Retinitis Pigmentosa'yı Modellemek için İnsan Hasta iPSC'den Türetilmiş Retinal Organoidlerin Üretilmesi

Bu protokolde retinitis pigmentosa hastasının indüklediği pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı 3 boyutlu retinal organoidler üretildi. Bu organoidler, retinitis pigmentosa hastalığının bazı klinik fenotiplerini başarılı bir şekilde özetledi.

Retinitis pigmentosa (RP), dünya çapında yaklaşık 1/4.000 kişi prevalansı ile nadir görülen ve kalıtsal bir retinal dejeneratif hastalıktır. RP hastalarının çoğunda periferik görme kaybı, gece körlüğü ve son olarak tam körlüğe yol açan ilerleyici fotoreseptör dejenerasyonu vardır. Bugüne kadar 90'dan fazla gende binlerce mutasyonun RP ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Şu anda, etkilenen tüm genler ve farklı mutasyon türleri için az sayıda hayvan modeli mevcuttur, bu da gen / mutasyon patolojisinin altında yatan mekanizmaların deşifre edilmesini büyük ölçüde engellemekte ve tedavi ve ilaç geliştirmeyi sınırlamaktadır. Hasta kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı 3D retinal organoidler (RO'lar), insanın erken başlangıçlı hastalığını modellemek için hücrelerden ve hayvanlardan daha iyi bir sistem sağlamıştır. RP'yi incelemek için, RP'nin klinik fenotiplerini özetlemek için hastadan türetilen 3D retinal organoidler kullanıldı. RP hasta kaynaklı RO'larda Rhodopsin yanlış lokalizasyonu belirgin bir şekilde gösterildi. Diğer hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, hasta iPSC'den türetilen retinal organoid modeller RP özelliklerini daha yakından özetlemiştir ve hastalık patogenezini araştırmak ve ilaç geliştirmek için ideal bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Retinitis pigmentosa ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi insan retina hastalıkları, uygun deneysel modellerin olmaması nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır ^1,2. Fare retinası insan retinasına çok benzemesine ve retina dejenerasyonunun etiyolojisini incelemek için güçlü bir araç olmasına rağmen, fareler ve insanlar arasında büyük tür farklılıkları vardır ^3,4. Örneğin, farelerde ve insanlarda fotoreseptör hücrelerinin nükleer mimarisi farklıdır ve fare retinası bir makulaya sahip değildir ^5,6. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, transkripsiyon faktörleri ve/veya bileşiklerin^{kombinasyonları} yoluyla "yeniden programlama" süreçleri yoluyla organizmaların özelleşmiş hücrelerini ilk pluripotent duruma döndürmemizi sağlar 7,8,9,10. Bu iPSC'ler neredeyse sınırsız bölünme ve çoğalma kabiliyetine sahiptir ve çeşitli hücre tiplerine dönüşebilir. Son zamanlarda, insan retina gelişiminin erken olaylarını modellemek ve insan retina hastalıklarının patofizyolojisini tanımlamak için iPSC'den türetilmiş 3D retinal organoidler geliştirilmiştir 11,12,13,14,15. Retinal organoidlerin birçok avantajı vardır: (1) in vivo retinal gelişimi ve hastalık patogenezini özetlemek için kullanılabilirler; (2) yüksek verimli ilaç taraması ve gen terapisinin klinik öncesi denemeleri için kullanılabilirler; ve (3) retinal dejeneratif hastalıklar için tedavi seçeneklerinin klinik öncesi değerlendirmeleri olarak kullanılabilirler^16,17.

Bu projenin amaçlarından biri, aşırı heterojenliği nedeniyle tedavi edilemeyen bir hastalık olan retinal pigmentoza (RP) patogenezini incelemekti¹⁸. Bugüne kadar, 90'dan fazla genin RP^19,20 ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. RP^15'in en yaygın nedensel genlerinden biri olarak kabul edilen RPGR geni, tüm RP ^4,21,22'nin yaklaşık %16'sını oluşturur. RPGR geninde bir çerçeve kayması mutasyonu taşıyan iPSC'ler başarılı bir şekilde oluşturulmuş ve organize ve tabakalı 3D retinal organoidlere farklılaştırılmıştır¹⁴. Bu organoidler kullanılarak anormal fotoreseptör tabakası morfolojisi ve fotoreseptörlerde opsinlerin dislokasyonu gözlendi.

Toplamda, hastadan türetilen 3D retinal organoidlerin nasıl oluşturulacağına ilişkin adım adım ve ulaşılabilir bir protokol burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır^23,24. Bu organoidler, hastalığın bazı klinik fenotiplerini başarılı bir şekilde özetledi. Bu, terapötik tarama için retina gelişimi ve hastalık mekanizmalarını incelemek ve gelecekteki klinik öncesi gen tedavisini değerlendirmek için cesaret verici bir model sağlar.

Protokol, Capital Medical University'nin insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Hücre kültürü ve iPSC'lerin üretilmesi

1. Bu çalışma için RPGR hastalarını seçin. Çalışmaya biri ailesel taşıyıcılık ve üçü sağlıklı kontrol olmak üzere toplam üç hasta kullanıldı. Hasta 1'de RPGR geninin ekzon 14'ünde c.1685_1686delAT bir mutasyon vardı, hasta 2'de RPGR geninin ekzon 15'inde bir mutasyon c.2234_2235delGA ve hasta 3'te RPGR geninin ekzon 15'inde bir mutasyon c.2403_2404delAG vardı. Kontrol olarak üç sağlıklı gönüllü seçin¹⁴. Venipunktur ile hastalardan ve sağlıklı kontrollerden periferik tam kan örnekleri toplayın ve bunları kan alma tüplerine koyun (Materyal Tablosu).
2. Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) yoğunluk gradyan ortamı²⁵ ile yoğunluk gradyan santrifüjleme ile izole edin. Bir Petri kabında 8 mL büyüme geliştirme ortamında sitokin ile aktive edilen CD34 ⁺ PBMC'leri genişletin (Tablo 1).
3. 1 hafta sonra, CD34 pozitif periferik kan mononükleer hücrelerini bir transfeksiyon sistemi (Malzeme Tablosu) ile elektropoze edin ve herhangi bir değişiklik yapmadan CD34 pozitif hücreleri ve dahili T-01 Programını seçin. İnsan OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-MYC ve KLF4 proteinlerini üretebilen bir yeniden programlama plazmitleri (2 μg) kokteylini transfekte edin.
4. Transfekte edilmiş hücreleri, B-27 (1x), N-2 (1x), PD0325901 (0.5 μM), bFGF (100 ng / mL), CHIR99021 (3 μM), HA-100 (10 μM), A-83-01 (0.5 μM) ve hLIF (1000 U / mL) ile desteklenmiş 2 mL DMEM / F12 içinde vitronektin insan rekombinant protein kaplı altı oyuklu plakalarda tohumlayın iPSC'lerin büyümesini sürdürmek için.
5. Transdüksiyondan 3 hafta sonra, iPSC kolonilerini manuel olarak toplayın, daha sonra bunları altı oyuklu plakalara aktarın ve genişleme için reaktif B'de (Malzeme Tablosu) tutun.
   NOT: Altı oyuklu plakalar vitronektin insan rekombinant proteini ile kaplanmalıdır. 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için DPBS içinde vitronektin çözeltisini seyreltin. Seyreltilmiş vitronektini doku kültürü ile muamele edilmiş altı oyuklu plakalara ekleyin. Vitronektin çözeltisini altı oyuklu plakaların yüzeyine eşit olarak yaymak için kültür kabını döndürün. Plakaları 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin.
6. iPSC'ler yaklaşık% 80 -% 90 birleşmeye ulaştığında hücrelerin 0,5 mM EDTA ile ayrıldığından ve bölünme oranının 1: 8 veya 1: 10 olduğundan emin olun. Geçiş gününde, reaktif B'ye blebbistatin (2.5 μM) ekleyin (Tablo 1).
   NOT: Blebbistatin, hücre adezyonunu ve kök hücre canlılığını arttırmak ve kök hücre apoptozunu önlemek için kullanılmıştır. 18 saat sonra, ortam reaktif B ile yenilenmelidir.

2. İnsan RO'larının üretilmesi

NOT: iPSC'ler yaklaşık %80-90 birleşime ulaştığında iPSC'ler ayrılmalıdır.

1. 5 dakika boyunca 37 ◦ C'de 0,5 mM EDTA kullanarak insan iPSC (hiPSC) kolonilerini ayırın.
2. Nazik pipetleme ile hiPSC kümelerini tek hücrelere ayırın. Bakım için hücreleri sayın ve bunları reaktif B'de büyütün (Tablo 1).
3. 0. günde, 100 μL farklılaşma ortamında hücre yeniden toplanması için 96 V tabanlı konik kuyuda 12.000 hücre / kuyu tohumlayın (Tablo 1).
4. 6. günde, hücre kültürü ortamını dikkatlice aspire edin ve 20 μM Y 27632 ve 1.5 nM (55 ng / mL) hBMP4 içeren 100 μL farklılaşma ortamı ekleyin.
5. 9. günde, hBMP4 konsantrasyonunu yaklaşık 0.75 nM'de tutmak için farklılaşma ortamının yarısını değiştirin.
6. Her oyuktan 60 μL diferansiyasyon ortamı aspire edin ve her oyuğa 20 μM Y-27632 içeren 60 μL taze diferansiyasyon ortamı ekleyin.
7. 12. günde, 0.375 nM hBMP4 elde etmek için farklılaşma ortamının yarısını yeni farklılaşma ortamıyla değiştirin.
8. 18. günde, agregaları 10 mL uçlu yeni bir Petri kabına aktarın ve daha fazla organoid oluşturmak için her agregayı ters mikroskop altında mikrocerrahi bir bıçakla 2-4 parçaya bölün.
9. Aynı gruptaki agregaları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Agregalar tüplerin dibine çöktüğünde, süpernatanı aspire edin.
10. Agregaları 1 mL nöral retina ortamı (DMEM/F12, %10 fetal sığır serumu, %1 N-2 takviyesi, 0.5 μM retinoik asit, 0.1 mM taurin, %1 penisilin-streptomisin) ile yeniden süspanse edin ve içinde 15 mL nöral retina ortamı bulunan yapışmaz Petri kaplarına aktarın. Bir Petri kabına 10-15 retinal organoid koyun.
11. Kültür ortamını her 5 günde bir yenileyin. Retinoik asit ışığa duyarlı olduğu için kültürü karanlıkta tutun (Şekil 1) ve kendi kendini organize eden insan retina dokusunun oluşumunu ters mikroskopla kontrol edin 26,27,28,29.

3. Retinal organoidlerin analizi

1. HiPSC'den türetilen 3D retinanın immünofloresan boyaması
   1. 3D retinayı DPBS'de 1 mL taze% 4 paraformaldehit içinde 20 ° C'de 20 dakika sabitleyin. Ardından, organoidleri 1 mL DPBS tamponu ile durulayın.
   2. 0.5 g agaroz (Malzeme Tablosu) ölçün ve agaroz tozunu mikrodalgaya uygun bir şişede 100 mL DPBS ile karıştırın. Agarozu tamamen eriyene kadar 1-3 dakika çözmek için bir mikrodalga kullanın. Agaroz çözeltisini yaklaşık 40 °C'ye kadar soğumaya bırakın.
   3. Bunları DPBS'ye% 2 oranında yerleştirin.
   4. Numuneleri bir vibratom kullanarak 50 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Dilimlenmiş bölümleri yapışma mikroskobu slaytlarına (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.
   5. Dilimleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika çözdürün.
   6. Dilimleri DPBS ile 5 dakika yıkayın ve 3 kez tekrarlayın.
   7. Dilimleri RT'de 15 dakika boyunca geçirgen hale getirmek için DPBS çözeltisinde% 0,5 Triton X-100 kullanın.
   8. Geçirgenleştirme solüsyonunu çıkarın, dilimleri DPBS ile 5 dakika yıkayın ve 3 kez tekrarlayın.
   9. Dilimleri DPBS'de% 1 BSA ve% 0.5 Triton X-100 ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
   10. Dilimleri% 1 BSA ve% 0.1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş anti-Rodopsin antikoru (1:1000) ve anti-L / M opsin antikoru (1:1000) ile 4 ° C'de 16 saat boyunca inkübe edin.
   11. Dilimleri DPBS ile 5 dakika yıkayın ve 3 kez tekrarlayın.
   12. Dilimleri, RT'de 1 saat boyunca% 1 BSA ve% 0.1 Triton X-100 içinde seyreltilmiş eşek anti-fare ve tavşan ikincil antikoru (1:500) ile inkübe edin.
   13. Nükleer boyama için RT'de 15 dakika boyunca DPBS'ye 30 nM 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin.
   14. Dilimleri DPBS ile 5 dakika yıkayın ve 5 kez tekrarlayın.
   15. Dilimleri gömme ortamı (Malzeme Tablosu) ile birleştirin ve slaytları kapatın (Malzeme Tablosu). Karanlık bir kutuda saklayın ve 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
2. RNA ekstraksiyonu ve RNA dizilimi
   1. Her kontrolden ve hastadan aynı farklılaşma zaman noktalarında (0. gün, 47. gün, 91. gün, 121. gün ve 151. gün) türetilen 1-3 (boyutlara göre) 3D retinayı 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifinde toplayın (Malzeme Tablosu) buz üzerinde.
   2. Numuneleri bozmak için homojenizatörü (Malzeme Tablosu) 1 dk AÇIK, 30 s KAPALI, üç döngü boyunca kullanın ve numunede bozulma olup olmadığını kontrol edin.
   3. Numuneler tamamen homojen hale geldiğinde homojenizasyonu durdurun ve tüpü 30 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın.
   4. Numuneleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
   5. Numuneleri 4 ° C'de 15 dakika boyunca 13.800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 2 mL RNaz içermeyen tüpe aktarın.
   6. Tüpe, girdaba ve santrifüje 0.4 mL kloroform ekleyin, 13.800 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
   7. Renksiz üst fazın bir kısmını (yaklaşık 2 / 3) dikkatlice yeni bir RNaz içermeyen tüpe aktarın. DNA içeren beyaz arayüzü aspire etmeyin veya bozmayın.
   8. 0,5 mL soğuk izopropanol ekleyin, 30 saniye girdap yapın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 13.800 x g'da santrifüjleyin. Tüp tabanının yan tarafında bir pelet oluşur.
   9. Süpernatanı bir pipet ucuyla dikkatlice aspire edin ve peleti saklayın.
      NOT: RNA peleti jöle benzerindedir ve saflık çok yüksek olduğunda şeffaftır.
   10. 1 mL soğuk %70 etanol ekleyin, numuneleri 30 saniye kuvvetlice girdaplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 13.800 x g'da santrifüjleyin.
   11. Süpernatanı bir pipet ucuyla dikkatlice aspire edin ve peleti davlumbazda RT'de 5-10 dakika havayla kurutun. Peleti fazla kurutmayın.
   12. 20-50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice yeniden süspanse edin.
   13. Bir spektrofotometreye 1 μL RNA uygulayın (Malzeme Tablosu). Illumina kütüphanesi hazırlığı 30 için sırasıyla kontrollerden ve hastalardan toplam yaklaşık¹⁰ μg RNA kullanıldı.
   14. RNA'yı -80 °C'de saklayın.

Şematik çizim, sağlıklı ve hasta iPSC'den türetilmiş retinal organoidler oluşturmak için farklılaşma prosedürlerini açıklar (Şekil 1). iPSC'den RO'lara kadar, çeşitli faktörlere bağlı olarak varyasyonlar üretilebilir. iPSC'nin durumu, RO üretiminin belirleyici adımıdır. Ek olarak, tüm deneylerin izlenebilir olması için araştırmacıların tüm ortamların her adımını, kataloğunu ve lot numarasını kaydetmeleri şiddetle tavs...

Retinal organoidler, hiPSC'lerden veya embriyonik kök hücrelerden (ESC'ler) türetilen 3 boyutlu, lamine yapılardır ve insan retinal gelişiminin uzamsal ve zamansal modellerini taklit etmek için çok umut verici bir model olarak öne çıkar^31,32. RO'lar, fotoreseptörler, bipolar hücreler, ganglion hücreleri, amakrin hücreleri, yatay hücreler ve Müller glia³³ dahil olmak üzere çeşitli retina...

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmez.

M.S. Yan-ping Li ve Zhuo-lin Liu'ya teknik destekleri ve el yazması ile ilgili yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Pekin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014, 82125007) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmiştir.