivo celular asignados al grupo de hiperoxia dentro de la incubadora y cierre la puerta de la incubadora.
   NOTA: Este paso debe realizarse de la manera más eficiente posible para evitar una caída significativa en el nivel de_O2 dentro de la incubadora.
4. Cambie los medios en los insertos de cultivo celular expuestos a hiperoxia siguiendo el mismo programa que los pocillos de control (21% de O₂ expuestos). Revise los insertos de cultivo celular todos los días para ver si hay fugas de medios y aspire suavemente cualquier fuga en la cámara de cultivo celular.
5. Continúe la exposición a la hiperoxia durante 7 días (días 7 a 14 de ALI). Una vez completada la exposición a la hiperoxia, recolecte células o realice ensayos utilizando insertos de cultivo celular el día 14 de ALI.

6. Ensayo de estrés oxidativo para evaluar los efectos de la hiperoxia

NOTA: Utilizamos el kit de ensayo CM-H2DCFDA y medimos la intensidad de fluorescencia en el día 14 de ALI como marcador de estrés oxidativo en insertos de cultivo celular después de la exposición a_O2 . H₂DCFDA es una forma químicamente reducida y acetilada de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) que es un indicador de células vivas de especies reactivas de oxígeno (ROS). CM-H₂DCFDA es el derivado clorometilo reactivo al tiol de H₂DCFDA, que promueve una mayor unión covalente a los componentes intracelulares, lo que permite una retención más prolongada del colorante dentro de la célula. Estas moléculas son no fluorescentes hasta que los grupos acetato son eliminados por la acción de las esterasas intracelulares, y se produce la oxidación en la célula⁵¹. Después de la oxidación intracelular, el aumento resultante de la fluorescencia se puede medir con un microscopio fluorescente como medida sustitutiva del estrés oxidativo celular⁵². El reactivo es ligero y sensible al aire, por lo que debe protegerse de la luz y mantenerse hermético en la medida de lo posible.

1. Preparación de la solución de ensayo CM-H2DCFDA: Cada vial contiene 50 μg de colorante reactivo en forma de polvo. Para hacer una solución madre de 1 mM, agregue 80 μL de DMSO estéril al vial, mezcle bien con una pipeta y haga un vórtice suave. Para una concentración final de 1 μM del colorante en insertos de cultivo celular, agregue 0,1 μL del stock de 1 mM por 100 μL de PBS (por ejemplo, agregue 0,6 μL de solución madre a 600 μL de PBS para 6 insertos de cultivo celular).
   NOTA: La concentración final del colorante puede variar entre 1-5 μM. La dosis debe optimizarse para cada condición de cultivo.
2. Añadir 100 μL de la solución de colorante de 1 μM en cada cultivo celular para el grupo expuesto a la hiperoxia o al grupo expuesto a la normoxia. Utilizar al menos 1 cultivo celular como control negativo de cada grupo de tratamiento (100 μL de PBS sin colorante). Incubar a 37 °C durante 30 min, protegido de la luz. Lavar 1 vez con PBS.
3. Preparación del portaobjetos: Drene el exceso de PBS. Sostenga con cuidado los insertos de cultivo celular y use una cuchilla para cortar lentamente la membrana del cultivo celular. Vierta 1-2 gotas de líquido de montaje en el portaobjetos. Con pinzas de punta plana, sujete con cuidado la esquina de la membrana, colóquela con el lado de la celda hacia abajo sobre el montador y cúbrala con un cubreobjetos. Retire el exceso de líquido de montaje y deje secar al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Las diapositivas ya están listas para ser fotografiadas.
   NOTA: La preparación del portaobjetos y la microscopía fluorescente debe realizarse lo más rápido posible, ya que la intensidad fluorescente se desvanece significativamente en 2-3 h.
4. Microscopía fluorescente: Captura de imágenes utilizando un microscopio fluorescente utilizando el canal Cy2 (cianina-2). Capture imágenes de tres áreas separadas que no se superponen por cultivo celular.
5. Detección fluorescente de estrés oxidativo
   NOTA: Utilice las imágenes de la microscopía fluorescente para medir la fluorescencia total de células corregida (CTCF) utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) y el flujo de trabajo que se describe a continuación. CTCF sirve como marcador del estrés oxidativo en los insertos de cultivo celular después de la exposición a la hiperoxia y se mide eliminando la fluorescencia de fondo con la ayuda del software ImageJ.
   1. Abra la imagen de microscopía en ImageJ y seleccione el área de interés con la herramienta de rectángulo. Guarde el área de selección (α) haciendo clic con el botón derecho y seleccione Agregar al administrador de ROI (región de interés). Utilice esta área de selección en todas las imágenes.
   2. Seleccione los parámetros para la medición en Analizar > Establecer mediciones y seleccione Área, Densidad integrada y Valor medio de gris dentro de la pestaña de configuración.
   3. Para cada imagen, utilice la misma área de selección del administrador de ROI y seleccione Analizar > medir. El valor de densidad integrado representa la fluorescencia total (F_t) del área seleccionada. Anote los valores de medición en la ventana emergente.
   4. Para corregir la fluorescencia de fondo (F_b) en cada imagen, seleccione una pequeña área de región no fluorescente con la herramienta rectángulo. Seleccione Analizar > medir para esta región. El valor medio de la intensidad representa F_b. Anote los valores de medición en la ventana emergente.
   5. Calcule el CTCF multiplicando la intensidad de fluorescencia media de las lecturas de fondo por el área total del ROI y restando este número del valor de densidad integrado del ROI. Repita este flujo de trabajo para todas las imágenes de ambos grupos de tratamiento (control e hiperoxia).
      CTCF = F_t - (F_b x α)
      CTCF = Fluorescencia de célula total corregida (U.A.)
      F_t = Fluorescencia total
      F_b = Fluorescencia de fondo
      α = Área de selección

Para aislar los nTAEC, recolectamos aspirados traqueales de neonatos intubados en la UCIN y transportamos los aspirados en hielo al laboratorio para su posterior procesamiento (Figura 1A). Después de sembrar las muestras de aspirado traqueal en un medio de crecimiento epitelial de las vías respiratorias (BLEAM-I que contiene inhibidores de Rho/Smad, GSK3 y mTOR), aparecieron células cuboidales en un plazo de 7 a 10 días.

El protocolo aquí descrito detalla un método para la recolección y procesamiento de muestras de aspirado traqueal neonatal de neonatos intubados en la UCIN, con el posterior aislamiento y expansión de nTAEC vivos a partir de estas muestras utilizando métodos previamente establecidos³⁹. Además, hemos descrito un método para cultivar nTAECs en ALI y caracterizar su diferenciación en un epitelio de la vía aérea mucociliar polarizado en función del tiempo m...

Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses que informar.

Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de la Fundación Presbiteriana de Salud (PHF) y Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 con un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA) de NIGMS) a AG. Nos gustaría agradecer al Dr. Paul LeRou y al Dr. Xingbin Ai del Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, Massachusetts, por proporcionar células de donantes neonatales utilizadas en algunos de los experimentos. Las figuras fueron creadas con Biorender. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism.